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방법 논문

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

1.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67490

⸱

2025년 1월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

초록

염기서열분석을 통한 Transposase-Accessible Chromatin 분석(ATAC-seq)은 염색질 접근성을 평가하고 후성유전체 조절을 이해하기 위한 강력한 고처리량 기술입니다. 면역 반응에서 중요한 백혈구 유형인 호중구는 분화 및 활성화 과정에서 상당한 염색질 구조적 변화를 겪으며, 이는 기능에 필요한 유전자 발현에 상당한 영향을 미칩니다. ATAC-seq는 호중구 성숙의 주요 전사 인자를 밝히고, 병원체 특이적 후성유전체 시그니처를 밝히고, 자가면역 질환에 대한 치료 표적을 식별하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 외부 환경에 대한 호중구의 민감성은 고품질 ATAC-seq 데이터 생성을 복잡하게 만듭니다. 여기에서는 설치류 골수 유래 호중구로부터 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 확장 가능한 프로토콜을 제안하며, 최적의 세포 생존력과 고품질 라이브러리를 보장하기 위해 향상된 면역자기 분리를 특징으로 합니다. 라이브러리 품질에 영향을 미치는 중요한 요소와 방법론적 확장을 위한 최적화 원칙에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 호중구의 염색질 구조 및 후성유전체 재프로그래밍을 연구하고자 하는 연구자를 지원하여 기초 및 임상 면역학 연구를 발전시킬 것입니다.

서론

호중구는 척추동물에서 가장 풍부하고 중요한 면역 세포 유형 중 하나로, 인간 백혈구의 50%-70%를 차지합니다1. 호중구는 숙주에서 미생물을 감지하고 제거하는 데 중심적인 역할을 합니다. 패혈증 중에는 성숙한 호중구가 첫 번째 반응자중 하나입니다 2. 이들은 화학주성(chemotaxis)3을 통해 감염 부위로 빠르게 이동하며, 여기서 미생물을 섭취하고(식세포작용(phagocytosis), NADPH 산화효소 의존성 활성산소종(NADPH oxidase-dependent reactive oxygen species)을 생성하고(호흡기 파열), 과립을 분비하고(탈과립화), 염증 부위에 도착한 세포외 박테리아를 잡아 죽이는 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap, NET)을 형성함으로써 병원체와 싸운다4. 미성숙 호중구는 또한 케모카인에 의해 골수에서 말초 순환으로 빠르게 동원됩니다 5,6. 감염 부위에 유인된 이러한 호중구는 또한 사이토카인을 방출하는데, 이는 조혈, 혈관 신생 및 상처 치유와 같은 여러 생리학적 과정에 관여합니다 7,8. 호중구 수가 감소하는 선천성 질환 또는 후천성 질환을 앓고 있는 환자는 감염에 더 취약하다 9,10. 그러나 호중구 활성화는 양날의 검입니다. 과도한 활성화와 사이토카인 방출은 조직과 장기 손상을 유발할 수 있으며, 감염을 즉시 통제하지 않으면 다발성 장기 기능 장애를 유발할 수 있다11,12. 또한 호중구는 다양한 염증성 질환 및 자가면역 질환에 기여하며 암 진행과 전이에 영향을 미칠 수 있습니다13,14. 이는 효과적인 면역 반응의 균형을 유지하고 숙주에 대한 손상을 방지하기 위해 호중구 활동 조절을 연구할 필요성을 강조합니다.

