방법 논문

Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis를 사용한 설치류의 알코올 소비 모델링

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⸱

DOI:

10.3791/67486

⸱

2024년 11월 8일

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 쥐의 알코올 소비를 모델링하기 위한 표준 간헐적 접근 2병 선택 가정용 케이지 음주 패러다임을 설명합니다. 또한 음주 행동의 미세 구조 분석을 가능하게 하는 DIY 핥기 감지 시스템으로 표준 프로토콜을 강화하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

초록

2병 선택 가정용 케이지 음주는 설치류의 에탄올 소비를 연구하는 데 가장 널리 사용되는 패러다임 중 하나입니다. 가장 간단한 형태의 경우, 동물들은 두 개의 음료수 병을 이용할 수 있는데, 그 중 하나에는 일반 수돗물이, 다른 하나는 에탄올이 들어 있으며, 24시간 동안 젖병 무게의 변화로 측정되는 일일 섭취량을 측정합니다. 따라서 이 접근 방식에는 특수 실험실 장비가 필요하지 않습니다. 이러한 구현의 용이성은 전임상 알코올 연구자들이 널리 채택하는 데 가장 큰 기여를 한 것으로 보이지만, 이 접근 방식을 사용하여 얻은 음주 데이터의 해상도는 연구자가 병 무게를 측정하는 횟수(예: 하루에 한 번)에 의해 제한됩니다. 그러나 전체 섭취량, 약리학적 개입 및 신경 조작의 맥락에서 음주 패턴을 조사하려는 욕구는 개별 핥기 수준에서 데이터를 수집할 수 있는 가정용 케이지 핥기 감지 시스템의 개발을 촉발했습니다. 최근에는 이러한 시스템이 다수 개발되고 있지만, 오픈 소스 시스템인 LIQ HD(Lick Instance Quantifier Home cage Device)는 경제성과 사용자 친화성으로 이 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 흥미롭긴 하지만 이 시스템은 마우스에 사용하도록 설계되었습니다. 여기에서는 표준 및 리코미터가 장착된 2병 선택 가정용 케이지 음주에 대한 적절한 절차를 검토합니다. 또한 더 큰 케이지 크기를 수용하기 위한 하드웨어 수정과 표준 기성품 음료수 병과 호환되는 재설계된 3D 프린팅 병 홀더를 포함하여 LIQ HD 시스템을 쥐에 적용하는 방법을 소개합니다. 이 접근 방식을 사용하여 연구원들은 많은 쥐의 섭취 수준 외에도 일일 음주 패턴을 조사할 수 있으므로 추가 자원에 대한 최소한의 투자로 획득한 데이터의 해상도를 높일 수 있습니다. 이러한 방법은 연구자들에게 정확한 실험적 필요에 따라 표준 병 또는 리코미터가 장착된 장치를 사용하여 알코올 음주의 기저에 있는 신경생물학적 메커니즘을 조사할 수 있는 유연성을 제공합니다.

서론

역사적으로 적당한 알코올 사용은 적당한 건강상의 이점과 관련이 있었지만, 최근의 대규모 종합 연구에 따르면 알코올 섭취량은 안전하지 않습니다1,2. 실제로, 알코올 사용은 전 세계적으로 사망 및 장애의 7번째 주요 위험 요소입니다1 소량의 알코올을 마시는 개인은 암, 전염병 및 부상에 대한 위험이 증가합니다.<-sup class="xref">1,3. 미국에서는 2016년에서 2021년 사이에 알코올 사용으로 인한 사망이 거의 30% 증가했습니다4. 중요한 것은 소비가 증가함에 따라 사망 및 장애의 위험이 단조롭게 증가한다는 것입니다1.

인간을 대상으로 한 연구가 알코올 사용 및 오용의 신경 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만, 동물 모델이 제공하는 실험적 통제는 음주 행동과 과음의 위험에 대한 기저에 있는 메커니즘을 심층적으로 이해하는 데 중요합니다. 이러한 모델은 또한 통제되지 않은 소비를 줄이는 것을 목표로 하는 치료법 개발을 위한 귀중한 도구입니다. 2병 선택 가정용 케이지 음주는 설치류의 알코올 섭취를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 전임상 패러다임 중 하나입니다. 이는 주로 전문 연구 장비나 복잡한 분석 없이 총 자발적 음주 및 선호도를 측정할 수 있기 때문에 구현이 용이하기 때문입니다. 이 접근 방식을 사용하여 연구원들은 음주 세션의 시작부터 끝까지 병 무게의 변화를 계산하여 원하는 간격(예: 시간, 일, 주)으로 측정값을 수집할 수 있습니다. 이 기본 방법의 변형은 단기 및 장기간에 걸쳐 낮거나 중간 정도의 알코올 섭취를 촉진하기 위해 이 분야의 많은 사람들에 의해 사용되었습니다. 예를 들어, mice5 및 rats6,7,8 모두에서 각각 낮고 중간 수준의 알코올 섭취를 촉진하기 위해 연속 및 간헐적 2병 선택 절차가 사용되었습니다. 동일한 패러다임은 알코올을 선호하는 균주에서 높은 수준의 섭취를 촉진할 수 있습니다7,9. 대안적으로, 암흑 주기가 시작된 후 약 3시간 후부터 매일 2-4시간으로 알코올 접근을 제한하는 이 방법의 적응은 마우스에서 폭음(즉, 어둠 속에서 음주)을 유발하는 것으로 나타났습니다(즉, 어둠 속에서 음주)10,11. 이러한 방법의 추가 변형은 금단 기간 동안 자발적 알코올 음주의 증가를 조사하기 위해 알코올 의존(즉, 만성적인 간헐적 에탄올 증기 노출)을 촉진하는 방법과 함께 사용되었습니다.12,13,14,15,16,17,18,19입니다.

이 분야에서 널리 채택되고 있지만, 병 무게의 변화로 알코올 섭취량을 측정하는 표준 접근 방식은 음주 세션당 총 소비량으로 해상도가 제한되어 있습니다. 결과적으로 이 접근 방식은 알코올 사용 장애(AUD)의 위험과 심각도에 모두 영향을 미치는 것으로 잘 알려진 음주 패턴을 포착할 수 없습니다20,21,22. 실제로, 시간 경과에 따른 개인의 평균 섭취량은 여러 번의 과음 에피소드 또는 상대적으로 낮은 소비와 관련된 많은 음주 에피소드의 결과일 수 있으며, 이러한 뉘앙스는 음주 세션당 총 섭취량으로 소비량을 측정할 때 감지되지 않습니다. 중요한 것은, 건강한 대조군에 비해 AUD를 가진 개인에서 대규모 음주(즉, 꿀꺽꿀꺽)와 관련된 훨씬 더 많은 음주 에피소드가 관찰된다는 것입니다23 그리고 비인간 영장류의 데이터에 따르면 음주 이력 초기에 많은 음주를 포함하는 음주 패턴을 확립한 개인은 AUD22에 걸릴 위험이 높습니다. 더욱이, 과다 섭취를 포함하는 음주 에피소드는 AUD 진단과 무관하게 이환율 및 사망률 위험을 유의하게 증가시킵니다21. 전체적으로 이러한 데이터는 전임상 모델의 전체 섭취량 수준 외에도 음주 패턴을 조사하는 데 대한 관심을 증가시켰으며, 개별 핥기 수준에서 음주 데이터를 캡처할 수 있는 다양한 복잡성의 여러 시스템 개발을 촉진했습니다.

첫 번째 방법 중 하나는 마우스에서 사용하도록 설계된 광빔 핥기 감지 기능이 장착된 2병 시스템의 개발이었습니다24. 이 시스템은 이후에 rats25에서 사용하기 위해 별도의 그룹에 의해 조정되었습니다. 그 후 몇 년 동안 이 테마에 대한 변형을 사용하여 맞춤형 설치류 하우징26에 포함된 유사한 시스템을 개발하여 사회적으로 수용된 개별 동물의 핥기 감지를 허용27,28 및 먹이 및 마시는 행동을 모두 캡처합니다29. 이 중 LIQ HD(Lick Instance Quantifier Home cage Device)30은 Godnyuck 등이 개발한 시스템의 구현 용이성 및 경제성과 유사한 마우스용 시스템을 제공한다는 점에서 상당한 주목을 받고 있습니다.24. 이 시스템은 정전식 감지를 사용하여 텅(tongue)과 전도성 금속 사이퍼 튜브 사이의 접촉을 직접 감지하며, 이는 광빔 감지 시스템을 사용하여 제공되는 시퍼 접근 또는 상호 작용과 같은 간접적인 조치와 대조적입니다. 저자는 정전식 감지 시스템이 핥기 감지에서 훨씬 더 높은 정밀도와 감도를 제공하여 광빔 감지보다 핥기 수와 병 무게 변화 사이에 더 강력한 상관 관계를 생성한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 저자는 또한 이 시스템을 연속 액세스, 2병 선택 가정용 케이지 음주 패러다임과 함께 사용하여 전체 일일 섭취량 측정 외에도 알코올 음주 미세구조 측정을 캡처할 수 있는 능력을 보여줍니다30.

여기에서는 표준 접근 방식을 사용하여 두 병을 선택한 가정용 케이지 알코올 음주에 대한 절차와 핥기 감지를 가능하게 하는 방법을 설명합니다(그림 1). 또한 쥐에 사용하기 위해 LIQ HD30을 개조한 LIQ HDR을 구축하고 구현하는 방법을 소개하며, 여기에는 더 큰 케이지 크기를 수용하기 위한 하드웨어 수정과 표준 기성품 병과 호환되는 재설계된 3D 프린팅 병 홀더가 포함됩니다. 이러한 방법은 연구자에게 실험 리소스 및 데이터 수집 요구 사항에 따라 표준 또는 lickometer가 장착된 접근 방식을 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다.

다음은 Simms et al.7. 이 절차에서 쥐는 일주일에 7일 동안 두 개의 음료수 병에 24시간 접근할 수 있습니다. 월요일, 수요일, 금요일(MWF)에 쥐는 물(H2O)이 들어 있는 한 병과 에탄올(EtOH)이 들어 있는 다른 병을 받습니다. 이 병은 화요일, 목요일, 토요일(TRS)에 제거되고 두 병의 물로 교체됩니다. 쥐는 토요일과 일요일에 같은 두 병의 물을 마신다. 이러한 방법은 원하는 경우 에탄올 액세스의 대체 일정(예: 연속, 폭식 등)에 대해 쉽게 조정할 수 있습니다. 표준 및 lickometer가 장착된 접근 방식에 대한 별도의 지침이 제공됩니다.

