방법 논문

In vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델 시스템

DOI:

10.3791/67487

⸱

2025년 3월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 in vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델의 적용을 개략적으로 설명합니다. 특히, 설명된 모델 시스템은 구강 건강 대 질병의 맥락에서 생물막(치석)과 관련된 미생물에 노출된 다층 구강 상피를 사용합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitro에서 상피 또는 점막 장벽에서 숙주-병원체 인터페이스를 재현하는 것은 감염 생물학자에게 어려운 전망으로 남아 있습니다. 자체 배양된 2D 상피 단층은 생체 내 상황을 정확하게 나타내지 못하지만, 상업적으로 이용 가능한 조직 모델은 비용과 실용성으로 인해 종종 간과됩니다. 그러나 신중한 계획을 통해 이러한 모델은 다양한 응용 분야에 대해 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 여기에서 우리는 구강, 피부 및 질 점막과 같은 다양한 생태학적 틈새에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위해 다양한 실험 목적으로 활용될 수 있는 상피 모델의 사용을 보고합니다. 단순한 플랑크톤 세포에서 복잡한 생물막 공동 배양에 이르기까지, 상피 모델은 미생물 부착 및 침입을 평가하고 전사 및/또는 단백질 수준에서 숙주 반응을 평가하는 데 사용되며, 다양한 오믹스 접근법을 사용하여 보다 상세한 프로파일링을 수행할 수 있습니다. 또한, 이러한 생물학적 시스템은 복잡한 숙주-병원체 미세환경에서 시험관 내에서 기존 및 새로운 항균 활성을 평가하기 위한 보다 정확한 테스트 베드로 사용할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 모델이 도착 시 처리되고 생물막 군집과의 공동 배양 자극을 위해 실험실에서 준비되는 방법을 문서화합니다. 이 방법은 조직 처리, 공동 배양 설정 및 데이터 생성을 포함하여 모델 시스템에서 실험 결과를 얻는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 실험에는 단일 및 다중 qPCR 분석을 통한 숙주 유전자 발현과 ELISA를 사용한 염증 단백질 검출이 포함됩니다. 결론적으로, 상피 모델은 단순하거나 복잡한 숙주-병원체 상호 작용에 대한 전임상 조사 연구에 유용한 체외 시스템을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

체외 모델 시스템은 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 우수한 테스트 베드를 제공합니다. 이러한 유기형 시스템은 미생물 교란에 취약한 다양한 생태학적 틈새의 미시환경을 재현하는 것을 목표로 합니다. 구강 1,2,3,4,5, 피부 장벽 6,7,8,9,10,11 및 질 점막 5,12,13에서 숙주-병원체 상호 작용을 평가하기 위해 EpiSkin(구 SkinEthic) 조직 모델을 사용하여 많은 연구 논문이 발표되었습니다 , 그 중에서도14,15. 미생물에 노출된 상피 세포주의 단층을 사용하는 "2차원" 또는 "2D" 세포 배양과 달리, 상업적으로 이용 가능한 이 모델은 공기-액체 계면에서 성장한 여러 층의 분화된 세포로 구성됩니다. 2D 배양 시스템은 더 저렴하고 종종 재현성이 더 높은 것으로 간주되지만, 미생물로 배양할 때 세포 손상이 발생하기 쉬우며, 이는 생체 내에서 상피 또는 점막 장벽을 항상 정확하게 나타내는 것은 아닙니다 16,17.

최근의 증거에 따르면 "3차원" 또는 "3D" 배양 기술이 암 과학, 줄기 세포 연구 및 약물 발견을 포함한 다양한 과학 분야에서 점점 더 대중화되고 있습니다16,18. 감염 생물학의 맥락에서 3D 조직 모델은 통제된 체외 미세환경 내의 상피 또는 점막 장벽 인터페이스에서 숙주-박테리아, 곰팡이 또는 혼합 종 상호 작용에 대한 조사에 활용될 수 있습니다. 이러한 모델은 2D 배양 시스템에 많은 이점을 가지고 있으며, 병원성 유기체 또는 복잡한 생물막 군집에 의한 조직 집락화 및/또는 침입을 평가할 수 있으며(17), 2D 모델이 전사 또는 단백질체학 프로파일에 의해 제한되는 다양한 바이오마커에 대한 다중 구성 요소 수준에서 숙주 반응을 평가할 수 있습니다 16,17,18. 궁극적으로 이러한 3D 시스템의 전임상 응용 분야는 방대하며 생체 내 모델 또는 임상 연구로 발전할 수 있는 중요한 탐색 데이터를 제공합니다.