호중구에서 염색질 구조는 분화, 이동 및 활성화에서 뚜렷하고 역동적인 변화를 겪으며 세포 수명 전반에 걸쳐 중추적인 조절 역할을 합니다. 크고 둥글며 유크로마틴이 풍부한 골수모세포의 핵에서 골수구와 메타골수구의 더 움푹 들어간 핵으로, 그리고 다형성핵 호중구에서 조밀하게 채워진 염색질로 고도로 소엽화된 C 또는 S 모양의 띠 내 세포에 이르는 이 여정15,16은 호중구 생물학의 복잡성에 대한 증거입니다. 특화된 염색질 배열은 효과적인 병원체 제거에 필요한 과립 생산 및 빠른 전사 반응에 관여하는 유전자와 같이 호중구 기능에 필수적인 유전자의 선택적 발현을 보장합니다17. 호중구가 화학주성을 통해 염증 부위로 동원될 때, 경내피 이동은 핵골격/세포골격 복합 링커(LINC) 복합체에 압력을 가하여 염색질 재형성과 더 많은 활성화 가능성을 촉진합니다18. 패혈증에서 활성화된 호중구는 이중핵 또는 비엽핵과 같은 비정상적인 염색질 형태와 현저히 느슨한 염색질 응축과 함께 "핵-좌측 이동"을 나타냅니다19. 그 결과 염증 반응과 관련된 유전자 영역 내의 접근성이 높아져 이러한 유전자의 유의미한 발현을 유도할 수 있습니다. 감염이 적절하게 통제되지 않는 경우, 히스톤 시트룰린화(histone citrullination)와 그에 따른 염색질 해체(chromatin deconstruction)가 NET을 형성하는 데 필요하다20,21. 따라서 호중구 염색질 구조를 이해하는 것은 호중구 생물학을 발전시키고 염증성 질환 및 자가면역 질환 치료법을 개발하여 향후 질병 치료에 대한 희망을 제공하는 데 매우 중요합니다.

염색질 접근성은 후성유전체(epigenomic) 수준에서 염색질 구조에 대한 지표 역할을 합니다. 이는 게놈 영역이 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter), 절연체(insulators) 및 염색질 결합 인자(chromatin-binding factor)에 어떻게 물리적으로 허용되는지, 그리고 이러한 요소가 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지를 나타냅니다22. 염기서열분석을 통한 전이효소 접근 가능 염색질 분석(ATAC-seq)은 게놈23 전반에 걸쳐 염색질 접근성을 평가하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 조절 요소에 대한 사전 지식이 필요하지 않으므로 후성유전학 연구를 위한 강력한 도구입니다. 이 방법에는 샘플의 핵을 분리하고, 트랜스포사제 Tn5에 의한 게놈 DNA 단편화, 라이브러리 준비, 염기서열분석 및 데이터 분석을 위한 염기서열분석 프라이머를 추가하는 것이 포함됩니다23. ATAC-seq는 뉴클레오솜 매핑, 전사 인자 결합 분석, 다양한 세포 유형 또는 질병의 조절 메커니즘, 새로운 인핸서 식별, 바이오마커 발견 등을 연구하는 데 중요한 역할을 했습니다22,23. 유전자 발현의 포괄적인 분석을 위해 RNA 염기서열분석과 같은 다른 기술과 결합되는 경우가 많습니다.

ATAC-seq는 건강과 질병에서 정확한 후성유전학적 메커니즘을 밝혀냄으로써 호중구 생물학에 대한 지식을 발전시켰습니다. 이를 통해 호중구 성숙 및 효과기 반응에서 몇 가지 주요 전사 인자(즉, RUNX1, KLF6, PU.1 등)가 밝혀졌고24,25, 패혈증에서 바이오마커 가능성이 있는 병원체 특이적 시그니처를 밝혀냈으며26, 선천성 면역 기억12의 후성유전체 메커니즘을 규명하고, 소아 급성 골수성 백혈병(AML)27의 치료 표적을 확인했습니다. 그러나 면역 감시에서 두드러진 세포 구성 요소인 호중구는 외부 환경에 대한 민감도가 높기 때문에 고품질 ATAC-seq 데이터를 생성하는 데 어려움을 겪습니다. 생리학적 상황에서 인간 호중구의 평균 반감기는 3.8일인 것으로 보고된 반면 마우스 호중구의 평균 반감기는 12.5시간입니다. 시험관 내에서 연구할 때 반감기가 상당히 짧다는 것은 주목할 만합니다 28,29. 분리된 호중구의 체외 작동 중 미생물 또는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)에 노출되고 중복 실험 절차 및 가혹한 수술로 인해 비정상적인 호중구 활성화가 발생하고 세포사멸 또는 NETosis로 인해 세포 생존력이 감소할 수 있습니다. 죽은 세포는 일반적으로 Tn5에 매우 취약한 상당한 양의 염색되지 않은 DNA를 수용하고 있으며, 결과적으로 ATAC-seq23의 배경 잡음을 높입니다.