프로토콜

모든 대표 데이터는 일리노이 대학교 시카고 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 승인과 NIH 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 단독으로 사육된 성인 Long-Evans 쥐를 사용하여 수집되었습니다. 각 피험자의 유체 소비량을 정확하게 모니터링하기 위해 단일 하우징이 필요합니다. 성체 수컷(n=38)과 암컷(n=22)의 롱-에반스 쥐는 도착하자마자 P50-80을 투여하고 실험을 시작하기 전 일주일 동안 사육장에 적응하도록 했다. 쥐는 달리 명시되지 않는 한 표준 차우(Teklad 7912, Envigo)와 물을 즉석에서 이용할 수 있었습니다.

1. 실험 전 준비 사항

  1. 음료수 병에 H2O 또는 EtOH로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 각 랫드에 대해 고유 식별자가 있는 라벨(MWF의 경우 H2O 병 1개, MWF의 경우 H2O 병 1개, TRS.
    의 경우 H 2 O 병 2개를 표시합니다. 참고: 선택적으로, 다른 색상의 테이프를 사용하여 H2O 및 EtOH 병을 식별하면 병 교체 중 잠재적인 오류를 방지할 수 있습니다.
  2. 실험 시작일 1일 전에 H2O 병에 식수를 채웁니다. 실험 시작일 1일 전에 190 proof EtOH를 음용수(20% v/v)와 결합하여 EtOH 용액을 준비합니다.
    주의: 변성된 EtOH는 독성이 있으므로 사용된 EtOH는 변성되지 않는 것이 중요합니다.
  3. 실험에 참여하는 쥐와 같은 선반에 빈 케이지를 준비하십시오. 이 케이지는 유출량을 계산하는 데 사용됩니다.
  4. 사용하는 경우 케이지에 LIQ HDR 시스템을 장착하십시오(3단계, 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6 및 보충 그림 1 참조).
  5. 연구를 시작하기 전에 병을 교체할 정확한 시간을 결정합니다. 24시간 섭취량의 정확한 측정을 위해 매일 같은 시간에 병을 교체해야 합니다.
    참고: 이전 연구에 따르면 설치류는 암흑 주기가 시작된 후 초기에 가장 많은 소비를 보이는 것으로 나타났습니다10,31. 따라서 이 매우 활동적인 기간 동안의 섭취량을 포착하려면(폭음과 같은 음주를 포착하기 위해 2.3.1단계 참조) 불이 꺼진 후 30-60분 후에 병을 교체하는 것이 좋습니다. 병을 교체하는 동안 빨간색 램프를 사용하여 명암 주기의 중단 없이 시각화할 수 있습니다.

2. 일상적인 절차 및 유지 보수

  1. 실험 첫날에 다음을 수행합니다.
    1. 케이지에서 표준 물병을 제거합니다.
    2. 선택 사항: 쥐는 먹이를 찾을 때 종종 케이지 상단을 밀치는데, 이는 빈 유출 케이지로 수정할 수 없는 유출을 유발할 수 있습니다. 케이지 내부에서 음식 컵을 사용하면 이러한 걱정을 완화할 수 있습니다. 사용하는 경우 지금 케이지 상단에서 음식을 제거하고 케이지 내부에 음식 컵을 넣고 차우로 채우십시오. 쥐에게 할당된 바닥 공간이 쥐 케이지의 크기와 음식 컵의 크기에 따른 제도적 지침을 여전히 충족하는지 확인합니다.
    3. 해당되는 경우 관리 및 축산 직원에게 연구 인력이 실험 기간 동안 음식과 물을 제공할 것임을 알립니다.
    4. 케이지 변경은 데이터 수집에 지장을 줄 수 있습니다. 체중 측정을 얻는 것과 함께 케이지 변경을 수행합니다. 이 작업을 수행하기로 선택한 연구자는 그에 따라 관리 및 사육 직원에게 알려야 합니다.
  2. 이후 며칠 동안 아래에 설명된 절차를 따르십시오.
    알림: 케이지와 병을 움직이면 유출이 발생할 수 있음을 기억하십시오. 따라서 움직임을 부드럽게 하고 쥐 케이지에 사용되는 것과 동일한 방법으로 유출 케이지에 병을 적용하고 제거하는 것과 동일한 방법을 사용하는 것이 중요합니다.
    1. 병 교체 시간 전에 방에 들어가 아래 단계를 수행할 수 있는 충분한 시간을 확보하고 적절한 세션 시작 시간에 새 병을 케이지에 놓습니다.
    2. 케이지에서 필터 상단을 제거합니다. MWF인 경우 2.2.3단계로 진행합니다. TRS인 경우 2.2.4단계로 진행합니다.
    3. 월요일, 수요일, 금요일에는 케이지 상단에서 TRS 병을 제거합니다. MWF 병(EtOH 1개 및 H2O1개)의 무게를 잰다. 오늘의 음주 세션을 위해 병의 시작 무게를 기록합니다. 필요한 경우 케이지 상단 또는 음식 컵에 추가 음식을 제공하십시오. 지정된 세션 시작 시간에 쥐가 병 라벨을 씹지 않도록 테이프가 위를 향하도록 하여 각 쥐의 케이지 상단에 병을 놓습니다.
      참고: 일반적으로 물 소비량은 TRS에 대해 기록되거나 보고되지 않지만, 연구원은 원하는 경우 2.2.3단계 및 2.2.4단계에서 아래에 설명된 대로 온/오프 병 무게를 얻어 선택적으로 이러한 데이터를 수집할 수 있습니다. EtOH 병의 면은 의도치 않게 소비 데이터를 왜곡할 수 있는 잠재적인 측면 선호도가 발생하는 것을 방지하기 위해 각 음주 세션 후에 번갈아 가며 사용해야 합니다.
      1. 선택 사항: 이전 연구에 따르면 많은 쥐가 음주 세션이 시작될 때 폭음과 같은 음주를 보입니다8,32,33. 이 기간 동안 폭음을 기록한 대부분의 연구자들은 음주 세션의 처음 30-60분 동안의 음주를 보고했습니다. 이 잠재적인 폭식 에피소드 동안 섭취 데이터를 얻으려면 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
      2. 마지막 케이지에 병을 적용한 후 타이머를 설정하십시오. 지정된 시간 동안 방해받지 않고 방을 두십시오.
      3. 타이머가 울리면 방에 다시 들어가십시오.EtOH 및 H2O 병을 제거하고 병 무게를 기록합니다. EtOH 및 H2O 병을 케이지에 회수합니다.
        참고: 이 단계는 핥기 감지가 가능한 시스템을 사용할 때 폭음 에피소드를 캡처하는 데 필요하지 않습니다.
    4. 화요일, 목요일, 토요일에는 시작 시간 후 24시간에 해당하는 지정된 세션 종료 시간에 케이지에서 MWF 병을 제거합니다. 각 병의 무게를 측정하고 MWF 음주 세션의 병 끝 무게를 기록합니다. 각 쥐의 체중을 구하고 기록합니다. 필요한 경우 케이지 상단 또는 음식 컵에 추가 음식을 제공하십시오. TRS H2O 병을 각 쥐의 케이지 상단에 테이프가 위를 향하게 하여 쥐가 병 라벨을 씹지 않도록 합니다.
    5. 필터 뚜껑을 우리로 되돌리고 동물실을 떠납니다.
      알림: 증발을 방지하기 위해 선택적으로 EtOH 병 사이퍼를 덮으십시오. 연구 인력이 케이지 교체를 수행하는 경우, TRS 업무 중 매주 1일을 지정하여 이 작업을 수행합니다. 체중을 감량한 후 각 쥐를 깨끗한 케이지에 넣습니다.
  3. 기관의 동물 관리 및 사육 절차에 따라 정기적으로, 매주 또는 격주로 병을 씻고 액체를 새로 고칩니다. 음주 세션을 방해하지 않는 방식으로 이러한 의무를 수행하도록 주의하십시오. 예를 들어, TRS H2O 병은 MWF에서 제거한 후 세척 및 리필할 수 있습니다. 마찬가지로, MWF H2O 및 EtOH 병은 TRS에서 제거한 후 세척 및 리필할 수 있습니다.

3. 두 병 선택 실험 중 핥기 감지

참고: 고해상도 음주 데이터를 캡처하는 데 관심이 있는 연구원은 병에 핥기 감지 기능을 추가하여 위의 절차를 수정할 수 있습니다. LIQ HD30은 마우스에서 이러한 유형의 데이터 수집을 허용하는 저비용 DIY(Do-It-Yourself) 시스템입니다. 아래에 요약된 절차는 LIQ HD를 쥐에서 사용하기 위해 적응하는 데 필요한 수정 사항(LIQ HDR이라고 함)을 설명합니다. 최대 18마리의 쥐에 대한 두 병 선택 데이터를 캡처할 수 있는 하나의 핥기 감지 시스템을 구성하는 데 필요한 모든 상업적으로 판매되는 부품 및 맞춤형 3D 프린팅 부품 목록은 재료 표를 참조하십시오. 3D 인쇄 .stl 파일 및 지침은 작성자의 웹 사이트(www.ejgloverlab.com/3dprints)에서 찾을 수 있습니다.