구강 건강 및 질병의 맥락에서 구강 점막 표면과 관련된 염증 경로를 이해하는 것은 치료 방식을 지시할 수 있기 때문에 임상의에게 중요합니다. 이전 연구에서는 "건강 관련된" 생물막이 최소한의 염증 반응을 이끌어낼 수 있음을 보여주었습니다 3,19,20,21. 이는 구강 건강과 관련된 낮은 미생물 바이오버든으로 인해 발생하거나 널리 면역 조절로 간주되는 연쇄상구균(Streptococcus spp.)과 생물막의 구성으로 인해 발생할 수 있습니다22,23. 다른 한편으로는, Fusobacterium nucleatum 및 Porphyromonas gingivalis와 같은 질병 관련 미생물로 구성된 생물막은 본질적으로 전 염증성입니다3 , 20 , 24 , 25 , 26 , 27 . 2020년 Mountcastle et al.의 검토에서는 구강 미세환경에 대해 당시 존재했던 모든 관련 공동 배양 모델을 설명했습니다17. 이러한 유기형 모델은 풍부하고28,29 이후 여러 가지가 생산되었지만 이러한 3D 모델을 만드는 것과 관련된 여러 가지 도전적인 장애물이 남아 있습니다. 몇 가지 예를 들자면, 이러한 모델은 상당한 최적화가 필요하며 제작하는 데 매우 노동력과 자원 집약적입니다. 재현성은 주의 깊게 제어되지 않는 한 매우 가변적일 수 있습니다16,17. 상업적으로 이용 가능한 모델은 이러한 문제를 우회하여 구강 내 및 인체의 다른 생태학적 틈새에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

요약하자면, 현재 프로토콜은 구강 건강 및 질병의 맥락에서 체외에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델의 적용을 개략적으로 설명하는 것을 목표로 합니다. 구체적으로, 설명된 모델 시스템은 구강 염증성 질환인 치은염을 대표하는 정의된 생물막 군집에 노출된 다층형 상업적으로 이용 가능한 구강 상피를 사용합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 프로토콜은 총 7 종 (spp.) 7,30을 포함하는 치은염을 대표하는 다종 생물막의 제조를 포함합니다. 구강 건강을 모방하기 위해 3개의 연쇄상구균 종, 연쇄상구균 진드기(NCTC 12261), 연쇄상구균 중간구균(DSM 20753) 및 구강연쇄상구균(NTCC 11427)이 포함되어 타액 표선의 초기 식민지 형성자 역할을 합니다. 구강 건강에서 질병으로의 전환과 관련된 4가지 혐기성 미생물이 다음으로 추가되었습니다: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) 및 2개의 Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) 및 Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) 빈첸티(DSM 19507). 관련된 모든 단계는 화염 또는 클래스 II 안전 캐비닛에서 무균 방식으로 수행됩니다. 미생물 제제에 사용되는 모든 배지 및 인산염 완충 식염수(PBS)는 사용 전에 고압멸균되며, 프로토콜 기간 동안 정기적으로 무균 상태를 평가합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 공동 배양을 위한 미생물 군집 준비

참고: 이 프로토콜은 치은염이라고도 하는 잇몸 조직의 염증과 관련된 컨소시엄을 대표하는 다종 생물막의 생성을 묘사합니다. 이러한 모델은 앞서 설명한 바와 같이 구강 건강 및 질병에서 숙주 반응을 평가하는 데 사용되었습니다3.

  1. -80°C 에서 보관된 미생물을 함유한 다공성 구슬(상업적으로 입수한)의 냉동 재고에서 혈액 한천 플레이트(5% 멸균 제세균 말 혈액을 포함하는 Columbia Blood Agar 베이스)에서 세 가지 연쇄상구균 종을 모두 되살립니다.이것은 접종 루프와 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 달성됩니다.
    1. 37 °C, 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 다음 3-4개의 콜로니를 분리하여 10mL의 Tryptone Soya Broth 배지로 증식시킵니다. 37 °C, 5 % CO2에서 16-18 시간 동안 배양 국물.
  2. 중간 병원체의 경우 V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum 및 F. nucleatum subspp.를 되살립니다. vincentii 는 37 ° C에서 48 시간 동안 5 % 멸균 제세균 말 혈액을 함유 한 까다로운 혐기성 한천 기지에 혐기성으로, 동일한 조건에서 추가로 24-48 시간 동안 Schaedler의 국물에서 배양하기 전에.
  3. 성장 후, 3000 x g에서 20 °C에서 5 분, 20 ° C 동안 원심 분리에 의한 펠렛 세포 현탁액, 그런 다음 10 mL의 멸균 PBS (pH 7.2-7.6)에서 펠릿을 세척합니다. 3000 x g에서 20°C, 5분 동안 원심분리 를 통해 펠렛 셀 현탁액을 다시 주입한 다음 두 번째 세척 단계를 반복합니다. 표준화를 위해 세척된 세포를 10mL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
  4. 550nm에서 분광광도계를 사용하여 3개의 연쇄상구균 종을 모두 개별적으로 표준화합니다. 0.50의 흡광도 값(허용 가능한 0.45-0.55 범위)은 이전에 Miles 및 Misra 세포 계수 기법31을 사용하여 측정한 바와 같이 ~1 x 108 cells/mL의 세포 수를 나타냅니다. 이 흡광도 판독값을 얻으려면 세척된 세포 현탁액 10mL를 멸균 PBS에서 더 희석합니다.
  5. 표준화 후, Todd Hewitt Broth(THB) 및 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지의 1:1 혼합물에서 모든 Streptococcus spp. 1:10 - 1 x 107 cells/mL를 희석합니다. 직경 13mm의 하이드록시아파타이트 디스크가 들어 있는 24웰 마이크로타이터 조직 배양 플레이트에 피펫팅을 통해 500μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 생물막을 37 °C, 5 % CO2에서 24 시간 동안 성숙시킵니다.
    참고: 다종 생물막은 법랑질, 상아질32 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 의치 표면33,34와 같은 다양한 구강 관련 기질에서 성장할 수 있습니다. 인공 또는 합성 타액과 같은 대체 매체도 이러한 모델에 사용할 수 있지만, 사용된 미생물의 컨소시엄에 따라 신중하게 고려해야 합니다: 연구에 따르면 성장 배지 선택은 혼합 군집 생물막 성장에 중요한 영향을 미친다고 합니다35,36.
  6. 다음날, 위와 유사한 방식으로 4개의 혐기성 미생물을 표준화합니다(단계 1.2-1.4). 펠렛 세포 현탁액을 두 번 세척한 다음 V. dispar 를 0.50 흡광도(0.45-0.55 범위)로 표준화하고 나머지 3개의 미생물을 0.20 흡광도(0.18-0.22 범위)로 표준화합니다. 표준화가 완료되면 THB와 RPMI를 1:1 비율로 혼합하여 모든 현탁액을 1:10에서 1 x 107 cells/mL로 더 희석합니다.
  7. 부착되지 않은 세포와 사용한 배지를 조심스럽게 제거하고 피펫팅을 통해 연쇄상구균 생물막에서 폐기합니다. 마이크로타이터 플레이트 웰을 4개의 혐기성 물질의 표준화된 1 x 107 cells/mL 현탁액 500 μL로 교체합니다. 37°C에서 혐기성 조건에서 24시간 동안 생물막을 배양합니다.
  8. 24시간 후, 7종의 생물막에서 부착되지 않은 세포와 사용한 배지를 제거하고 500μL의 멸균 1:1 THB:RPMI 배지로 교체합니다. 생물막은 37°C에서 4일 동안 혐기성으로 성숙하도록 방치하고, 매일 배지를 제거하고 보충합니다(총 4번의 배지 교체).
  9. 7일차에는 다종 생물막이 완전히 성숙되어 다운스트림 실험을 할 준비가 됩니다. 공동 배양에 사용하기 위해 500μL의 멸균 PBS로 바이오필름을 두 번 세척합니다.
    참고: 생물막은 qPCR(조성 평가용) 및 앞서 설명한 바와 같이 컨포칼 또는 전자 현미경을 사용한 현미경 프로파일링과 같은 다양한 생물학적 방법론을 사용하여 프로파일링할 수 있습니다3.