여기에서는 설치류 골수 샘플에서 유래한 호중구에 최적화된 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 확장 가능한 프로토콜을 제안합니다. 그림 1 은 골수에서 호중구의 면역자기 분리와 ATAC-seq를 포함하는 프로토콜의 그래픽 개요를 보여줍니다. 개선된 면역자기 분류는 ATAC-seq 라이브러리의 핵을 추출하기 전에 호중구의 최적 생존력을 보장하여 라이브러리의 고품질을 보장하고 추가 호중구 평가를 계획에 쉽게 통합할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜의 구현은 연구자들이 다양한 미세환경 문제에 노출될 때 호중구의 염색질 구조 특징과 후성유전체 재프로그래밍 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이는 기초 및 임상 면역학 연구에서 광범위하게 적용될 것으로 예상됩니다.

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프로토콜

아래에 제시된 모든 동물 절차는 중국 베이징 캐피탈 의과대학 동물관리 연구 윤리위원회(sjtkl11-1x-2022(060))에서 승인한 국가 윤리 및 동물 복지 지침 및 규정을 준수했습니다.

1. 골수 세포(BMC) 현탁액의 준비

  1. 체중이 19-21g인 6-8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 선택합니다. CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시킨 다음 깊은 반사가 사라진 후 경추 탈구를 수행합니다. 해부 매트에 70% 에탄올 스프레이로 소독하십시오.
  2. 작은 가위와 집게를 사용하여 고관절과 경골에서 대퇴골을 조심스럽게 분리하고 부착된 피부와 골격근을 제거한 다음 10cm 페트리 접시에 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 대퇴골을 헹굽니다.
  3. 대퇴골단을 잘라내고, 2mL 주사기에 부착된 28G 바늘을 골수강에 부드럽게 삽입하고, 2% 소태아혈청(FBS)을 함유한 차가운 PBS로 골수를 씻어냅니다.
  4. 플러시된 짙은 빨간색 액체가 반투명하게 변할 때까지 이전 단계를 반복합니다. 일반적으로 세 번의 플러시가 필요합니다.
    참고: 최적의 세포 획득을 위해 바늘을 골수강에 너무 깊게 삽입하지 마십시오.
  5. 70μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브(5mL)로 여과합니다.
  6. BMC의 적혈구를 폴리포름알데히드가 없는 상업용 적혈구 용해 완충액으로 용해합니다.
    1. 튜브를 500 x g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거하고 바닥에 약 100μL의 액체를 남긴 다음 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 느슨하게 합니다.
    2. 적혈구 용해 완충액에서 희석한 용해 완충액 2mL(10회)를 넣고 튜브를 거꾸로 3회 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 500 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버리고 부드럽게 두드려 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
    3. 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지로 세포를 두 번 세척하고 2mL 용량으로 재현탁합니다.
      참고: 흩어지지 않은 세포 덩어리를 처리할 때는 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하는 대신 200μL 피펫 팁을 사용하여 선별하는 것이 좋습니다. 이 방법은 세포 손실을 줄일 수 있습니다.
  7. 트리판 블루 염색으로 세포 생존율과 샘플당 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.

2. anti-Ly6G 마그네틱 비드를 사용한 호중구의 면역자기 라벨링

  1. 10% FBS를 함유한 2mL의 RPMI 1640 배지에 골수 세포(마우스당 ~2 x 10,7 개의 살아 있는 세포)를 재현탁하고 500 x g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리를 합니다.
    참고: ATAC-seq에 대한 1 x 105 세포의 제한된 요구 사항을 감안할 때, 잉여 호중구는 동일한 마우스에서 얻은 호중구를 사용하여 추가 후성유전체 분석(예: ChIP-seq 및 Hi-C) 또는 면역 기능 평가(예: 사이토카인 생성, 식세포작용 및 NET)에 할당할 수 있습니다.
  2. 약 100μL를 남기고 대부분의 상층액을 흡입하고 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 느슨하게 합니다.
  3. 30μL의 Ly6G 비드를 추가하고 부드럽게 두드려 BMC와 혼합합니다.
    알림: 마그네틱 비드는 사용하기 전에 최소 10초 동안 와류를 사용해야 합니다. BMC에 비드를 추가한 후에는 와류를 자제하는 것이 좋습니다.
  4. 튜브를 25°C에서 15분 동안 배양합니다.
  5. PBS 2mL를 첨가하여 비드와 세포를 재현탁시킨 다음 25°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.
  6. 약 100μL를 남기고 대부분의 상층액을 흡입하고 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 느슨하게 합니다. 1mL의 최종 부피에 대해 PBS를 추가합니다.
    참고: 흩어지지 않은 세포 덩어리를 처리할 때는 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하는 대신 200μL 피펫 팁을 사용하여 선별하는 것이 좋습니다. 이 방법은 세포 손실을 줄일 수 있습니다.