  1. 정전식 센서 장치 설정
    참고: 각 LIQ HDR 시스템은 3개의 정전식 센서 장치로 구성되며, 18마리의 단일 주택 쥐에 해당하는 36개의 병에서 병렬로 핥기 데이터를 캡처합니다. 각 센서 장치는 1개의 차동 I2C통신 브레이크아웃 보드와 1개의 12키 정전식 센서 보드로 구성되며, 각 리코미터에 대해 색상으로 구분된 6쌍의 2핀 케이블을 통해 6개의 개별 케이지에서 리코미터에 연결됩니다(그림 2A).
    1. 그림 2B와 같이 세 가지 정전식 센서 장치를 모두 구축하는 데 필요한 재료와 필요한 납땜 도구를 수집합니다.
    2. 센서 유닛 A 구축을 시작하려면 2핀 암 커넥터 케이블을 7인치 길이의 빨간색 열수축 튜브로 덮고 빨간색과 검은색 와이어 끝을 센서 보드의 핀 #0 및 #1(그림 2C-1)에 삽입하고 제자리에 납땜합니다(그림 2C-2). 케이블이 겹치지 않고 녹음을 방해하지 않고 사육장에서 왼쪽에서 오른쪽으로 케이지를 번호 순으로 정렬하려면 그림과 같이 케이블이 센서 보드 전면에 있는지 확인하십시오(3.6단계 및 그림 6 참조).
    3. 그림과 같이 뚜렷한 색상의 열수축 튜브와 땜납으로 5개의 케이블을 더 덮고 핀 #2-11에 납땜합니다(그림 2C-3). 모든 빨간색 와이어가 왼쪽의 모든 병에 연결되는 짝수 번호 핀에 납땜되어 있고 모든 검은색 와이어가 오른쪽의 모든 병에 연결되는 홀수 번호 핀에 납땜되어 있는지 확인합니다.
    4. 보호를 위해 모든 면에 뜨거운 접착제로 솔더 조인트를 덮습니다(그림 2C-4). 각 리코미터에 대한 고유 ID를 제공하여 커넥터에 번호 순서대로 레이블을 지정합니다(그림 2C-4).
    5. 센서 유닛 A를 조립하려면 50mm 4핀 케이블로 센서 보드 A를 통신 브레이크아웃 EndPoint에 연결하고 3.3mm 5핀 케이블(3.3mm 5핀 케이블)을 사용하여 EndPoint를 3V-4V 레버 시프터의 4V 출력에 연결합니다(그림 2D-1). 센서 보드와 통신 브레이크아웃 보드에는 모두 두 개의 동일한 4핀 커넥터가 있지만 3D 프린팅 센서 케이스와 제안된 비바리움 설정을 사용하려면 배선이 표시된 대로(그림 2D-1 및 그림 2F) >그림 2F)인지 확인하는 것이 여전히 중요합니다(3.6단계 및 ). 3D 프린팅 케이스 내부에 센서 유닛 A를 수용합니다(그림 2D-2). 레벨 시프터 케이블(그림 2D-3)이 찌그러지지 않도록 주의하면서 상단을 부드럽게 닫습니다.
    6. 표시된 대로 ADDR 핀의 점퍼 와이어를 3Vo 또는 SDA 핀으로 납땜하여 센서 보드 B 및 C의 I2C 주소를 수정합니다(그림 2E).
    7. 보드 A에 사용된 것과 동일한 순서로 6개의 색상으로 구분된 암 커넥터 케이블을 센서 보드 B와 C에 납땜합니다. 각 커넥터에 해당 리코미터 ID 번호를 레이블로 지정합니다. 50mm 4핀 케이블(그림 2F)을 사용하여 보드 B를 통신 브레이크아웃 MidPoint에 연결하고 C를 EndPoint에 연결합니다.
    8. 센서 유닛 B와 C를 각각의 3D 프린팅 케이스에 넣습니다. 세 개의 센서 장치를 모두 이더넷 케이블로 데이지 체인 방식으로 연결하여 센서 설정을 완료합니다(그림 2G).
  2. 마이크로 컨트롤러 인터페이스 설정
    참고: LIQ HDR 마이크로컨트롤러 인터페이스(보충 그림 1A)는 LIQ HD30에 대해 설명한 것과 동일하지만 매우 약간만 수정되었습니다. 아래에 설명된 절차는 3.2.6 및 3.2.8단계에서 설명한 수정 사항으로 인터페이스를 설정하는 데 필요한 단계에 대한 일반적인 개요를 제공합니다. 연구자는 더 자세한 단계별 지침을 위해 작성자의 GitHub 페이지에 제공된 원본 프로토콜 및 비디오 자습서30을 참조합니다.
    1. 마이크로 컨트롤러 인터페이스를 구축하는 데 필요한 재료와 납땜 도구를 수집합니다(보충 그림 1B). 터치 실드의 뒷면(보충 그림 1C-1)에서 백 라이트 납땜 패드를 가로질러 납땜 점퍼를 만듭니다(보충 그림 1C-2).
    2. 데이터 로깅 실드 뒷면에서 CS 핀의 점퍼 패드 트레이스를 끊습니다(보충 그림 1D-1). 데이터 로거 앞면의 CS 핀에서 핀 #7에 짧은 점퍼 와이어를 납땜합니다(보충 그림 1D-2).
    3. 실드 스태킹 헤더를 설치하려면 먼저 터치스크린 실드 뒷면에 쌓으십시오(보충 그림 1E-1). 데이터 로거를 터치스크린에 쌓고 테이프를 사용하여 안정화한 다음 모든 헤더 핀을 데이터 로거에 납땜합니다(보충 그림 1E-2). 그런 다음 터치스크린을 제거합니다.
    4. 나머지 2 x 3 헤더를 마이크로 컨트롤러에 쌓은 다음(보충 그림 1F-1), 헤더 핀을 제자리에 납땜하기 전에 데이터 로거를 마이크로 컨트롤러에 쌓습니다(보충 그림 1F-2).
    5. 코인 배터리를 데이터 로거에 삽입합니다(보충 그림 1G-1). 터치스크린을 데이터 로거에 쌓습니다(보충 그림 1G-1). microSD 카드를 어댑터와 함께 데이터 로거에 삽입합니다(보충 그림 1G-2).
    6. 추가 접지선을 만들려면 점퍼 와이어에서 하나의 수 커넥터를 자르고 끝을 ~1/4인치로 벗겨냅니다(보충 그림 1H-1). 벗겨진 솔리드 코어 와이어 가닥을 점퍼 와이어에 납땜하고 솔더 조인트를 열 수축 튜브로 덮습니다(보충 그림 1H-2).
    7. 4핀 점퍼 와이어와 추가 접지선을 마이크로컨트롤러(검은색 - GND, 빨간색 - 5V, 노란색 - 핀 #21, 파란색 - 핀 #20, 보충 그림 1I-1)에 연결합니다. 뜨거운 접착제로 연결부를 고정합니다(보충 그림 1I-2). 선택적으로 점퍼 와이어를 열 수축 튜브로 감쌉니다(보충 그림 1I-2).
    8. 완전히 조립된 마이크로컨트롤러 인터페이스를 3D 프린팅 케이스에 넣고, 4핀 점퍼 전선과 접지선이 상단의 개구부를 통해 나사산을 꿰어 있습니다(보충 그림 1J).
    9. 마이크로 컨트롤러 인터페이스 소프트웨어 설치를 위한 원래 프로토콜30을 따릅니다.
  3. LIQ HDR 리코미터 구축
    알림: 병을 고정하는 맞춤형 3D 프린트는 시퍼 튜브 직경이 8mm인 표준 설치류 음료수 병과 함께 사용하도록 설계되었습니다(재료 표 그림 3A 참조). 이 병 홀더는 사소하거나 전혀 수정하지 않고 유사한 병 및 시퍼 튜브와 함께 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
    1. 그림 3B와 같이 하나의 리코미터를 만드는 데 필요한 재료, 3D 인쇄 및 납땜 도구를 수집합니다. 각 LIQ HDR 시스템은 36병에 대해 최대 18개의 리코미터를 수용합니다.
    2. 수 커넥터 케이블을 연장하려면 양쪽 끝을 길이가 ~1/4인치로 벗겨내고 확장 검정색 및 빨간색 와이어를 벗겨냅니다(그림 3C-1).
    3. 연장 와이어를 커넥터 케이블(그림 3C-2)에 납땜하고 납땜 이음부를 열수축 튜브(그림 3C-3)로 덮습니다. 센서 장치의 해당 암 커넥터 케이블과 색상이 일치하는 열 수축 튜브로 수 커넥터 케이블을 덮습니다(그림 3C-4).
    4. 센서 보드 배선(그림 2)과 일치하도록 병 홀더의 왼쪽과 오른쪽 내부 케이블 통로를 통해 빨간색과 검은색 와이어를 각각 끼웁니다(그림 3D-1).
    5. 각 와이어를 1 3/4인치 전도성 구리 테이프(그림 3D-2)의 맨 끝에 납땜하고 구리 테이프를 반으로 접습니다(그림 3D-3).
    6. 구리 테이프를 벗기고 집게를 사용하여 시퍼 브래킷(그림 3E-1) 내부를 조심스럽게 움직인 후 시퍼 브래킷(그림 3E-2)의 내벽에 단단히 부착합니다. 표시된 대로 구리 테이프의 납땜 면이 병 홀더의 정중선에 더 가까운 벽에 부착되어 있는지 확인하십시오(그림 3E-2). 브래킷을 통해 시퍼 튜브를 밀어 테이프를 벽에 단단히 누르고 브래킷을 프라이밍합니다.
    7. 접착제가 아니고 벗겨지는 경향이 있는 구리 테이프의 솔더 면을 강화하려면 솔더 조인트에 뜨거운 접착제 덩어리를 바르십시오(그림 3E-3). 구리 테이프와 3D 프린트의 인접한 노출 부분을 모두 덮도록 접착제를 바르십시오(그림 3E-4).
    8. 케이블 프로텍터의 내부 통로를 통해 케이블을 끼웁니다(그림 3F). 제안된 비바리움 설정을 사용하려면 각 리코미터에 대해 적절한 케이블 프로텍터(왼쪽 또는 오른쪽)를 선택해야 합니다(3.6단계 및 그림 6) 참조)."참고: 현재 설정에서 파란색 또는 자주색 케이블로 표시된 리코미터 5-6, 11-12 및 17-18에는 왼쪽 케이블 프로텍터(그림 4D-1)가 필요합니다. 다른 모든 리크 미터에는 오른쪽을 향한 케이블 프로텍터가 필요합니다 (그림 4D-2).
    9. 케이블 클립을 설치하려면 먼저 케이블 클립의 절반 홈에 하나의 와이어를 끼우고(그림 3G-1) 나머지 절반을 두 번째 와이어에 끼운 다음 너트(그림 3G-2)로 양쪽 절반을 단단히 닫습니다.
    10. 수 커넥터에 해당 lickometer ID 번호(그림 3H)로 레이블을 지정합니다. 18개의 리코미터가 모두 만들어질 때까지 이 단계를 반복합니다.
  4. LIQ HDR 리코미터 설치
    참고: LIQ HDR은 금속 와이어 상단이 있는 표준 신발장 쥐 케이지에 설치하도록 설계되었습니다(그림 4A-1).
    1. 병 홀더를 수용하기 위해 와이어 케이지 상단에서 중심 간 거리가 ~75mm인 두 쌍의 막대를 식별합니다. 펜치를 사용하여 시퍼 구멍 주위의 금속 막대를 약간 엽니다. 사이퍼와 케이지 상단 사이의 금속 간 접촉을 방지하기 위해 이 막대를 전기 테이프로 절연하십시오(그림 4A-2).
      참고: 전기 테이프는 쥐가 접근할 수 없으므로 씹을 수 없지만 연구가 끝나면 폐기하고 연구 사이에 재사용하지 않는 것이 좋습니다.
    2. 두 세트의 M1 나사와 너트(그림 4B)를 사용하여 리코미터와 5/5인치 두께의 레이저 아크릴 패널을 케이지 상단에 설치합니다. 리코미터와 아크릴 패널의 시퍼 구멍이 정렬되어 있고 시퍼가 케이지 상단의 어떤 부분에도 닿지 않는지 확인하십시오.
    3. 와이어 케이지 상단(그림 4C)의 가장 바깥쪽 막대(직경 ~4mm)에 케이블 클립을 고정합니다. 필요한 경우 케이블 클립을 조정하여 케이지 상단이 케이지 바닥에 꼭 맞도록 하고 케이블이 너무 많은 장력으로 당겨지거나 구부러지지 않도록 합니다. 각 리코미터에 올바른 케이블 프로텍터가 사용되고 있는지 확인하십시오(그림 4D 및 3.8.8단계 참조).
    4. 필요에 따라 시퍼의 ~2cm만 캡에서 확장되도록 시퍼 튜브를 조정합니다(그림 4E-1). 병을 설치하려면 병 홀더의 시퍼 브래킷을 통해 시퍼 튜브가 멈출 때까지 삽입하십시오(그림 4E-2). 시퍼 튜브의 맨 끝만 아크릴 패널을 넘어 확장되어야 합니다(그림 4E-3). 쥐가 시퍼 튜브를 만지거나 가지고 노는 것과 같은 비완성적 행동으로 인한 거짓 양성 핥기를 피하기 위해 시퍼 튜브의 다른 부분이 노출되지 않는 것이 중요합니다. 필터 상단은 케이블 자체를 방해하지 않고 와이어 케이지 상단과 케이블 클립 위에 꼭 맞게 놓일 수 있어야 합니다(그림 4F).
      참고: 더 두꺼운 아크릴 패널 또는 여러 개의 1/8인치 패널 스택을 사용하여 짧은 홀짝에 도달하는 데 문제가 있을 수 있는 어린 쥐의 음주를 측정할 때와 같이 사이퍼 튜브가 케이지 안으로 더 확장되어야 하는 실험을 위해 더 긴 길이의 사이퍼 튜브를 완전히 둘러쌀 수 있습니다.
  5. sipper blockers 설치 및 사용 방법
    알림: 시퍼 차단제(그림 5A)는 병을 교체하는 동안 쥐가 시퍼에 접근하는 것을 제한하고 각 음주 세션이 시작될 때 정확한 리코미터 보정을 보장하도록 설계되었습니다.
    1. <그림 5B>strong class="xfig"와 같이 3D 프린팅 부품과 M5 나사, 너트 및 와셔를 하나의 시퍼 블로커로 수집합니다.
    2. SIPPER_Gear SIPPER_Base에 삽입합니다(그림 5C-1). SIPPER_Gear 방향이 3D 렌더링 삽입에 표시된 대로 정확하게 지정되었는지 확인합니다. SIPPER_Base 상단의 구멍에 SIPPER_Worm를 삽입합니다. 헤드가 베이스와 같은 높이가 될 때까지 삽입하는 동안 웜을 시계 방향으로 돌립니다(그림 5C-2).
    3. 베이스 바닥에서 웜 끝까지 SIPPER_Nut를 나사로 고정합니다(그림 5C-3). 웜 다이얼을 돌리는 동안 집게를 사용하여 너트를 조입니다. SIPPER_Blockers의 둥글고 좁은 넥을 기어의 슬롯에 삽입합니다(그림 5C-4).
    4. M5 나사 세트(그림 5D)를 사용하여 조립된 시퍼 차단기를 케이지 상단에 설치합니다. 두 시퍼 차단기가 시퍼 구멍과 정렬되어 있는지 확인하십시오.
    5. 시퍼에 대한 접근을 차단하려면 웜 다이얼을 시계 방향으로 돌려 시퍼 구멍을 완전히 덮을 때까지 차단제를 낮추십시오(그림 5E).
    6. 시퍼에 대한 액세스를 제공하려면 차단기가 케이지 상단에 수직인 수직 위치에 있을 때까지 다이얼을 시계 반대 방향으로 돌립니다(그림 5F-1). 헤드가 와이어 케이지 상단 바로 아래에 올 때까지 각 차단기 암을 수동으로 위로 당깁니다. 차단기를 90° 회전하여 헤드가 케이지 상단의 금속 막대와 평행이 되고 암이 제자리에 고정되도록 합니다(그림 5F-2). 두 차단기가 모두 케이지 상단 위로 올라갈 때까지(그림 5F-3) 사이퍼에 완전히 접근할 수 있을 때까지(그림 5F-4) 다이얼을 시계 반대 방향으로 계속 돌립니다.
  6. 사육장에서 LIQ HDR 시스템 사용
    참고: 다음 비바리움 설정은 18개의 표준 신발장 쥐 케이지에 연결된 단일 마이크로컨트롤러 인터페이스를 사용하여 두 병을 선택하여 마시는 것을 캡처하도록 최적화되어 있습니다. 마이크로 컨트롤러 인터페이스, 센서 장치 및 다양한 케이블을 포함한 모든 전자 부품은 케이지를 고정하는 벽걸이형 금속 와이어 선반에 고정됩니다(그림 6A). 동물 시설 및 사용자 요구에 적응하기 위해 일부 수정이 필요할 수 있습니다.
    1. 맞춤형 3D 프린팅 장착 나사(그림 6B)를 사용하여 각 센서 장치를 사육장 선반에 장착합니다. 불필요한 케이블 장력을 피하기 위해 각 센서 장치가 노란색 리코미터가 있는 케이지 바로 아래에 장착되어 있는지 확인하십시오(그림 6A).
    2. 각 암 커넥터 케이블이 서로 겹치거나 솔더 끝이 과도하게 구부러져 핥기 감지가 제대로 되지 않도록 각 암 커넥터 케이블을 배열하고 고정합니다(그림 6B). 금속 막대 선반설치가 사용되는 경우, 이것은 그림과 같이 선반에 막대를 분리하기 위해 커넥터 케이블을 케이블로 묶음으로써 쉽게 달성될 수 있습니다.
    3. 동일한 3D 프린팅 장착 나사를 사용하여 센서 장치 A 옆에 마이크로컨트롤러 인터페이스를 장착하고 4핀 커넥터를 센서 장치 A에 연결된 5V-3V 레벨 시프터의 5V 입력 포트에 꽂습니다(그림 6C).
    4. 전기 테이프를 사용하여 추가 접지선을 금속 선반과 같은 접지 소스에 고정합니다(그림 6D).
    5. 그림 6A 그림에 따라 설치된 리코미터의 색상과 ID를 기준으로 각 케이지를 배열하여 케이블 겹침 및 장력을 최소화합니다.
    6. 모든 수 리코미터 커넥터 케이블을 일치하는 암 센서 커넥터 케이블(그림 6E)에 단단히 연결합니다. 전원 공급 장치를 연결하여 마이크로 컨트롤러 인터페이스(그림 6F)를 켭니다.
    7. 기본 GUI(그래픽 사용자 인터페이스) 페이지(그림 6G)에서 설정 기호를 탭하여 설정 페이지를 엽니다. 사용자는 다크사이클이 시작될 때 인터페이스 디스플레이가 자동으로 어두워지도록 하기 위해 사육장 일정에 따라 조명 켜기 및 끄기 시간을 변경할 수 있습니다(그림 6H-1).
    8. 센서 설정 편집(그림 6H-1)을 눌러 터치 임계값을 8로 조정하고 릴리스 임계값을 2로 조정하면 현재 설정(그림 6H-2)을 사용하여 쥐에 대해 가장 일관된 핥기 감지를 활성화할 수 있습니다. 그러나 현재 시스템에 수정 사항이 도입되는 경우 사용자는 다른 설정을 실험해야 할 수 있습니다.
    9. 데이터가 24시간 이하로만 수집된 경우 자동 보정을 선택 취소합니다(그림 6H-2).