2. 유기형 조직 취급 및 실험 설정

참고: 아래에 설명된 실험 설정은 불활성 폴리카보네이트 멤브레인 필터에서 배양된 TR146 세포로 구성된 인간 구강 상피(HOE) 조직을 포함합니다. 표피 모델, 방광, 식도, 각막, 치은 및 질 상피를 포함한 다른 모델이 있습니다. 모든 모델은 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위해 아래에 설명된 것과 유사한 방식으로 처리 및 준비됩니다.

  1. 도착하면 포장을 풀고 HOE 티슈와 미디어를 클래스 II 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 조직과 함께 제공된 총 1mL의 유지 관리 배지를 12웰 플레이트에 추가합니다.
  2. 운송에 사용되는 24웰 플레이트와 영양 한천에서 멸균 핀셋이 포함된 HOE가 포함된 폴리카보네이트 인서트를 제거하고 배지가 포함된 12웰 플레이트로 옮겨 조직 아래에 기포가 남아 있지 않도록 합니다. 인서트의 측면이나 바닥에 부착된 여분의 한천은 추가 핀셋이나 티슈 페이퍼를 사용하여 조심스럽게 제거되었는지 확인합니다.
  3. 선적 후 실험실 조건에 적응하기 위해 실험 설정 전에 37°C, 5% CO2 에서 24시간 동안 조직 모델을 배양합니다. 조직 모델의 더 긴 유지 관리 또는 추가 성숙을 위해 추가 유지 배지 또는 성장 배지를 사용할 수 있다는 점은 주목할 만합니다.
  4. 이제 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 여기에 제공된 예의 경우, 초음파 처리에 의해 기질에서 위와 같이 생성 된 7 종 생물막 (단계 1.1-1.9)을 제거합니다. 이를 위해 19G 니들과 핀셋을 사용하여 24웰 플레이트 하단에서 바이오필름이 포함된 HA 디스크를 제거한 다음 1mL의 멸균 Dulbecco's PBS가 들어 있는 비쥬를 옮깁니다. 초음파 처리 수조에서 35kHz에서 10분 동안 초음파 처리합니다.
  5. 하룻밤 동안 핀셋을 사용하여 조직 모델을 포함하는 삽입물을 조심스럽게 제거하고 피펫팅을 통해 100μL의 생물막 초음파 현탁액을 조직에 직접 추가합니다. 비교 목적으로 자극되지 않은 대조 조직을 사용합니다. 이러한 대조 조직 삽입물의 경우 생물막 현탁액이 없는 멸균 Dulbecco의 PBS 100μL를 추가합니다.
    참고: 플랑크톤 세포, 분산된 세포를 포함하는 사용된 생물막 상등액 또는 전체 생물막은 생물막 초음파 처리 대신 공동 배양 모델에 사용할 수 있습니다. 다양한 미생물 자극제를 사용하는 이러한 숙주-병원체 모델에 대한 다양한 응용 분야는 3,5,6,8,13,37,38에 문서화된 바와 같이 그림 1에 도식화되어 있습니다.
  6. 추가 후 1mL의 새로운 유지보수 매체가 들어 있는 다른 12웰 플레이트로 인서트를 옮기고 인서트 아래에 기포가 없는지 다시 확인합니다. 다운스트림 적용을 위해 조직 처리 전에 37°C에서 24시간, 5% CO2 동안 조직 모델이 포함된 플레이트를 배양합니다.
    참고: 조직 공급업체는 초음파 처리된 응집체 또는 생물막에 노출된 후 조직의 지속적인 배양을 지원하기 위해 추가 배지를 제공할 수 있습니다. 이를 위해 장기간의 조직-생물막 접종을 조사하는 여러 이전 모델이 발표되었습니다 21,28,39. 현재의 유기형 모델을 사용하여 유사한 결과를 얻으려면 조직을 초음파 처리하고(위와 같이, 2.6단계) 미생물이 24시간 동안 부착되도록 둡니다. 남아 있는 미생물 현탁액을 버리고 필요한 실험 시간 과정 동안 공기-액체 계면에서 배양을 계속합니다.