3. 면역자기 세포 분류를 통한 호중구 분리

  1. MS 컬럼을 PBS로 전처리합니다.
    1. MS 컬럼을 호환 가능한 MACS(magnetic-activated cell sorting) 분리기의 자기장 내에 배치합니다. MS 컬럼에서 배출되는 유체 아래에 비어 있는 5mL 튜브를 배치합니다.
    2. 500μL의 PBS로 컬럼을 헹굽니다. PBS가 MS 컬럼으로 완전히 흐른 후 이 단계를 반복합니다.
      참고: PBS는 MS 컬럼을 통해 5mL 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브로 한 방울 한 방울 서서히 흐르도록 해야 합니다. 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 컬럼에 공기가 들어가지 않도록 하십시오.
  2. 한 번에 500μL를 추가하여 자기 라벨이 부착된 BMC 현탁액을 MS 컬럼에 적용하고, 컬럼 저장소가 비워지면 즉시 다시 채웁니다.
    알림: 세포 현탁액에 세포 덩어리가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우, MS 컬럼 아래에 새로운 5mL FACS 튜브를 배치하여 이 단계 전에 라벨링되지 않은 세포(예: 단핵구 및 림프구)를 수집합니다.
    알림: 액적 유속을 기록해 두십시오. 느린 유속은 정렬 열이 막혔음을 나타낼 수 있습니다.
  3. reservoir가 비워질 때마다 500μL의 PBS를 추가하고 이 과정을 두 번 반복하여 MS 컬럼을 세척합니다.
    참고: PBS를 조기에 추가하면 특정 세포가 분류 컬럼에 진입하는 것을 방해하여 세포 분류의 순도를 손상시킬 수 있습니다.
  4. 자기적으로 표지된 호중구를 수집합니다.
    1. 컬럼 저장소가 고갈되면 자기장에서 컬럼을 제거하고 5mL 튜브에 조심스럽게 배치합니다.
      참고: 컬럼을 제거하기 전에 프로세스 중 액적 배출로 인한 호중구 손실을 방지하기 위해 컬럼 내에 잔류 액체가 없는지 확인하십시오. 컬럼의 잔류 물은 피펫을 사용하여 제거 할 수 있습니다.
    2. PBS 2mL를 컬럼에 분주한 다음 플런저를 즉시 단단히 밀어 자기적으로 표지된 호중구를 배출합니다.
      참고: 충분한 호중구를 얻으려면 적절한 용리 부피를 확인하고 플런저를 컬럼에 밀어 넣을 때 짧게 유지하십시오.
  5. 혈구계를 사용하여 분리된 세포를 열거합니다. 분류후 세포 현탁액 100 μL를 취하여 유세포 분석법으로 분석하여 분리된 호중구의 순도를 확인합니다.

4. 핵 추출

  1. 호중구가 포함된 50,000개의 단일 세포 현탁액을 0.2mL 튜브에서 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
  2. 50μL의 예냉각된 용해 완충액( 표 1 참조)에 호중구를 재현탁하고, 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 혼합한 후 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 샘플 부피가 5μL 미만인 경우 용해 버퍼를 직접 추가할 수 있습니다. 세포 현탁액 농도는 1 x 107 cells /mL를 초과하지 않습니다.
  3. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용한 다음 상층액을 버리고 핵을 수집합니다. 후속 절차를 시작하기 전에 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
    알림: 샘플 손실을 최소화하려면 펠릿이 축적되는 튜브 벽의 측면을 표시하고 상등액을 제거할 때 반대쪽에서 액체를 부드럽게 흡입합니다.