4. 핥기 감지를 사용하여 2병 선택 가정용 케이지 음주를 위한 일일 절차

  1. 표준 2병 선택 절차에 대해 2단계에 설명된 단계를 다음과 같이 수정하여 수행합니다.
  2. 월요일, 수요일, 금요일에는 MWF 병을 착용하기 전에 시퍼 차단제를 사용하여 모든 케이지의 시퍼 구멍을 덮습니다(3.5.5 단계 및 그림 5E 참조).
  3. 녹음하기 전에 메인 GUI 페이지에서 해당 날짜의 EtOH 병 면이 될 올바른 실험 면을 선택합니다(그림 6G).
  4. 모든 MWF 병을 설치한 후 메인 페이지(그림 6G)에서 START!를 눌러 센서 보정을 시작하며, 이 동안 사용자는 시스템에서 한 걸음 물러나 쥐가 sippers를 핥지 않는지 확인하는 것이 좋습니다(그림 6I-1). 보정을 완료하는 데 몇 초가 소요되며, 그 후 시스템은 각 리코미터에 대한 각 병의 누적 핥기 수를 보여주는 기본 기록 페이지로 들어갑니다(그림 6I-2).
  5. 시퍼에 접근할 수 있도록 케이지 상단 위로 모든 시퍼 차단기를 올리고(3.5.6단계 및 그림 5F 참조) 설명된 대로 모든 필터 상단을 부드럽게 되돌립니다(3.4.4단계 및 그림 4F 참조).
  6. 새로 고침을 눌러 자체적으로 실시간으로 업데이트되지 않는 화면의 릭 번호를 업데이트합니다(그림 6I-2).
  7. 화요일, 목요일, 토요일에는 저장 및 종료를 탭하여 녹음을 중지하고 MWF 병을 제거하기 전에 메인 페이지(그림 6I-2)로 돌아갑니다.
  8. 데이터 전송을 위해 SD 카드를 제거하려면 SD 카드를 분리하기 전에 SD 꺼내기를 누릅니다(그림 6G). SD 카드를 아무 컴퓨터에나 삽입하고 병 ON 날짜의 이름을 딴 .csv 데이터 파일을 해당 컴퓨터에 복사/붙여넣습니다(그림 6K). 다음 녹음을 위해 SD 카드를 다시 마운트하려면 카드를 인터페이스에 삽입하고 SD 마운트(그림 6J).
    를 누릅니다. 참고: 데이터 파일은 매일 백업하는 것이 좋습니다.
  9. 동물 모델 및 동물 사용 프로토콜과 호환되는 경우 체중 측정을 일주일에 한 번으로 제한하고 리코미터 및 센서에 대한 불필요한 방해를 최소화하기 위해 케이지 교체가 지정된 날에 이 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 케이지를 이동하기 전에 일치하는 암 센서 케이블에서 모든 수 lickometer 케이블을 뽑으십시오. 각 쥐의 무게를 잰 후 쥐를 깨끗한 우리에 다시 넣으십시오. 리코미터를 새 케이지 상단으로 옮기고 필요한 경우 각 리코미터를 해당 센서에 다시 연결합니다.
  10. EtOH 섭취 및 음주 미세구조에 대한 중재(예: 약물 주입)의 효과를 테스트하는 실험의 경우, 가능하면 음주 세션이 시작되기 전에 이러한 중재를 예약하십시오. 이것이 불가능한 경우 연구원은 일시 중지(그림 6I-2)를 눌러 핥기 감지를 중단하고 개입이 완료된 후 다시 시작을 눌러 데이터 캡처를 다시 시작할 수 있습니다. 중재 전후의 EtOH 섭취 변화를 포착하고 동물에게 접근하기 위해 케이지 상단을 제거할 때 발생할 수 있는 유출을 설명하기 위해 음주 세션이 일시 중지될 때마다 병 무게를 수집하는 것이 좋습니다.
  11. 연구가 끝나면 동물 간의 오염 물질 전파를 제한하기 위해 새로운 동물과 함께 사용하기 전에 케이지 내 모든 구성 요소를 철저히 소독해야 합니다. 리코미터에 70% EtOH 용액을 부드럽게 분사하고 닦아내면서 내부 전기 부품을 방해하지 않도록 하는 것이 좋습니다. 시퍼 블록제와 아크릴 패널은 따뜻한 비눗물로 세척할 수 있습니다.