3. 실험적 출력물을 위한 조직 처리

참고: 공동 배양 후 조직 모델은 실험 결과를 위해 처리됩니다. 다음 단계는 전사 프로파일링을 위해 조직에서 RNA를 추출하는 방법과 단백질 검출을 위해 사용된 조직 배지를 사용하는 방법을 문서화합니다. 조직은 또한 앞서 설명한 바와 같이 조직학적 평가를 위해 포르말린, 파라포름알데히드 또는 유사한 고정제에 고정될 수 있습니다 3,6.

  1. 먼저, 1%의 β-메르캅토에탄올과 ~100μL의 0.5mm 산 세척 유리 비드를 포함하는 2.0mL 스크류 캡 O-링 튜브에 350μL의 RLT 용해 완충액을 준비합니다.
  2. 핀셋을 사용하여 매체에서 조직을 포함하는 삽입물을 제거하고 삽입물에 남아 있는 미생물 현탁액을 모두 버립니다. 다음으로, 편하게 하기 위해 거꾸로 눈높이를 잡습니다. 19G 바늘을 사용하여 인서트 바닥에서 조직과 멤브레인을 조심스럽게 잘라 RLT 버퍼로 옮깁니다.
    1. 벤치탑 비드 비터 균질화기를 사용하여 30초에 조직을 균질화한 다음 RNA 추출 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 용해물에서 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
      참고: 추출된 RNA는 cDNA 합성에 사용되어 정량적 PCR(qPCR) 또는 RNA 염기서열분석을 사용하여 염증 마커로서 사이토카인 및 케모카인 유전자의 발현을 프로파일링합니다. qPCR은 특정 유전자에 대한 기성 프라이머가 있는 웰을 포함하는 RT2 PCR 프로파일러 어레이 또는 자체 설계된 프라이머 염기서열 및 뉴클레아제가 없는 ddH2O3가 있는 SYBR 그린 기반 시약과 같은 멀티플렉스 어레이를 사용하여 달성됩니다.
  3. ELISA, 다중 면역 분석 또는 다중 단백질 바이오마커 분석과 같은 저처리량 및 고처리량 방법론을 사용하여 단백질체 분석을 위해 남은 사용 조직 배지(~850-900 μL)를 수집합니다7.
  4. 사용한 조직 배지를 사용하여 단백질 수준에서 염증과 관련된 다양한 마커를 평가합니다. 사용한 배지는 위의 방법론에 직접 사용하거나(3.3단계) -20°C 또는 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 이러한 분석을 위해 매체의 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.
    참고: ELISA를 사용한 정확한 단백질체 프로파일링을 위해 조직 자극제에 따라 배지를 1:10으로 희석해야 할 수도 있습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 실험에서는, HOE는 구강 건강에서 잇몸의 염증에 교대의 대표자를 포함하는 7 종 biofilm sonicate에 드러냈습니다 (치은염으로 알려져 있는). 이 질병은 치아 표면에 치태가 쌓여 발생하는 미생물 교란으로 인한 치은 또는 구강 상피 조직의 염증으로 인해 발생합니다. 자극 후, 조직 및 사용된 배지는 위에서 논의한 바와 같이 전사 및 단백체 분석에 사용됩니다. 이 실험을 위해 염증성 바이오마커 패널의 유전자 발현은 생물막 초음파 처리로 자극 후 조직에서 검출되었습니다(그림 2). 이는 16개의 서로 다른 유전자를 포함하는 맞춤형 RT2 PCR 프로파일러 어레이를 사용하여 달성되었으며, 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대한 정상화 후 자극되지 않은 조직에 대한 접힘 변화로 나타났습니다. 미생물 자극은 CXCL5를 제외한 모든 유전자의 발현을 증가시켰으며, NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B 및 TLR4 에서 통계적 차이가 나타났습니다(그림 2A). CCL2, CXCL1 및 CSF3에서 각각 16.9, 10.3 및 15.1의 증가로 가장 큰 폴드 변화가 관찰되었습니다(그림 2B).