5. 트랜스포사제(transposase)를 사용한 뉴클레오솜 테더링(tethered) 태깅

  1. DNA Library Prep Kit( 표 2 참조)의 지침에 따라 중합효소연쇄반응(PCR) 튜브에 Tn5 transposase를 함유한 Tagmentation Reaction Mix를 준비하고 냉장 앰플리콘 정제 비드를 25°C에서 최소 30분 동안 예열합니다.
  2. 50 μL의 태그 부착 반응 혼합물로 호중구 핵을 재현탁하고 피펫으로 부드럽게 교반한 후 휴대용 원심분리기(~2600 x g)를 사용하여 5초 동안 원심분리합니다.
  3. 37°C의 PCR 기기에서 반응관을 30분 동안 배양합니다.
  4. 100 μL의 pre-vortexed amplicon purification beads를 lysate에 첨가한 다음, 10회 위아래로 피펫팅하여 자성 beads를 용액에 완전히 혼합합니다.
    참고: 마그네틱 비드는 끈적거리며 피펫 팁에 쉽게 부착될 수 있으므로 비드를 옮길 때 적절한 부피를 흡입하고 팁에서 천천히 분배해야 합니다.
  5. 반응 튜브를 25°C에서 5분 동안 배양한 다음 휴대용 원심분리기(~2600 × g)로 5초 동안 원심분리합니다.
  6. 용액이 투명해질 때까지(약 5분) 반응 튜브를 마그네틱 랙에 올려 중단된 DNA 단편을 정제합니다. 그런 다음 자성 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  7. 매번 갓 준비한 80% 에탄올 200μL로 마그네틱 비드를 세척하고 반응 튜브를 마그네틱 랙에 30초 동안 보관합니다. 에탄올을 추가할 때 비드를 방해하지 마십시오. 5.7단계에 설명된 절차를 반복합니다.
  8. 휴대용 원심분리기(약 2600 × g)로 반응 튜브를 원심분리하고, 10 μL 피펫 팁으로 에탄올을 흡입한 다음, 뚜껑을 열면서 마그네틱 비드를 3-5분 동안 건조시킵니다.
    참고: 마그네틱 비드의 건조 시간은 습도 수준의 변화로 인해 지역에 따라 다를 수 있습니다. 구슬은 광택을 잃을 때까지 건조해야 합니다. 과도하게 건조하면 용리 공정이 복잡해질 수 있으며, 부적절한 건조로 인해 알코올 잔류물이 발생하여 후속 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 마그네틱 랙을 수평으로 배치하면 마그네틱 비드의 균일한 건조에 더 도움이 됩니다.
  9. 마그네틱 랙에서 반응 튜브를 제거한 후 26 μL의 ddH2O를 추가하여 마그네틱 비드를 덮고 위아래로 피펫팅하여 철저한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 25°C에서 2분 동안 배양합니다.
    알림: 마그네틱 비드가 과도하게 건조된 경우 배양 기간을 적절하게 연장하십시오.
  10. 휴대용 원심분리기(약 2600 × g)로 반응 튜브를 간단히 원심분리하고 용액이 투명해질 때까지(약 5분) 마그네틱 랙을 사용하여 마그네틱 비드를 분리합니다.
  11. 24μL 상층액을 새 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

