고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

요약

여기에서는 공압식으로 작동되고 고해상도 현미경 검사와 호환되는 다목적 등축 스트레칭 장치를 제시합니다.

초록

세포는 다양한 인장 및 압축 응력을 포함한 생리학적, 병리학적 상황에서 기계적 힘에 지속적으로 노출됩니다. 세포와 조직이 이러한 스트레스에 어떻게 반응하고 적응하는지, 그리고 이러한 반응이 기계화학적 신호와 어떻게 통합되는지를 탐구하는 매우 활발한 연구가 있습니다. 이로 인해 표준 세포 배양 프로토콜 및 현미경 방법과 호환되는 정교한 도구가 필요하게 되었으며, 체외 연구에서 생리학적 스트레스를 재현할 수 있습니다. 이 연구는 고해상도 광학 및 형광 현미경과 호환되는 스트레칭 장치의 설계, 기능 및 특성화를 제시합니다. 공압 또는 모터 기반의 수많은 스트레칭 장치가 개발되어 이 분야에서 사용되었습니다. 우리는 설계 지침, 다양한 응용 프로그램 및 유사한 설정을 제작하기 위한 모든 도구를 포함하여 이러한 시스템 중 하나를 자세히 제시합니다. 이 시스템은 진공 적용 시 등축으로 늘어난 변형 가능한 폴리디메틸실록산(PDMS) 멤브레인을 기반으로 하여 균일하고 재현 가능하며 제어된 시료 변형을 제공합니다. 시간을 엄수하고 즉각적인 스트레칭부터 제어된 진폭 및 주파수의 반복적인 스트레치-릴리스 사이클에 이르기까지 다양한 인장 응력을 제공합니다. 접착 단백질로 기판 코팅을 하면 스트레칭 장치에서 형광 리포터가 있는 세포를 파종하고 고배율 형광 현미경을 사용하여 스트레칭 시 이러한 세포의 라이브 이미징을 수행할 수 있습니다. 압축 응력은 샘플이 스트레치에 적응하도록 한 후 방출하거나 스트레치 방출 전에 미리 늘어난 기판에 샘플을 시딩하여 적용할 수도 있습니다. PDMS 기판의 추가 지형 패터닝을 통해 다른 현미경 모드(예: 형광 및 전자 현미경)에서 동일한 샘플을 이미징할 수 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔은 또한 PDMS 멤브레인에 부착될 수 있으며, 그 결과 서로 다른 강성의 기질에 파종된 세포가 늘어날 수 있습니다. 전반적으로, 이 스트레칭 장치는 살아있는 샘플에 제어된 인장 응력을 가함으로써 고품질 형광 현미경 검사와 결합되어 기계생물학의 다양한 질문을 해결할 수 있습니다.

서론

PDMS(thin deformable polydimethylsiloxane) 멤브레인은 PDMS가 현미경 이미징과 호환되는 잘 정립된 생체 적합성 불활성 재료이기 때문에 다양한 맞춤형 스트레칭 장치 ^1,2,3에 널리 사용됩니다. 여기서, 다른^{많은 것들}과 마찬가지로 4,5,6,7,8,9, 진공을 적용하는 간단한 개념은 견고하고 제어 가능한 등축 연신 장치를 조립하기 위해 멤브레인을 변형하는 데 사용됩니다. 멤브레인을 원형 고리 내부에 고정하고 "스트레칭 포스트"(그림 1A-C) 위에 고리를 밀봉하면 균일하고 등방성 변형이 이루어집니다. 생물학적 샘플은 독립형 PDMS 멤브레인의 링 중앙에 위치하여 형광 현미경을 사용하여 이미징할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 현미경 스테이지 모델(그림 1D-F)과 호환되고 생물학적 응용 분야 측면에서 매우 다재다능한 두 가지 맞춤형 설정이 제시됩니다. 전체 디자인은 단순하고 다른 스테이지로 옮길 수 있지만, 이미징 요구 사항에 맞게 셋업의 치수를 신중하게 선택해야 합니다. 일단 달성되면 장치의 변형률 프로파일을 특성화하고 검증해야 합니다.