사용한 HOE 배지는 자극 후 조직에서 생성 및 방출되는 단백질을 검출하기 위한 단백질체학 분석에 사용되었습니다. 이는 유전자 발현이 단백질 생산과 상관관계가 있는지 확인하는 데 유용합니다. 이를 위해 대조 조직 및 생물막-초음파 자극 조직에서 IL8 유전자 발현 및 IL-8 단백질 방출을 평가했습니다(그림 3). 유전자 발현은 앞서 설명한 바와 같이 IL8 및 GAPDH에 대한 프라이머와 함께 SYBR-green 기반 qPCR을 사용하여 평가되었습니다3. HOE에서 IL8 mRNA 발현은 생물막 초음파 처리로 자극한 후 8.67배 증가했습니다(그림 3A). 단백질 수준에서 IL-8 수준은 IL-8 ELISA 키트를 사용하여 정량화되었습니다. 사용된 배지에서 IL-8의 농도는 대조 조직에서 ~1.005ng/mL에서 생물막-초음파 자극 조직에서 ~4.245ng/mL로 증가했습니다(그림 3B).

figure-results-1
그림 1: 유기형 조직 공동 배양 모델의 다양한 응용 분야. 미생물의 표준화된 현탁액을 조직에 직접 적용하여 종-숙주 상호 작용을 조사합니다(A). 이들은 종종 단기간(예: <24시간) 동안 미생물 집락화를 평가하는 데 사용됩니다. 복잡한 생물막을 초음파 처리하여 분산된 세포 또는 생물막 응집체가 조직(B)에 미치는 영향을 조사합니다. 이것은 이전에 그러한 세포가 플랑크톤 또는 생물막 대응물과 비교하여 독특한 표현형을 가지고 있음을 보여주었기 때문에 중요합니다. 이를 위해 온전한 생물막을 더 작은 삽입물을 추가로 사용하여 조직에 직접 추가하여 숙주(C)와 인접한 노출을 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 플랑크톤 세포를 적절한 배양 배지의 조직에 첨가하여 조직의 미생물 집락화, 생물막 형성 및 성장 역학을 평가합니다(D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2 : 7 종 생물막 초음파 처리로 자극 후 HOE 조직의 유전자 발현.mRNA 발현 폴드 변화는 총 15 개의 염증성 유전자 인 GAPDH로 정규화 된 HOE 조직 제어, 자극되지 않은 샘플 및 100 μL의 7 종 생물막 초음파 처리 (A)에 노출되었습니다. mRNA 발현에서 가장 높은 변화를 보이는 3개의 유전자(CCL2, CXCL1, CSF3)는 (B)에 나타나 있습니다. 통계적 분석은 파라메트릭 비쌍체 T-검정을 사용하여 수행되었으며, 각각 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 유의미한 변화가 나타났습니다. 데이터는 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯되고 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: HOE 조직에서 생성되는 IL8 유전자 발현 및 IL-8 단백질 수준. ELISA 방법론(B)을 사용하여 사용한 조직 배지에서 정량화된 SYBR-green 기반 qPCR(A) 및 IL-8 단백질 수준에 의해 측정된 HOE 조직에서 IL8의 mRNA 발현 폴드 변화. 통계적 분석은 모수적 쌍체를 이루지 않은 T-검정을 사용하여 수행되었으며, 각각 *p < 0.05 및 ****p < 0.0001로 유의미한 변화가 나타났습니다. 데이터는 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯되고 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 미생물 자극 후 숙주 반응을 평가하기 위해 HOE 조직과 공동 배양하기 위한 치은염을 대표하는 복잡한 다종 생물막 모델을 생성하는 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜은 플랑크톤 세포, 단일, 이중 또는 혼합 종 생물막 또는 인체의 다양한 생태학적 틈새의 상피 조직과 생물막 분산 세포 간의 숙주-병원체 상호 작용을 조사하는 데 사용하도록 조정할 수 있습니다. 숙주-병원체 상호작용을 조사하기 위한 조직 모델의 사용은 상피 조직에 여러 세포층을 포함하는 생체 내 상황을 항상 정확하게 재현하지 않는 2D 단층으로 제한되는 이전의 공동 배양 시스템에 중요한 발전을 제공합니다 16,17,18. 또한, 다층 조직 모델의 체외 성장과 관련된 문제는 여러 세포주의 사용 및/또는 오염되기 쉬운 공기-액체 계면에서 세포층의 성장과 관련하여 많습니다. 상업적으로 이용 가능한 조직은 이전 간행물 3,7에서 볼 수 있듯이 복제물과 배치 간에 비교할 수 있는 일관되게 고품질 모델을 갖춘 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

"공동 배양을 위한 미생물 군집 준비" 섹션의 경우, 구강 건강에서 질병으로의 전환과 관련하여 일반적으로 확인된 공생 및 병원체를 기반으로 7종 치은염 모델에 대한 이러한 미생물의 포함이 선택되었습니다. 모든 복잡한 생물막 모델 시스템인 in vitro와 마찬가지로, 미생물의 포함은 건강하거나 병든 특정 생태학적 틈새와 관련된 마이크로바이옴 연구에 의해 지시됩니다. 이를 위해 당사와 다른 연구자들은 공생 미생물(예: 연쇄상구균 및 Rothia spp.)을 포함하는 구강 건강 관련 생물막 모델의 사용을 보고했습니다.3,40,41. 더욱, 다른 질병과 관련되었던 biofilms를 창조하기 위하여 이 모형에 추가 병원체는 추가될 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 설명된 7종에 3개의 미생물을 추가하여 치주염3과 관련된 질병 모델을 만들 수 있으며, 진균 병원균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 추가하여 다미생물성을 증가시키고 왕국 간 복잡성(interkingdom complexity) 층을 추가할 수 있습니다33. 실제로, 곰팡이-박테리아 상호 작용을 촉진하는 것은 박테리아 전용 생물막과 비교할 때 시험관 내에서 이러한 생물막 모델을 사용하여 다양한 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다42. 궁극적으로, 이러한 연구를 위한 새로운 다종 생물막 모델을 만들 때 신중하게 고려하는 것이 좋습니다. 포함된 미생물은 광범위한 문헌 검색을 통해 쉽게 식별할 수 있어야 하지만, 대부분의 틈새 및/또는 질병의 경우 여러 가지 이유로 복잡한 in vitro 모델에 잘 통합되지 않을 수 있습니다. 다음은 고려해야 할 몇 가지 다른 잠재적 고려 사항을 보여 줍니다.