6. 차세대 염기서열분석(NGS)을 위한 라이브러리 구축

  1. 염기서열분석 어댑터를 포함하는 정제된 DNA 단편 및 프라이머를 사용하여 멸균된 튜브에서 PCR 반응 혼합물을 준비합니다( 표 3 참조).
  2. 권장 절차( 표 4 참조)에 따라 PCR 반응을 수행하며, 일반적으로 약 1시간이 소요됩니다.
    참고: 이 절차 후에 실험이 일시적으로 중단될 수 있으며 PCR 산물은 -20°C 또는 최소 2주에 보관할 수 있습니다.
  3. 27.5 μL의 pre-vortexed amplicon 정제 비드를 50 μL의 PCR 산물에 첨가한 다음 10회 위아래로 피펫팅하여 자성 비드를 용액에 완전히 혼합합니다.
    참고: PCR 산물에 대한 마그네틱 비드의 잘못된 비율로 인해 분류된 단편의 길이가 일치하지 않을 수 있습니다. ddH2O를 사용하여 PCR 산물의 증발된 부피를 50 μL로 채웁니다. 적절한 부피의 마그네틱 비드를 흡입하고 피펫 팁에서 천천히 분배하여 부착될 수 있는 비드를 최소화합니다.
  4. 반응 튜브를 25°C에서 5분 동안 배양한 다음 휴대용 원심분리기(약 2600 x g)로 5초 동안 원심분리합니다.
  5. 용액이 투명해질 때까지(약 5분) 반응 튜브를 마그네틱 랙에 올려 라이브러리 DNA를 정제합니다. 그런 다음 상등액을 새 멸균 PCR 튜브에 조심스럽게 옮기고 마그네틱 비드를 버립니다.
  6. 50 μl의 pre-vortexed amplicons purification beads를 상층액에 첨가한 후, 10회 위아래로 피펫팅하여 자성 beads를 용액에 완전히 혼합합니다.
  7. 반응 튜브를 25°C에서 5분 동안 배양한 다음 휴대용 원심분리기(약 2600 x g)로 5초 동안 원심분리합니다.
  8. 용액이 투명해질 때까지(약 5분) 반응 튜브를 마그네틱 랙에 놓은 다음 마그네틱 비드를 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
  9. 매번 새로 준비한 80% 에탄올 200μL로 마그네틱 비드를 두 번 세척하고 반응 튜브를 마그네틱 랙에 30초 동안 유지합니다. 에탄올을 추가할 때 비드를 방해하지 마십시오.
  10. 뚜껑을 열면서 마그네틱 비드를 5분 동안 건조시킵니다.
  11. 마그네틱 랙에서 반응 튜브를 제거한 후 22μL의 ddH2O를 추가하여 마그네틱 비드를 덮고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 25°C에서 5분 동안 배양합니다.
  12. 휴대용 원심분리기(약 2600 × g)로 반응 튜브를 간단히 원심분리하고 용액이 투명해질 때까지 마그네틱 랙을 사용하여 마그네틱 비드를 분리합니다(약 5분).
  13. 20μL 상등액을 새 멸균 PCR 튜브에 조심스럽게 옮기고 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 보다 집중된 길이 분포를 가진 라이브러리를 얻으려면 겔 회수 키트를 사용하여 증폭된 산물을 분류하는 것이 좋습니다. 또는 길이 분포 범위에 대한 특정 요구 사항이 없는 경우, 길이 분류 없이 마그네틱 비드 또는 컬럼 정제 키트를 사용하여 증폭된 산물을 직접 정제할 수 있습니다.

7. 도서관 품질 관리 및 시퀀싱

  1. DNA 단편 분석기 플랫폼을 활용하여 라이브러리 DNA의 길이 분포를 평가합니다.
  2. NGS 플랫폼을 활용하여 품질 검사를 통과한 라이브러리에 대해 고처리량 염기서열분석을 수행합니다.

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결과

요약된 프로토콜은 C57BL/6 마우스의 골수에서 호중구를 분리하고 ATAC-seq를 통한 리포다당류(LPS) 자극 전후 염색질 접근성의 각각의 차이를 비교하기 위해 사용되었습니다. 일반적으로 6-8주 된 C57BL/6 마우스의 양쪽 대퇴골에서 2 x 107 BMC를 채취할 수 있으며, 그 후 2-5 x 106 호중구를 분리할 수 있습니다. 그 중 1 x 105 세포는 ATAC-seq에 사용되며, 잉여 세포는 종합적인 호중구 분석을 위해 할당될 수 있습니다.

면역자기 분류 후 호중구 순도와 생존력을 결정하기 위해 FACS 면역표현형분석이 채택되었습니다(그림 2). 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A)의 분포만으로도 추정치를 제공할 수 있지만, 여기서는 분류 효과를 입증하기 위해 특정 호중구 마커 염색을 사용했습니다. FSC-A 및 SSC-A 게이...