5. 데이터 분석

  1. 종속 측정을 평가하기 전에 매일 병을 교체한 결과로 불가피하게 발생하는 유출에 대한 정확한 섭취 데이터를 확인하십시오. 이를 위해 전체 연구 기간 동안 유출 케이지에서 EtOH 및 H2O 병의 병 무게 변화를 평균
    2. 화합니다.
  2. 각 병의 평균에서 2 표준 편차보다 큰 값을 제외합니다. 이러한 이상치를 제외한 후, 동물이 들어있는 케이지의 병에서 얻은 EtOH 및 H2O 병 무게의 변화에서 계산된 평균을 뺍니다. 이 양을 빼면 연구자들은 주어진 용액의 유출로 인한 평균 손실이 소비량 측정에서 고려되지 않는다는 것을 확신할 수 있습니다. 평균 유출량을 빼면 경우에 따라 일부 동물에게 음의 값이 될 수 있습니다. 이를 0으로 변환하고 해당 용액에 대한 흡입구가 없는 것으로 해석합니다.
  3. 2병 선택 음주 실험의 주요 종속 척도는 EtOH 섭취량(g/kg)과 선호도(%)입니다. 다음 단계를 사용하여 EtOH 병 무게(g)의 변화로 인한 섭취량을 계산하고 체중(kg)으로 정규화합니다.
    1. 다음 방정식을 사용하여 병 무게(g)의 변화를 부피(mL)의 변화(mL)로 변환합니다
      figure-protocol-1
      순수 에탄올의 밀도는 0.789g/mL입니다. 따라서 20% EtOH의 기여 밀도는 0.1578g/mL입니다. H2O의 무게는 1g / mL입니다. 따라서 기여 밀도는 80% H2O = 0.80 g/mL입니다. 결과적으로, 20% EtOH 용액(v/v)의 각 mL는 0.1578(EtOH) + 0.80(H2O) = 0.9578 g/mL로 구성됩니다. 따라서 20%(v/v) EtOH 농도를 사용할 때의 최종 방정식은 다음과 같습니다
      figure-protocol-2
    2. 아래 방정식을 사용하여 소비된 에탄올의 양을 계산합니다. 동물 체중으로 소비된 에탄올을 계산하려면 섭취 데이터와 같은 주에 얻은 체중을 사용합니다.
      figure-protocol-3
    3. 다음 방정식을 사용하여 기본 설정을 계산합니다.
      figure-protocol-4
  4. LIQ HDR은 마우스30과 마찬가지로 릭 시간, 시합 횟수, 시합 핥기 시간, 시합 핥기 시간(그림 6K)을 포함한 다양한 음주 미세구조 변수를 캡처합니다. 음주 시합은 1초 이내에 최소 3번의 핥기로 시작하여 추가 핥기 없이 3초가 지나면 끝나는 일련의 핥기로 정의됩니다. 그런 다음 이러한 측정을 사용하여 평균 개별 릭 지속 시간, 평균 개별 시합 지속 시간, 시합당 평균 릭 횟수, 평균 핥기 빈도, 예상 핥기 간 간격 및 예상 시합 간 간격을 계산할 수 있습니다.
    참고: 마이크로 컨트롤러 인터페이스는 이러한 미세 구조 데이터를 .csv 파일로 1분 해상도로 제공합니다(그림 6K). 연구원은 원래 LIQ HD 프로토콜30과 함께 제공되는 분석 앱 또는 선호하는 후처리 플랫폼을 사용하여 연구 요구 사항에 따라 데이터를 수집하고 요약할 수 있습니다. 미세구조 데이터는 일반적으로 거시적 수준에서 평균 차이를 비교하기 위해 전체 24시간 기간에 걸쳐 합산되거나 30분에서 1시간 빈으로 요약되어 명암 주기에 걸친 음주 패턴 변화를 조사합니다.

결과

표준적인 간헐적 두 병 선택 홈 케이지 EtOH 음주 데이터
표준 절차(그림 7A)를 사용하면 연구자들은 24시간 동안의 섭취량(그림 7B-D)뿐 아니라 음주 세션이 시작된 직후 병의 무게를 측정함으로써 폭음과 유사한 음주 양상도 확인할 수 있다(그림 7E-F). 물 섭취량에 대한 에탄올 섭취량의 비율을 계산함으로써, 연구자들은 측정된 모든 시점에서 선호도 데이터도 얻을 수 있다(그림 7D,F). 그림 7C에서 보듯이, 쥐는 두 병 선택 접근 방식의 처음 며칠 동안 에탄올 섭취량이 증가하는 경향을 자주 나타낸다. 이후 섭취량이 비교적 안정적으로 유지되는 평형 상태가 뒤따른다. 이 양상은 수컷 쥐에서 일관되게 관찰되지만7,32,33,34,35,36, 암컷에서는 항상 나타나지 않는다. 대신 일부 연구에서는 암컷 쥐에서 연구 기간 내내 에탄올 섭취량이 안정적인 수준을 유지한다고 보고하고 있다37,38. 또한 일부 연구들은 접근 기간이 더 길어질수록 에탄올 섭취량이 추가로 증가할 수 있음을 시사한다36,39. 개체별로 일일 섭취량은 상당히 다양할 수 있다. 그러나 알코올 연구에서 가장 흔히 사용되는 쥐 균주에 대해 평균 일일 섭취량은 잘 특성화되어 있으며, 그룹 데이터를 분석할 때 성공의 기준으로 활용할 수 있다7,8,33,34,35,39.

그림 7E에서 보듯이, 많은 쥐들이 음주 세션 시작 직후 하루 음주량의 상당 부분을 섭취한다8,33. 이러한 폭음과 유사한 에탄올 섭취 양상은 종종 물보다 에탄올을 현저히 선호하는 것과 관련이 있다(그림 7F). 그러나 24시간 선호도가 50%를 초과하지 않는 경우에도 연구자들은 놀라지 말아야 한다. 이는 특히 외래 쥐주 또는 알코올을 선호하지 않는 설치류 균주, 그리고 두 병 선택 접근이 비교적 짧은 기간으로 제한된 연구에서 해당된다7,32,33,35,37.

두 병 선택 음주 미세 구조 분석을 위한 LIQ HDR의 검증
LIQ HDR 시스템을 표준 쥐 두 병 선택 실험 패러다임에 추가하면 연구자는 수집된 음주 데이터를 사용하여 섭취량을 정확하고 정밀하게 예측할 수 있다. 이는 24시간 동안 에탄올(EtOH) 병(R2 = 0.7789, F(1,113) = 398.1, p < 0.0001)과 H2O 병(R2 = 0.7910, F(1,117) = 442.9, p < 0.0001) 모두에서 감지된 누적 핥기 횟수와 병 무게 변화 간에 강하고 통계적으로 유의미한 상관관계가 존재함으로써 입증되었다(그림 8A). 이는 쥐가 두 병 모두에 H2O가 들어 있는 상태에서 제공된 날에도 마찬가지로 관찰되었다(R2 = 0.8875, F(1,188) = 1484, p < 0.0001; 그림 8B).

LIQ HDR은 표준적인 두 병 선택 패러다임에서는 제공되지 않는 높은 시간 해상도로 음주 패턴을 정밀하게 분석할 수 있게 해준다. 이 접근법을 사용하면 연구자들은 서로 다른 용액 간, 광주기 동안, 성별 간, 약물 그룹 간 등 다양한 조건에서 음주 패턴의 차이를 조사할 수 있다. 예를 들어, 평균 핥기 횟수를 30분 간격으로 구간화하면 24시간 평균 음주 패턴을 쉽게 분석할 수 있다. 예상대로, 이 분석은 쥐가 깨어 있는 암주기 동안 에탄올(EtOH)과 물(H2O)의 섭취량이 쥐가 일반적으로 수면하는 광주기보다 유의하게 높음을 보여준다(그림 8C). 유사한 접근법을 사용하면 그룹 간 음주 패턴의 차이를 탐색할 수 있다. 예를 들어, 수컷과 암컷 쥐의 음주 미세 구조를 24시간 동안의 EtOH(그림 8D) 또는 물(그림 8E)에 대한 평균 핥기 횟수를 비교하여 분석할 수 있다. 선형 과다 섭취(front-loading) 및/또는 폭음(binge-like) 음주를 조사하기 위해 연구자들은 분석의 해상도를 높여 세션 시작 직후에 발생하는 음주를 더 작은 구간 창을 사용하여 요약함으로써 집중적으로 분석할 수 있다. 이를 통해 연구자들은 24시간 동안 여러 병의 무게를 반복 측정하지 않고도 폭음과 유사한 음주 기간을 조사할 수 있다. 그림 8C(삽입도)에서 보듯이, 세션 시작 30분 후에 측정된 병의 무게로 파악된 대부분의 음주는 30분 동안 고르게 분포하기보다는 처음 5분 이내에 발생함을 이 분석은 밝혀낸다. 이러한 데이터는 혈중 에탄올 농도(BEC)를 측정하기 위한 혈액 샘플 채취의 최적 시점을 식별하는 데 도움을 줄 수 있다. 실제로 별도의 음주일에 15분과 같은 짧은 기간 동안 고해상도 음주 패턴을 측정한 결과, 유사한 선형 과다 섭취 패턴이 관찰되었다(그림 8F). 이 세션 동안 기록된 평균 핥기 횟수는 병의 무게 변화를 신뢰성 있게 예측하였다(EtOH: R2 = 0.6316, F(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H2O: R2 = 0.8601, F(1,10) = 61.47, p < 0.0001; 그림 8G). 또한 세션 시작 15분 후에 채취한 혈액 샘플에서 측정한 BEC는 감지된 핥기 횟수와 잘 상관되었으며(R2 = 0.4327, F(1,10) = 7.627, p = 0.0201; 그림 8H), 비교적 낮은 수준의 EtOH 섭취량에서도 그러한 상관관계가 나타났다.