생물막 형성 역학
생체 내 생물막 형성은 종종 특정 미생물에 의한 초기, 중간 및 후기 집락화를 포함합니다. 치은상 및 치은하 치판 형성은 선구적인 종(예: 연쇄상구균 종)에 의해 법랑질에서 발견되는 타액 펠리클의 초기 부착을 크게 특징으로 하며, 중간 및 후기 병원체는 이를 집락화를 위한 골격으로 필요로 합니다43. 세균성 질염 중 질 환경에서도 유사한 현상이 제안되었는데, Gardnerella vaginalis가 초기 집락화자인 것으로 여겨지고, 그 다음에는 혐기성 세포가 뒤따르는 것으로 여겨진다44. 그러나 다른 생태학적 틈새에 있는 다른 질병의 경우에는 그렇지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

각 미생물에 대한 파종밀도
미생물은 in vitro에서 배양될 때 다양한 크기 및/또는 성장 역학을 갖습니다. 따라서 표준화 과정에서 이를 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, C. albicans는 박테리아 세포45,46의 100-150배 크기이므로 이러한 생물막 모델에 더 낮은 농도, 예: 1 x 106 cells/mL로 첨가하는 것이 정당화될 수 있습니다.

종 적대감
이러한 모델에 활용된 일부 미생물(동일한 종이지만 다른 분리물, 실험실 및/또는 임상 균주 포함)은 생물막 형성 중에 다른 미생물과 경쟁할 수 있으며, 이는 일부 미생물 종의 성장을 억제할 수 있습니다47. Sadiq 등의 연구는 미생물의 다양한 조합이 미생물 시너지 효과(또는 길항작용)로 인한 생물막 바이오매스에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 강조했습니다48. 생물막 모델 내에서 이러한 상호 작용을 조사하는 것은 연구 그룹에게 관심이 있을 수 있지만(예: 사전 또는 프로바이오틱스 처리 테스트), 다른 사람들은 모델을 생성할 때 다중 종 복잡성에 영향을 미칠 수 있는 이러한 길항성을 설명하지 못할 수 있습니다.

생물막 성숙 기간
생물막 성숙 기간을 최적화하는 것은 포함된 미생물의 성장 역학과 배양에 사용되는 모델 시스템(하층 포함)에 따라 달라질 수 있으므로 최적화하는 것이 중요합니다. 성숙 시간이 길어지면 후기 병원체에 대한 집락화가 더 좋아질 수 있지만 모델 내에서, 특히 초기 집락화자의 세포 사멸이 더 많을 수 있습니다. 반대로, 숙주에 대한 미성숙한 생물막 모델의 영향을 조사하려는 경우 더 짧은 배양 시간이 중요할 수 있습니다. Brown 등의 연구는 동일한 10종 상처 생물막 모델이 24시간, 48시간 및 72시간 동안 성숙했을 때 인간 THP-1 세포에서 어떻게 다른 염증 프로필을 가졌는지 설명했으며, 생물막이 덜 성숙할수록 더 친염증적임을 시사합니다7. 다층 조직 모델에서도 유사한 결과를 관찰할 수 있습니다. 또한 생물막에서 세포 사멸을 최소화하기 위해 매일 규칙적인 배지 교체가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요하지만, 이는 예를 들어 장기간의 항균 중재의 효과를 평가하는 경우와 같은 지속적인 치료 요법에 따라 수정될 수 있습니다.

"유기형 조직 취급, 실험 설정 및 조직 처리" 섹션의 경우 연구원의 필요에 따라 배양 기간을 조정할 수 있습니다. 숙주-병원체 상호 작용은 연구 질문에 따라 더 이른 시점(예: 1-12시간)에서 48시간 및 72시간의 이후 시점까지 조사할 수 있습니다. 둘째, 항생제를 함유한 모든 유지 매체가 공급됩니다. 따라서 실험 설계에 따라 이러한 제거를 주문하는 즉시 회사에 요청해야 합니다. 삽입물 아래의 배지가 조직의 상부 주변부와 직접 접촉하지는 않지만, 모델 6,8에서 상처가 발생하지 않는 한, 조직으로의 미생물 침입을 조사하는 경우 항생제의 제거를 고려할 가치가 있습니다.