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토론

이 원고는 설치류 골수 샘플에서 유래한 호중구에 최적화된 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 실험 프로토콜을 보고합니다. 호중구는 면역 세포에 매우 민감하고 쉽게 활성화되는 면역 세포이기 때문에 최적화 노력은 분리된 호중구의 생존력을 유지하는 데 우선순위를 두었습니다. 부적절한 치료는 NETosis 및 다른 형태의 세포 사멸로 이어질 수 있으며, 상당한 양의 염색되지 않은 DNA의 방출을 촉진하여 배경 잡음에 기여할 수 있습니다23. 핵 추출 전에 절차를 간소화하고 폴리포름알데히드가 없는 적혈구 용해 완충액을 선택했습니다. 말초 혈액 샘플과 대조적으로, 최소한의 적혈구는 적혈구 용해 완충액을 사용한 BMC의 짧은 잠복기를 필요로 하며, 적혈구의 완전한 용해를 보장하면서 호중구의 손실을 효과적으로 최소화합니다. 불필요한 자극을 최소화하기 위해서는 BMC로 배양하기 전에 모든 시약을 37°C로 예열하고 최대한 주의하여 취급...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 베이징시 교육위원회(KZ202010025041)의 R&D 프로그램과 베이징 중국의학연구소(Chinese Institutes for Medical Research, 베이징)의 보조금으로 지원되었다(보조금 번호. CX24PY29).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4% Trypan BlueScientificT10282
1x 인산염 완충 식염수BiosharpBL302A
20 bp– 5000 bp 정렬 마커바이옵틱C109102-100ADNA 단편 분석기 지원 제품
5k 크기 마커(표준 50 bp 사다리)바이옵틱C109101-100ADNA 단편 분석기 지원 제품
Amplicons Purification BeadsBeckmanA63881Amplicons Purification Beads는 고품질 DNA 제품을 얻기 위한 핵산 정제 키트입니다.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mousemiltenyi130-120-337Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, 마우스는 마우스 골수의 단세포 현탁액에서 마우스 호중구의 양성 선택 또는 고갈을 위해 개발되었습니다.
안티 마우스 CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
안티 마우스 CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
안티 마우스 Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J 마우스, 와일드 타입, 8주령, 수컷실험실 동물 과학 연구소, 중국 의학 아카데미실험실 동물 과학 연구소, 중국 의학원 Sciences
DNA Separation BufferBiopticC104406DNA 절편 분석기 지원 제품
E. coli 유래 초순수 LPS(serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
DNA 정량 시약vazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt는 간단하고 민감하며 정확한 이중 가닥 DNA(dsDNA) 형광 정량 분석 키트입니다.
Erythrocyte lysis buffer (10x)BioLegendCat#420301
Fetal bovine serumGibcoCat#10099141C
MS 분리 컬럼miltenyi130-042-201MS 컬럼은 세포의 긍정적인 선택을 위해 설계되었습니다.
RPMI 1640 중간Gibco C11875500BT
S2 Gel 전기영동 바늘 바이옵틱C105101DNA 조각 분석기 지원 제품
수술 도구: 메스, 해부 가위, 미세 해부 가위, 미세 집게, 둔기 해부학 집게, 바늘 홀더Fisher Scientifichttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools다른 자격을 갖춘 공급업체로부터 구입할 수 있습니다
사기 (1  mL)피셔 사이언티픽 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464다른 적격 공급업체로부터 구입할 수 있습니다
vazymeTD501-01용 TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2Illumina용 TruePrep DNA Library Prep Kit V2는 Illumina의 고처리량 염기서열분석 플랫폼을 위해 특별히 개발된 특수 제작 키트입니다. 이 키트를 사용하여 DNA를 Illumina의 고처리량 염기서열분석 플랫폼 전용 염기서열분석 라이브러리로 준비할 수 있습니다.
vazymeTD202용 TruePrepTM Index Kit V2Illumina용 TruePrep Index Kit V2는 Illumina용 TruePrep DNA Library Prep Kit V2용 키트입니다. 96개의 서로 다른 양단 인덱스 라이브러리를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
. 주. Illumina Illumina

참고문헌

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염색질 접근성골수 호중구면역자성 분리호중구 분리Tn5 전이효소후성유전학적 조절뉴클레오솜 위치 지정PCR 정제염색질 재프로그래밍
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