LIQ HDR은 음주 세션 동안 실시간으로 검출 및 계산되는 다양한 음주 미세 구조 지표들을 측정하며, 각 지표는 1분 간격으로 저장되며, 이는 핥기 동작 검출 방식과 유사하다.그림 6K). 이러한 조치들은 5.4단계에서 간략히 설명하며 이전에 정의하였다.30연구자들은 개별 음주 미세 구조의 변화에 대한 상세한 분석을 수행하고, 음주 양상이 총 음주량의 차이에 어떠한 방식으로 그리고 어느 정도 기여하는지를 조사할 수 있다. 예를 들어, 수컷과 암컷 쥐는 합의 수, 음주 에피소드 수 및 에피소드 지속 시간이 유사하다는 것을 발견하였다(그림 9A- C) 음용수를 마실 때, 암컷에서 수컷보다 총 섭취량(g/kg)이 더 높았다(t-검정; t=2.882, df=10, p=0.0163; 그림 9D). 체중에 따른 섭취량이 암컷에서 수컷보다 동일한 핥기 횟수에 대해 더 높은 수준을 나타내는 것은 체중의 성차이를 고려했을 때 예상되는 결과이다. 주목할 만하게도, 이는 에탄올(EtOH) 섭취의 미세 구조 양상에서의 성차를 비교한 결과와 대조적이며, 후자의 경우 유사한 수준의 EtOH 섭취량과 관련된 유사한 음주 미세 구조가 나타났다(그림 9E- H). 이러한 데이터는 물 섭취 시 핥는 양이 성별 간에 유사하지만, 수컷에 비해 암컷 쥐에서 에탄올(EtOH) 섭취 시 핥는 양이 더 적음을 시사한다. 종합적으로 이러한 미세구조적 데이터는 동일한 사육 케이지 환경에서 수컷과 암컷 쥐가 섭취하는 액체의 종류에 따라 자발적인 음수 전략이 다를 가능성이 있음을 뒷받침한다. 이전 연구들에서도 액체의 종류에 따라 달라지는 음수 전략의 성별 차이를 보고한 바 있다.40,41, 그러나 이러한 연구에서 관찰된 차이점들은 물 섭취량에만 국한되지 않았다. 음주 이력의 기간이 연구 간 관찰된 차이에 영향을 미쳤을 수 있는데, 현재 데이터 세트에서는 두 병 선택 음주 기간이 5주로 제한된 반면, 이전 연구에서는 12주를 초과했기 때문이다.40,41.

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그림 1: 두 병 선택 방식의 사육 케이지 내 음주 실험. (A) 연구자들은 병의 무게 변화를 기반으로 계산하는 표준적 방법을 사용하여 사육 케이지 내에서 자발적으로 섭취하는 에탄올의 양과 물 대비 선호도를 측정할 수 있다. (B) 저비용의 DIY 사육 케이지 핥기 감지 시스템인 LIQ HDR을 사용하면, 표준적인 두 병 선택 절차에서 얻을 수 있는 동일한 측정값을 확보하는 동시에, 전체 기록 기간 동안의 고해상도 음주 미세 구조를 함께 수집할 수 있다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 정전용량 센서 유닛 제작. (A) 전자 부품 및 배선도. (B) 하나의 LIQ HDR 시스템을 구성하기 위해 필요한 세 개의 정전용량 센서 유닛 제작용 재료. (C) 2핀 암 커넥터 케이블을 케이지 #1-6용 보드 A의 핀 #0-11에 납땜하고 핫글루로 납땜 접합부를 고정한다. 컬러 코드 케이블은 컬러 열수축 튜브로 표시하고 각각 고유한 리코미터 ID 번호를 부착한다. (D) 보드 A와 5V-3V 레벨 시프터를 4핀 케이블(1)을 사용하여 차동 I2C 통신 브레이크아웃 엔드포인트에 연결하고, 보드 A와 통신 브레이크아웃을 3D 프린팅된 케이스(2-3)에 장착한다. (E) 보드 B와 C의 I2C 주소를 ADDR 핀에서 각각 3Vo 및 SDA 핀으로 점퍼 와이어를 납땜하여 변경한다. (F) 센서 보드 B와 C에 2핀 암 커넥터 케이블을 납땜하고 해당 리코미터 ID로 라벨링한 후, 보드 B는 4핀 케이블로 통신 브레이크아웃 미드포인트에, 보드 C는 엔드포인트에 연결한다. (G) 센서 유닛 B와 C를 각각의 3D 프린팅된 케이스에 장착하고, 세 개의 유닛을 이더넷 케이블로 연결한다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: LIQ HDR 핥음 측정 장치를 조립한다. (A) 케이지 내부 구성 요소의 3D 렌더링. (B) 두 병 핥음 측정 장치 한 세트를 설치하기 위한 재료. 한 개의 LIQ HDR 시스템은 18개의 두 병 핥음 측정 장치를 수용할 수 있음에 유의한다. (C) 검은색과 빨간색 전선 한 쌍을 사용하여 2핀 수커넥터 케이블의 길이를 연장하고 열수축 튜브로 색상 코드를 표시한다. (D) 검은색과 빨간색 전선을 병 홀더의 왼쪽(L) 및 오른쪽(R) 구멍(1)을 통해 통과시킨 후 끝부분을 구리 테이프(2-3)에 납땜한다. (E) 구리 테이프를 스파우트 브라켓의 내벽(1-2)에 부착하고 핫글루(3-4)로 보강한다. (F) 케이블을 케이블 보호 장치를 통해 통과시킨다. (G) 케이블 클립을 설치한다. (H) 연결 단자에 해당 핥음 측정 장치의 ID 번호를 표시한다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 리커미터 설치. (A) 금속 케이지 상단의 스파우트 구멍 주변 금속 막대를 전기 테이프로 절연하십시오. (B) 두 쌍의 M5 나사와 너트를 사용하여 리커미터와 아크릴 패널을 케이지 상단에 설치하십시오. (C) 케이블 클립을 와이어 케이지 상단의 가장 바깥쪽 막대에 고정하십시오. (D) 각 케이지에 적절한 케이블 보호 장치(왼쪽 L 또는 오른쪽 R)를 사용해야 합니다. (E) 병의 스파우트 끝부분이 약 2cm 정도만 노출되도록 하십시오(1). 이렇게 하면 병을 케이지 위에 올렸을 때(2) 스파우트의 가장 끝부분만 아크릴 패널을 약간 벗어나 쥐가 접근할 수 있도록 할 수 있습니다. (F) 필터 상단은 케이블 자체를 방해하지 않도록 케이블 클립 위에 잘 맞아야 합니다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 시퍼 블로커 설치 및 사용 방법. (A) 시퍼 블로커의 3D 렌더링 이미지. (B) 하나의 시퍼 블로커를 위한 맞춤형 3D 프린팅 부품들. (C) 3D 프린팅 부품들을 조립한다. (D) M5 나사 + 너트 + 와셔를 사용하여 조립된 시퍼 블로커를 케이지 상단에 설치한다. (E) 다이얼을 시계 방향으로 돌려 시퍼에 대한 접근을 차단한다. (F) 다이얼을 반시계 방향으로 돌려 시퍼의 블로커를 제거한다(1), 블로커를 들어올린 후 90° 회전시킨다(2), 그리고 블로커가 케이지 상단 위로 올라올 때까지 다이얼을 계속 반시계 방향으로 돌린다(3-4). 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 동물 사육장 설정 및 GUI 조작. (A) 권장되는 동물사육실 구성 및 배선도 (B) 각 센서 유닛을 선반에 장착하고, 센서 케이블을 선반에 정렬한 후 고정한다. (C) 마이크로컨트롤러 인터페이스를 선반에 장착하고, 센서 유닛 A에 연결된 5V-3V 레벨 시프터에 4핀 점퍼를 연결한다. (D) 여분의 접지선을 전기 테이프로 고정한다. (E) 센서 케이블을 해당하는 리코미터 케이블에 연결하십시오. (F) 전원 공급 장치를 연결하여 마이크로컨트롤러 인터페이스를 켜십시오. (G) GUI 인터페이스의 메인 페이지 (H) 탭 설정 사육실의 조명 스케줄(1)에 맞춰 조명 켜기/끄기 시간을 조정하고 탭하세요 센서 설정 쥐의 접촉 및 방출 임계값을 조정하기 위해 (2). (I) 데이터를 기록하려면 다음을 선택하십시오. EtOH 병 측면 메인 페이지에서, 탭 시작! 센서를 교정하고(1), 녹화를 시작합니다(2). 탭합니다 새로 고침 화면에 표시된 물기 횟수를 업데이트하고, 탭하세요 저장 & 종료 녹화를 중지합니다. (J) 탭 SD 카드 제거 메인 페이지에서 SD 카드를 제거하고 데이터를 전송하려면 탭하세요. SD 마운트 SD 카드 삽입 후. (K) 스크린샷 마이크로컨트롤러 인터페이스를 통해 미세구조 데이터가 1분 간격으로 저장되는 방식을 보여주는 대표적인 원시 데이터 파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 표준 절차를 사용하여 측정한 대표적인 두 병 선택 음주 데이터. 간헐적 접근 두 병 선택 홈 케이지 EtOH 음주 패러다임에서, (A) 쥐들은 월요일, 수요일, 금요일(MWF)에는 20%(v/v) EtOH 용액(주황색)과 H2O(파란색)를 제공받으며, 화요일, 목요일 및 주말에는 H2O가 들어 있는 두 병을 제공받는다. (B) 일일 수액 섭취량 측정 결과, 쥐들은 연구 기간 동안 전반적으로 일정한 총 수액 섭취량(mL)을 유지하지만, (C) 쥐들은 처음 몇 차례의 음주 세션 동안 EtOH 섭취량이 증가하는 경향을 보이며, 이후 섭취량은 평형 상태에 도달한다. (D) 이러한 증가 및 유지 패턴은 EtOH 선호도에서도 유사하게 나타난다. 연구자들은 또한 음주 세션이 시작된 후 처음 30-60분 경과 시점에 병의 무게를 측정함으로써 폭음과 유사한 EtOH 섭취 (E)를 측정할 수 있다. (F) 이는 종종 H2O에 비해 EtOH에 대한 높은 선호도와 관련이 있다. 음영이 있는 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다(n = 32, 수컷; n = 16, 암컷). 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: LIQ HDR는 높은 시간 해상도에서 섭취량을 정확하게 측정한다. LIQ HDR 시스템의 정밀도와 정확도는 부분적으로 다음과 같은 존재에 의해 확인된다. 쥐에게 투여한 날짜에 놓기 횟수와 병의 무게 변화 사이에 유의미한 정적 상관관계가 있음 (A) H2O 및 EtOH와 또한 (B) H가 들어 있는 두 병이 제공되는 날2O. (C) H군과 L군 간 음주 양상의 차이224시간 음주 기간 동안 O(파란색) 및 EtOH(주황색) 섭취는 평균 핥기 횟수를 30분 간격으로 구간 나누어 쉽게 평가할 수 있다. 삽입 그래프는 병 제공 후 처음 30분 동안(회색으로 강조됨) 5분 간격 구간별 평균 핥기 횟수를 나타내며, 이 기간 동안 쥐는 흔히 상당한 프론티로딩(fron-tloading) 행동을 나타낸다. 군 간 음주 양상의 차이는 이와 유사한 방식으로 분석할 수 있으며, 핥기 미세구조 분석을 통해 예시로 제시할 수 있다. (D) EtOH 및 (E) H2雄性 및 암성 쥐에서 24시간 동안의 주기 동안 나타낸 O. (F) 짧은 테스트 기간 동안에도 높은 시간 해상도로 음주 패턴을 평가할 수 있다. (G) 이 기간 동안 LIQ HDR은 정확하게 섭취량을 추적한다. (H) 예측 혈중 에탄올 농도(BEC)는 비교적 낮은 수준의 에탄올(EtOH) 섭취량에 대해서도 가능하다. 음영이 표시된 오차 막대는 ± SEM (각 성별 n = 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: 대표적인 음수 미세 구조 데이터. LIQ HDR은 음수 미세 구조의 측정값을 기록할 수 있게 해주며, 여기에는 (A) 핥는 횟수, (B) 음수 에피소드 수, (C) 에피소드 지속 시간 외에도, (D) 병의 무게 변화를 통해 총 수분 섭취량을 측정하는 기능이 포함된다. (E-H) 유사한 측정값은 에탄올에 대해서도 얻을 수 있다. 이러한 측정값들에 대한 군 간 비교를 통해 현재 예시와 같이 소비한 용액에 기반한 음수 전략의 성별 차이와 같은 뚜렷한 음수 패턴을 확인할 수 있다. 실선은 중앙값을, 점선은 사분위수를 나타낸다(각 성별 n = 6); 비연결 t-검정; *p < 0.05. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 마이크로컨트롤러 인터페이스 설정. (A) 전자 부품 및 배선도. (B) 하나의 LIQ HDR 시스템에 필요한 마이크로컨트롤러 인터페이스 제작을 위한 재료. (C) 정전식 터치 실드의 뒷면에서 백라이트 솔더 패드 사이에 솔더 점퍼를 추가한다. (D) 데이터 기록 실드의 뒷면에서 CS 핀의 점퍼 패드 트레이스를 절단한다(1). CS 핀에서 핀 #7까지 점퍼 와이어를 납땜한다(2). (E) 터치 실드를 기반으로 데이터 로거에 헤더 핀을 납땜한다. (F) 나머지 2x4 헤더를 마이크로컨트롤러에 장착하고(1), 데이터 로거를 마이크로컨트롤러 위에 적층한 후 헤더를 고정하여 납땜한다(2). (G) 동전형 배터리를 데이터 로거에 삽입한다(1), 터치스크린을 데이터 로거 위에 적층하고 SD 카드를 데이터 로거에 삽입한다(2). (H) 여분의 접지선을 만들기 위해 점퍼 와이어에서 한 개의 수형 커넥터를 잘라내고, 그 끝을 벗긴 솔리드 코어 와이어에 납땜한다. (I) 4핀 점퍼 와이어와 여분의 접지선을 마이크로컨트롤러에 연결하고(1), 핫글루로 고정한다(2). (J) 마이크로컨트롤러 인터페이스를 맞춤형 3D 프린팅 케이스에 장착한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