공동 배양 자극에 사용되는 미생물 물질은 위에서 논의한 바와 같이 플랑크토닉, 사용된 생물막 상층액(여과 및 여과되지 않음), 전체 생물막 또는 조직과의 생물막 초음파 배양을 평가하는 범위로 변경할 수도 있습니다. 예를 들어, EpiSkin에서 제공하는 것과 같은 조직 모델이 플랑크톤 곰팡이-숙주 상호 작용을 조사하는 데 유용한 모델을 제공한다는 이전 증거는 C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur 및 Trichophyton rubrum 세포가 HOE, Reconstructed Human Epidermis(RHE) 또는 Human Vaginal Epithelium의 말초 조직층에 부착되어 상호 작용하는 것으로 나타났으며, 이러한 연구 중 일부는 숙주 반응의 자극을 보여주었습니다 곰팡이 감염 후 1,5,6,11,12,49. 박테리아와 숙주의 상호작용에 대한 유사한 논문이 존재하는데, 예를 들어, 비듬의 두피 미생물군과 관련된 흔한 병원균인 쿠티박테리움 여드름(Cutibacterium acnes)의 생물막 형성이 단독으로 배양되고 곰팡이 피부 유기체인 Malassezia restricta10과 함께 배양될 때 RHE의 표면에서 연구되었습니다. 다른 연구자들은 포도상구균(Staphylococcus spp.)이 RHE에 부착하는 능력을 조사하여 이러한 박테리아-숙주 상호작용의 물리화학적, 미생물학적 특성을 측정했습니다50. N'Diaye와 공동 저자는 인간 유래 뉴로펩타이드인 Calcitonin Gene-Related Peptide가 RHE 조직 모델51에서 황색포도상구균 독성에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다. 다른 연구자들은 인간 각막 상피14의 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 감염에 대한 프로바이오틱스 중재의 보호 효과를 조사했다. 한편, 다미생물 관점에서, 다른 그룹은 다른 조직 기질에 대한 혼합 종 생물막의 효과를 연구했습니다 2,3,7,13.

전반적으로 위에서 언급한 이러한 프로토콜과 연구는 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델의 광범위한 응용 분야를 문서화합니다. 연구에 따르면 EpiSkin 모델, 특히 RHE 피부 모델은 화장품의 부식/자극을 테스트하는 데 우수한 적용 가능성을 가지고 있지만 52,53,54,55 이러한 모델과 실제 생체 외 조직 이식 또는 상업적으로 이용 가능한 조직의 다른 공급업체 사이에는 몇 가지 제한이 있습니다 56,57. 한 가지 명백한 한계는 상업적으로 이용 가능한 모든 조직 모델이 무균, "무균" 환경의 세포주에서 생성된다는 것인데, 이는 조직이 미생물 섭동에 노출된 적이 없다는 것을 의미한다: 이것은 생체 내에서 또는 생체 외 조직 이식의 자극 후에 볼 수 있는 것을 훨씬 넘어 숙주에서 모든 염증 반응을 악화시킬 수 있다57. 반대로, 이러한 실험실 모델 시스템에는 생체 내 조직과 연관시킬 수 있는 기본 연결층 또는 혈관 구조, 생체 외 조직 이식 중에 보존될 수 있는 특성 및 염증 반응에 영향을 미치는 특징이 포함되지 않습니다. 실제로, 최근의 체계적 문헌고찰에서는 생체 재료를 포함한 다양한 공학 기술을 사용하여 생성된 적절한 혈관 구조를 가진 조직 모델을 활용하기 위해 신중한 고려가 이루어져야 한다고 강조했다58. 예를 들어, 최근의 한 연구에서는 치은 섬유아세포와 미세혈관 내피 세포가 내장된 피브린 기반 매트릭스를 사용하여 혈관화된 치은 조직 등가물을 생성했습니다. 저자들은 건강 또는 질병 관련 미생물에 노출된 후 모델에서 차별적인 염증 반응을 설명했다59. 상업적인 관점에서는 표피와 겹쳐진 섬유아세포로 구성된 진피로 구성된 전체 두께의 조직을 포함하는 "T-Skin 모델"과 같은 더 복잡한 모델이 존재합니다. 이러한 복잡한 모델을 표피만 있는 시스템과 어떻게 비교되는지 보는 것은 흥미로울 것입니다.