설정 자체와는 별개로, 변형률 크기, 균질성 및 등방성을 특성화하기 위한 Matlab 코드가 수반되는 간단한 방법이 제시됩니다. 연신 장치는 이후에 합성 시스템⁽¹⁰), 단일 셀^{(11, 12}) 또는 단층⁽¹³)에 등축(equibiaxial tensile stress)을 가하는 동시에 형광 현미경을 사용하여 샘플의 생물학적 반응을 높은 시공간 해상도로 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 멤브레인은 다른 세포외 기질 접착 단백질로 코팅될 수 있습니다^14,15. 생물학적 연구의 필요에 따라 추가 기능을 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔은 PDMS 멤브레인에 결합하여^13,16을 연신하면서 기질 강성을 조정할 수 있으며, PDMS 멤브레인은 샘플¹² 내에서 동일한 관심 영역의 후방 이미징을 위해 참조 번호가 매겨진 그리드로 제작할 수 있습니다. 고정된 스트레치된 샘플은 면역염색으로 처리한 후 형광 이미징을 위해 다시 스트레칭할 수도 있습니다¹⁷. 적용된 스트레치 패턴은 단일 즉각적인 스트레치 펄스에서 다양한 크기, 주파수 또는 형상의 주기적 변형에 이르기까지 제어될 수 있습니다^14,16.

프로토콜

1. 스테이지 및 스트레칭 포스트 설계(그림 1)

1. 스테이지 크기/홀더 및 목표 구성과 치수가 호환되는 스트레치 포스트를 설계합니다. 두 개의 특정 스트레칭 포스트가 그림 1A, D에 표시되어 있습니다.
   참고: 이 프로토콜(Supplementary Folder 1)에서 제공되는 FreeCAD 파일은 NI-SH-E 스테이지가 장착된 Eclipse Ni-E upright 및 TI-S-ER 스테이지가 장착된 Eclipse Ti-E/B inverted( 그림 1D)와 호환됩니다. 포스트는 3차원(3D) 인쇄가 가능하지만 반복 사용 후 변형될 수 있습니다. 알루미늄 기반 게시물은 이러한 단점을 겪지 않습니다. 산화를 방지하기 위해 알루미늄 기반 기둥에 양극 산화 처리를 하십시오. 직립 구성은 더 큰 움직임 진폭을 허용합니다. 또한 직립 구성은 인터페이스 없이 샘플을 직접 이미징할 수 있으며, 이는 변형 가능한 PDMS 멤브레인 기판의 경우 광학적으로 유리합니다. 대신, 반전된 구성에서 조명 빔은 PDMS 멤브레인을 통과합니다(그림 1F). 스트레치 적용 시 PDMS 멤브레인이 움직이기 때문에 대물렌즈를 위한 이멀젼 매체를 신중하게 선택해야 합니다(권장되는 수침 유형, 공기 또는 글리세롤, PDMS 기질과의 비호환성으로 인해 오일 이멀젼은 권장되지 않음). 상업용 홀더는 추가 나사 구멍을 사용하여 수정할 수 있습니다. 나사를 조이는 동안 먼지를 피하기 위해 플라스틱 또는 테프론 기반 나사를 사용하지 않도록 주의하십시오. 그림 1E와 같이 스트레치 포스트를 스테이지 상단에 장착할 수 있는 홀더를 설계하는 것이 편리할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 제공되는 FreeCAD 파일은 Eclipse Ni-E 정립 현미경의 스테이지와 호환됩니다.
2. 스트레치 포스트(그림 1A, B)와 크기가 호환되는 스트레치 링(그림 1C)을 설계합니다. 이 프로토콜에서 제공되는 FreeCAD 파일은 해당 포스트와 호환됩니다(샘플을 처리하는 동안 링을 덮기 위해 직경을 페트리 접시의 크기와 호환되도록 선택할 수 있음).
   참고: 링은 알루미늄 기반(양극 산화 처리) 또는 3D 프린팅일 수도 있습니다. 스트레치 포스트와 링을 진공 밀봉하기 위해 적절한 직경의 개스킷을 포함합니다.
3. 선택 사항: 진공 컨트롤러를 제작합니다. 이 프로토콜에 사용된 진공 제어 상자의 전기 맵은 추가 정보에 제공됩니다( 추가 폴더 2 참조). 스트레칭 장치에 적용되는 진공 수준을 수동으로 제어할 수 있습니다.
   참고: 상업용 진공 컨트롤러도 유사한 기능을 제공할 수 있으며 일반적으로 다양한 신호 유형(사인파, 삼각형 등)을 적용할 수 있는 제어 소프트웨어와 함께 제공될 수 있습니다. (플루이젠트, 코발트).