현재 프로토콜은 간헐적 액세스 2병 선택 홈 케이지 절차를 사용하여 에탄올 음주 데이터를 캡처하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이 방법은 비교적 쉽게 구현할 수 있으며 비용이 거의 또는 전혀 들지 않거나 특수 연구 장비가 필요하지 않습니다. 쥐에게 사용하기 위한 핥기 감지 시스템인 LIQ HDR을 구성하고 구현하기 위해 여기에 제공된 절차를 사용하여 연구자는 섭취 및 선호도에 대한 표준 측정 외에도 고해상도 음주 미세 구조 데이터를 캡처할 수 있습니다.

현재 프로토콜에 설명된 간헐적 접근 일정은 많은 대체 에탄올 접근 일정보다 더 높은 수준의 에탄올 섭취를 생성하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 널리 사용되는 절차입니다. 실제로, 이전 연구에서는 간헐적으로 접근하는 쥐가 24시간 연속 접근하는 쥐보다 일일 평균 에탄올 섭취량이 더 높은 것으로 나타났습니다 6,7. 그럼에도 불구하고 연구 질문 또는 기타 실험 설계 매개변수에 따라 다른 에탄올 접근 일정이 바람직할 수 있습니다. 연구원들은 병 켜기/끄기 시간과 요일을 변경하기만 하면 다양한 일정(예: 지속적인 접근, 어둠 속에서 마시기 등)을 수용하도록 현재 프로토콜을 매우 쉽게 수정할 수 있습니다.

두 병으로 마시는 것은 비교적 구현하기 쉬운 패러다임이지만 데이터 수집을 손상시킬 가능성이 있는 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서 실험자가 잠재적인 문제를 신속하게 식별하기 위해 매일 데이터를 검사하는 것이 중요합니다. 특히, 연구자들은 각각 새거나 막힌 시퍼를 나타낼 수 있는 병 무게의 매우 크거나 매우 작은 변화에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 이러한 문제의 징후를 조기에 포착하면 특정 주제의 모든 데이터가 분석에서 제외되는 것을 방지할 수 있습니다. 실제로, 연구자들이 24시간 동안 병 무게의 급격한 변화(또는 변화 없음)를 발견하면 새 병으로 간단히 전환하는 것만으로도 특정 병을 순환에서 제거해야 하는지 여부를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 이유로 여분의 병과 시퍼를 준비하는 것이 현명합니다. 그러나 일부 쥐는 자연적으로 매우 낮은 수준의 에탄올 섭취를 나타낸다는 점에 유의해야 합니다(예: 35). 이것은 특히 특정 계통의 쥐에게 해당되며, 검토를 위해8 을 참조하십시오. 따라서 주어진 실험에서 소수의 동물 개체군이 에탄올 소비량이 적거나 전혀 없는 경우 연구자는 놀라지 않아야 합니다. 마찬가지로, 일부 동물은 엎질러질 수 있는 방식으로 시퍼/병을 가지고 노는 경향이 있습니다. 드물기는 하지만 소비와 관련되지 않은 병 무게의 큰 변화가 반복적으로 발생하면 특정 동물을 실험에서 제거해야 할 수 있습니다.

우리의 상세한 단계별 프로토콜은 쥐를 위한 LIQ HDR 시스템의 구현 및 사용의 용이성을 보여줍니다. 마이크로컨트롤러 전자 및 프로그래밍에 대한 사전 지식이나 기술이 없는 연구원은 거의 또는 전혀 수정하지 않고도 이 시스템을 실험 요구 사항에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 쥐 가정 케이지 음주 연구에 대한 성공적인 적용과 높은 시간 해상도에서 수많은 음주 미세 구조 측정을 캡처하는 강력한 능력을 추가로 보여줍니다. LIQ HDR에는 이전 마우스30과 관련하여 몇 가지 디자인 수정이 포함되어 있습니다. 이는 쥐에 사용하기 위한 성공적인 적응을 위한 필요성뿐만 아니라 기능과 사용자 경험을 개선하기 위해 수행되었습니다. 3D 프린팅 병 홀더, 시퍼 차단기 및 전자 부품을 포함한 카이지 내 구성 요소는 씹는 것을 방지하기 위해 케이지 상단으로 재배치되며, 이로 인해 빈번하고 심각한 데이터 손실과 하드웨어 회전이 발생할 수 있습니다. 레이저 절단 아크릴 패널을 추가하면 이러한 취약한 구성 요소의 파괴를 방지하는 데 더욱 도움이 됩니다. 표준 신발 상자 쥐 케이지와 동일한 재질인 아크릴 패널을 제외하고 다른 모든 LIQ HDR 구성 요소는 동물이 케이지 내부에서 접근할 수 없거나 젖병을 교체하는 동안 잠시 동안만 접근할 수 있습니다. 이 설계는 비식품 섭취를 통해 장치 구성 요소가 파괴되고 동물에 대한 위험이 제한됩니다. LIQ HD 디자인에 사용되는 상대적으로 노동 집약적인 맞춤형 병과 달리 LIQ HDR의 3D 프린팅 병 홀더는 상업용 설치류 마시는 병과 호환되도록 설계되었습니다. 병은 케이지 상단에 설치되며 표준 관리 및 사육 중에 술병을 적용하는 것과 거의 동일한 방식으로 쥐가 접근할 수 있습니다. 시퍼 차단기의 추가는 시스템 신뢰성을 향상시키고 차단제가 없는 경우 Arduino 인터페이스에서 데이터 캡처를 시작하기 전에 발생하는 음주 또는 쥐가 일일 보정 중에 시퍼와 상호 작용할 때 발생하는 잘못된 핥기 측정으로 인해 발생할 수 있는 귀중한 데이터 손실을 방지하는 간단하지만 효과적인 솔루션입니다. 쥐 케이지가 상당히 커지면 원래 하드웨어 설계의 크기를 확장해야 하지만, 훨씬 더 긴 케이블을 사용하면 간섭으로 인해 정전 용량 감지의 감도와 정확도는 물론 데이지 체인 센서 보드와 Arduino 인터페이스 간의 I2C 통신의 무결성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 이더넷 케이블을 통해 초장거리, 거의 무손실에 가까운 신호 전송을 달성하기 위해 차동 I2C 통신 시스템을 채택하여 이 문제를 우회합니다. 인케이지 구성 요소에 사용된 재료는 사용 사이에 쉽게 청소하고 소독할 수 있습니다. 리코미터는 70% EtOH 용액으로 중성화 및 닦을 수 있으며, 전도성 구리 테이프와 같은 전기 부품이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 시퍼 차단기, 아크릴 패널 등 동물과 직접 접촉하는 비전기 장비는 따뜻한 비눗물로 철저히 씻을 수 있습니다.