완벽한 모델은 없지만, 유기형 조직 모델은 동물 연구를 수행할 때 대체(Replacement), 축소(Reduction), 개선(Refinement)이라는 3R로 요약된 프레임워크에 부합하는 전임상 테스트를 위한 유망한 대안을 나타냅니다. 이를 위해 동물 모델은 생물막 관련 인간 질병의 복잡한 병태생리학적 특성에 대한 중요한 통찰력을 제공하지만 명백한 단점이 있습니다. 이러한 3D 모델은 쉽게 조작할 수 있으므로 윤리적 승인 없이 조사에 대한 크고 미묘한 변경이 가능합니다. 이러한 모델을 위에서 설명한 기존의 복잡한 생물막 시스템과 결합하면 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해를 크게 향상시키고 생체 내 조사 전에 새로운 치료법의 성공을 더 잘 예측할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Saeed Alqahtani가 설명된 조직 모델과 관련된 관련 프로젝트를 수행할 수 있도록 자금을 지원한 Haleon과 Muhanna Alshehri의 박사 학위 자금을 지원한 사우디아라비아 교육부에 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
13 mm 하이드록시아파타이트 (HA) 디스크Plasma Biotal Limitedn/a (주문 제작)치아 표면을 모방한 구강 생물막 형성을 위한 기질
19 G 바늘 (40 mm) VWR613-2028플레이트에서 HA 디스크를 제거하고 삽입물에서 조직을 잘라내는 데 사용됩니다
24 웰 TC 처리된 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트와 뚜껑이 있습니다 과학 실험실 용품3524 (100개 팩)생물막 배양 및 조직 공동 배양 실험용 플레이트
산성 세척 유리 구슬 (425-600 μ m)Merck: Sigma-AldrichG8772RNA 추출의 수율을 향상시키기 위한 조직 용해용   
방선균 naeslundii DSM 17233 Leibniz Institute DSMZn/a복합 생물막 모델에 사용되는 미생물 중 하나
Bead Mill 24 Homogenizer (또는 동급) Fisher Scientific15-340-163RNA 추출의 수율을 향상시키기 위한 조직 용해를 위해   
비쥬  (7mL)Greiner Bio-One189170 (백당 700개)생물막 초음파 처리에 사용   
cDNA 합성 키트 (고용량)Thermo Fisher Scientific4368814 (200회 반응용)조직 RNA
Columbia Blood Agar (CBA) 베이스에서 cDNA 합성 Thermo Fisher ScientificCM0331B (500g용)호기성 미생물 배양을 위한 CBA 플레이트를 준비하는 데 사용
제세된 말 혈액E& O LaboratoriesDHB호기성 및 혐기성 미생물 배양을 위한 CBA 및 FAA 플레이트를 보충하는 데 사용
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS: CaCl2 및 MgCl2)생물막 초음파 처리와 세포 공동 배양을 위한Sigma-AldrichDB537
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953American Type Culture Collectionn/a복합 생물막 모델에 사용되는 미생물 중 하나
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn/a복합 생물막 모델에 사용되는 미생물 중 하나
GraphPad Prism (Version 10)GraphPad Software, Incn/a그래프 생성 및 데이터 분석용 
Human IL-8 ELISA kit (플레이트가 있는 비코팅 ELISA 키트)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (10 x 96 테스트용)사용한 조직 매체의 단백질 평가를 위한 ELISA 키트 및 플레이트
Human Oral Epithelium (HOE) Episkinn/a (made to order)공동 배양 모델 시스템에 사용되는 상피 조직
접종 루프 (일회용, 10 µ L 또는 이에 상응하는 것) Fisher Scientific12870155 (1000개 팩)고체 및 액체 매체에서의 미생물 배양을 위한
MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR 플레이트 (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific4346907 (10 플레이트용)조직의 qPCR 유전자 발현 프로파일링
마이크로뱅크 비드Pro-Lab DiagnosticsPL.170미생물의 저장 및 보존 
ThermoFisher ScientificAM9935 (10 x 1.5 mL)RT-PCR 등급 물, qPCR 실험용 물 
페트리 접시 (90mm)Fisher Scientific (Sterilin) 11309283 (500개 팩)미생물 배양을 위한 한천 플레이트 준비에 사용
인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific 18912014 (100정 팩)미생물 표준화 및 생물막 세척 단계를 위한 PBS
Rneasy 미니 키트Qiagen74106 (250 반응용)조직 기반 RNA 추출 키트 
Roswell Park Memorial Institute 1640 미디엄Merck: Sigma-AldrichR7755-10L (10L용) 생물막 배양을 위한 미디어 
RT2 프로파일러 어레이Qiagen330171 (맞춤형)qPCR 어레이는 유전자 발현 프로파일링을 위한 준비된 프라이머를 포함하고
Schaedler anaerobe agar baseMerck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (for 500 g)Fastdious Anaerobic Agar plates를 준비하는 데 사용됩니다.
Schaedler 혐기성 육수Thermo Fisher Scientific CM0497B (500 g용)혐기성 미생물 성장을 위한 액체 매체
Screw-cap Beadbug O-Ring tube Scientific Laboratory SuppliesZ763837-1000EA (1000개 팩)Bead Mill 24 homogenizer에서 사용, 용해 조직
초음파 처리 목욕Fisher Scientific (Fisherbrand)n/aHA 디스크에서 생물막의 초음파 처리용 
연쇄상구균 intermedius DSM 20753 Leibniz Institute DSMZn/a복합 생물막 모델에 사용된 미생물 중 하나
Streptococcus mitis NCTC 12261National Collection of Type Culturesn/a복합 생물막 모델에 사용된 미생물 중 하나
Streptococcus oralis NTCC 11427 National Collection of Type Culturesn/a복합 생물막 모델에 사용되는 미생물 중 하나
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12SYBR-green mix for qPCR 
Todd Hewitt 국물Merck: Sigma-AldrichT1438 생물막 배양을 위한 미디어 
Tryptone soya broth (TSB) mediumMerck: Sigma-Aldrich22092 (for 500 g)액체 매체 에어로빅 미생물 성장을 위한
Tweezers (150 mm, 스테인리스 스틸, 톱니 모양)RS-Pro 545-187HA 디스크 및 조직 삽입물/조직 추출물을 이동하는 데 사용됩니다.
튜브  (30mL)Greiner Bio-One201150 (400개/백)액체 배양에서 미생물을 배양하기 위한 용기 
Veillonella dispar NCTC 11831National Collection of Type Culturesn/a'복합 생물막 모델에 사용되는 미생물 중 하나
&베타;-메타캅토에탄올Merck: Sigma-AldrichM3148RNase 조직 샘플에서
. Merck: dPBS 있습니다. 범용 비활성화

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

qPCR

관련 논문