핥기 감지 시스템의 신뢰성과 효율성을 위해서는 적절한 구성 및 설치는 물론 광범위한 테스트, 부지런한 오류 모니터링 및 효과적인 문제 해결이 필요합니다. 모든 DIY 구성 요소는 기술과 주의를 기울여 만들고 조립해야 합니다. 이는 초보자에게 연습이 필요할 수 있는 납땜과 관련된 단계에서 특히 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실제 실험에 사용하기 전에 모든 리코미터에 대한 광범위한 테스트가 필요합니다. 개별 실험 요구 사항에 적응하기 위해 시스템을 수정해야 하는 경우 정확한 핥기 감지를 위해 센서 설정(예: 터치 및 해제 임계값)을 추가로 미세 조정해야 할 수 있습니다. 처음 사용하는 사용자의 경우 높은 수준의 음주를 유발할 수 있는 매우 맛있는 솔루션을 사용하여 간단한 소량 샘플 파일럿 연구에서 시스템을 테스트하는 것이 좋습니다. 핥기 감지는 핥기가 등록될 때마다 LED가 깜박일 때 센서 보드를 육안으로 검사하여 실시간으로 확인할 수 있습니다. 핥는 횟수와 병 무게의 변화 사이의 강력하고 중요하며 일관된 상관 관계는 적절한 하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 벤치마크로 사용되어야 합니다. 설정이 완료된 후에도 실험 시작 시 명백할 수 있는 장비 문제를 해결하기 위해 쥐가 물이 들어 있는 두 병을 받는 날에 주어진 실험에 대한 기록을 시작하는 것이 좋습니다. 또한 케이지 교체와 관련된 물의 날에 리코미터 기능을 테스트하는 것이 유리할 수 있습니다. 동일한 리코미터에 대해 일관되게 매우 명백한 이상치 데이터(예: 병 무게의 상당한 변화에도 불구하고 핥기가 감지되지 않거나 거의 감지되지 않음)를 초래하는 개별 핥기 측정기 또는 센서의 무작위 고장은 결함이 있는 구성 요소를 나타냅니다. 필요에 따라 쉽게 교체할 수 있도록 리코미터 시스템의 각 요소에 대한 추가 구성 요소를 미리 준비하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 센서 케이블이 과도하게 겹치거나 구부러지지 않도록 하는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 그렇게 하면 주어진 병 무게 변화에 대해 불합리하게 낮은 핥기 횟수 또는 몇 분 또는 몇 시간에 걸친 매우 긴 핥기 시간(60,000분 쓰레기통의 경우 1ms에 가까움)으로 명백하게 나타나는 불량한 핥기 감지의 무작위 사례가 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 표준 또는 리코미터가 장착된 접근 방식을 사용하여 며칠에 걸쳐 많은 동물에 대해 24시간 이상 데이터를 수집하는 연구에서는 작은 데이터 손실이 불가피합니다. 연구자들은 병 무게 및/또는 핥기가 섭취량을 분명히 반영하지 않는 경우(예: 시퍼 막힘, 보정 오류 등) 드문 음주 세션에 대한 잘못된 데이터를 제외할 수 있습니다. 이와 같은 경우, 특정 피험자에 대한 연구 기간 동안 주어진 측정값(예: 섭취량(g/kg), 핥기 등)에 대한 평균값을 데이터 분석 중에 누락된 값으로 대체할 수 있습니다. 혼합 효과 ANOVA는 누락된 데이터 포인트를 수용하기 위한 대안으로 사용할 수도 있습니다.

두 병 선택 음주 패러다임의 장점 중 하나는 에탄올 섭취의 자발적인 측면입니다. 이것은 특히 실험자가 투여한 알코올이 자발적으로 자가 투여된 알코올과 비교하여 뇌 기능 및 행동에 상당히 다른 영향을 미칠 수 있음을 보여주는 연구 결과에 비추어 탁월한 얼굴 타당성을 제공합니다42. 더욱이, 패러다임의 자발적 특성으로 인해 연구자들은 인간에게서 관찰되는 알코올 선호도 및 음주 패턴의 가변성과 유사한 섭취량의 개인차를 포착할 수 있습니다. 이러한 개인차는 연구자가 소비(섭취 및/또는 패턴)를 관찰된 병리학적 효과의 크기와 연관시킬 수 있는 강력한 기회를 제공할 수 있습니다.

그럼에도 불구하고 2병 가정용 케이지 음주 패러다임의 몇 가지 한계를 고려해야 합니다. 예를 들어, 에탄올 섭취의 개인차는 일부 실험에서 유리할 수 있지만, 일관된 수준의 중독 또는 에탄올 노출이 바람직할 수 있는 다른 실험에서는 단점이 될 수 있습니다. 이것은 만성 에탄올 노출로 인한 의존성과 금단의 결과를 조사하는 실험에 특히 해당됩니다. 중요한 것은 두 병의 선택 음주는 장기간 에탄올에 접근할 수 있는 쥐에서도 의존성 모델로 특징지어지지 않는다는 것입니다. 따라서 수반되는 금단 증상이 없는 경우 연구자는 장기간의 에탄올 소비의 결과를 의존성 및/또는 금단의 영향으로 해석할 때 주의를 기울여야 합니다. 실제로, 그럴듯하지는 않더라도 2병 선택 절차 동안 상대적으로 많은 양의 에탄올을 마시는 쥐가 금단 증상을 나타내지만 주어진 24시간 동안 더 적은 양의 총 양을 마시는 쥐는 유사한 의존성 징후를 나타내지 않을 수 있습니다. 음주 패턴도 이러한 고려 사항에 중요한 역할을 할 수 있는데, 이는 24시간 동안 같은 양을 마시는 두 마리의 동물이 에탄올 섭취 패턴에 따라 크게 다른 수준의 중독(즉, BEC)을 경험할 수 있기 때문입니다22. 이는 주어진 용량의 에탄올을 빠른 속도(즉, 꿀꺽꿀꺽)로 소비하는 쥐와 훨씬 더 느린 속도(즉, 한 모금)로 동일한 용량을 소비하는 쥐를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 2병 선택 절차에서 LIQ HDR의 유용성을 강조합니다. 통제된 용량의 에탄올의 효과를 조사하는 연구에는 잠재적으로 바람직하지 않지만, 특정 실험적 개입 후 음주 패턴의 변화(예: 폭식 에피소드 감소)를 감지하는 것은 임상에서 점점 더 추구되고 있는 피해 감소 접근 방식을 고려할 때 상당한 번역 가치를 갖습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 것을 포함하여 동물이 가정 케이지 음주 패러다임에서 에탄올에 접근하기 위해 노력이 필요하지 않습니다. 따라서 이 패러다임의 유용성은 음주 분석에만 국한되는 반면, 연구자가 AUD의 중요한 특징인 알코올 탐색을 조사하는 데 관심이 있는 경우에는 조작적 방법이 선호됩니다.

요약하면, 여기에 설명된 프로토콜은 연구자에게 가정 가두 환경에서 쥐의 에탄올 섭취량을 측정하는 데 필요한 모든 정보와 자원을 제공합니다. 우리는 연구자가 연구 요구에 가장 적합한 방법을 선택할 수 있는 유연성을 제공하는 상대적으로 낮은 해상도 및 고해상도 접근 방식에 대한 옵션을 제시합니다.

공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 LIQ HDR 개발 중 기술 지원을 해준 Joseph Pitock과 Katie Przybysz 박사에게 감사를 표합니다. 또한 LIQ HDR을 개발하는 동안 많은 유익한 대화를 나눠준 Nicholas Petersen과 Marie Doyle 박사에게도 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 알코올 남용 및 알코올 중독에 관한 국립 연구소(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism)의 지원을 받았습니다(P50 AA022538 및 R01 AA029130 EJG).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
상용 구성 요소수량
12-Key 정전식 터치 센서 브레이크아웃(MPR121)Adafruit 19823
2핀 케이블 매칭 페어(JST XH 2.5mm 피치)Adafruit487218
4핀 브레드보드 점퍼(Qwiic)SparkFunPRT-179121
4핀 케이블(100mm Qwiic)SparkFunPRT-172591
4핀 케이블(50mm Qwiic)SparkFunPRT-172603
5V-3V 레벨 시프터 브레이크아웃Adafruit56371
정전식 터치 실드(2.8인치)Adafruit19471
구리 전도성 테이프(1/4인치)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
데이터 로깅 쉴드Adafruit11411
차동 I2C 통신 브레이크아웃 키트(QwiicBus)SparkFunKIT-172501
전기 테이프DigiKey3M156004-ND1
열수축 튜브(3/16인치 다양한 색상)케이블 타이 등HS357-S106
열수축 튜브 키트(4인치 블랙)Jameco20959631
리튬 코인 배터리 (3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5 플랫 와셔Grainger54FN661
M5 육각 너트Grainger6CA721
M5 기계 나사 (12mm)Grainger6GU881
M5 기계 나사 (25mm)Grainger  6GU912
수/수 점퍼 와이어Adafruit19571
마이크로컨트롤러 보드(Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
PETG 필라멘트(2.85mm 실버)MatterHackersM-DDH-UZR2
2 PLA 필라멘트(2.85mm 실버)MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLA 필라멘트(2.85mm 실버)MatterHackersM-66P-6CLE1
전원 공급 장치(DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
SD/microSD 메모리 카드(8GB)Adafruit12941
실드 스태킹 헤더Adafruit851
솔리드 코어 와이어(22AWG 빨간색)Adafruit2881
연선 코어선(22AWG 검정색)Adafruit29761
연선 와이어(22AWG 빨간색)Adafruit30681
볼이 있는 트위스트 캡 시퍼 튜브대체 디자인TCCN8.5-ST2.5SB38
물병(8oz)대체 디자인WB8FS38
사용자 정의 3D 인쇄 구성 요소수량
3D 인쇄 Arduino 케이스 바닥N/AARDUINO_Bottom.stl1
3D 프린팅 Arduino 케이스 상단N/AARDUINO_Top.stl1
3D 프린팅 케이블 클립 LN/ACLIP_L.stl18
3D 프린팅 케이블 클립 너트N/ACLIP_Nut.stl18
3D 프린팅 케이블 클립 RN/ACLIP_R.stl18
3D 프린팅 리코미터 병 홀더N/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3D 프린팅 리코미터 케이블 프로텍터 LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3D 프린팅 리코미터 케이블 프로텍터 RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3D 프린팅 리코미터 글자N/ALICKOMETER_Letters.stl19
3D 프린팅 마운트 스크류N/A마운트 스크류.stl4
3D 프린팅 센서 케이스 A 하단N/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 A 상단N/ASENSOR_A_Top.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 B 하단N/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 B 상단N/ASENSOR_B_Top.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 C 하단N/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 C topN/ASENSOR_B_Top.stl1
3D 프린팅 센서 케이스 글자N/ASENSOR_Letters.stl1
3D 프린팅 사이퍼 블로커N/ASIPPER_Blocker.stl36
3D 프린팅 사이퍼 블로커 베이스N/ASIPPER_Base.stl18
3D 프린팅 사이퍼 블로커 기어N/ASIPPER_Gear.stl18
3D 프린팅 사이퍼 블로커 너트N/ASIPPER_Nut.stl18
3D 프린팅 사이퍼 블로커 웜N/ASIPPER_Worm.stl18
레이저 컷 리코미터 아크릴 패널N/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
개 개 개

참고문헌

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