2. 신축성 있는 멤브레인의 제작

1. 원형 플레이트를 설계합니다(권장 재료: 폴리메타크릴레이트, PMMA). 이 플레이트가 링보다 넓고 스핀 코터와 크기가 호환되는지 확인하십시오(그림 2A). 제안된 차원은 표 1 을 참조하고 보조 폴더 3을 참조하십시오.
   참고: 포스트 1의 경우 직경 12cm가 사용되었습니다. 포스트 2의 경우 직경이 18-21cm입니다. 매번 사용하기 전과 사용 사이에 플레이트는 부직포 물티슈와 96% 에탄올을 사용하여 조심스럽게 청소해야 합니다. PDMS가 플레이트와 테두리 및 아래에 축적되지 않도록 하는 것이 중요합니다.
2. PDMS 1:10을 준비하고 잘 혼합하여 매우 균일한 에멀젼을 얻습니다(권장 교반 스푼 사용).
   참고: 12cm의 경우 플레이트당 4.5g을 준비합니다. 18cm 접시의 경우 접시 당 8g. 여러 플레이트를 준비하는 경우, 예를 들어 10개의 플레이트에 필요한 것보다 10mL 더 많은 PDMS를 추가로 준비합니다. 12cm 접시 10개에 A성분 50g과 B성분 5g을 준비합니다. 쉽게 피펫팅을 하기 위해 큰 용기를 사용하는 것이 편리합니다. 콘센트에는 적절한 PDMS 회전 및 경화를 방해할 수 있는 먼지나 기타 오물이 포함되어서는 안 됩니다. PDMS 경화를 보장하기 위해 호환 가능한 재질의 장갑을 사용하십시오(라텍스는 피하십시오. 비닐 장갑이 적절함).
3. 진공 챔버를 사용하여 최소 1시간 동안 가스를 제거합니다.
   참고: 또는 50mL 튜브를 사용하여 0.2 × g 에서 5분 동안 PDMS를 원심분리할 수 있지만, 디스펜싱 주사기를 사용하여 튜브에서 PDMS 혼합물을 흡인하는 것은 복잡합니다(2.4단계에서 필요). PDMS의 사전 경화를 방지하기 위해 직사광선으로 너무 오랫동안(2시간 이하) 가스를 제거하지 마십시오.
4. PMMA 플레이트 상단의 PDMS 스핀 코팅
   1. 4.2mL 또는 7.5mL의 탈기 PDMS를 PMMA 플레이트 위에 분주합니다.
   2. 다음 권장 설정을 사용하여 플레이트를 스핀 코팅합니다.
      1. 100rpm/s의 가속도로 500rpm에서 5초 동안 스핀 코트.
      2. 300rpm/s의 가속도로 500rpm에서 1분 동안 스핀 코트.
         참고: PMMA 플레이트의 중심을 바닥에 표시하여 회전 및 균일한 회전 중에 플레이트의 중심을 확보하는 것이 편리할 수 있습니다. 2.4.2.1단계는 특히 가속 매개변수를 조정할 수 없는 경우 필수가 아닙니다. 회전하기 전에 PDMS를 확산하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 약 140μm 두께의 PDMS 멤브레인을 생성합니다(간섭계로 측정, 보충 그림 1 및 표 2 참조). 스핀 코터 모델 또는 매개변수가 다른 멤브레인 특성으로 이어지는 경우 실험 전에 보정을 수행해야 합니다.
5. 먼지가 쌓이지 않도록 각 접시를 페트리 접시에 보관하고 오븐 내부 65°C에서 밤새 중합합니다.
   알림: 온도에 강한 접시 사용에 주의하십시오. 경화 조건은 적용된 주어진 진공 수준에 대한 PDMS 변형성에 영향을 미칩니다.

3. 반지에 끼워넣는 막

1. 장착 재료의 디자인.
   1. 스핀 코팅된 PDMS 원형 멤브레인을 배치하기 위해 내부/외부 직경의 PMMA 링을 설계합니다(그림 2A). 표 1 및 보조 폴더 3에서 제안된 치수를 참조하십시오.
   2. 링이 맞는 장착 지지대(그림 2B)를 설계하고 높이에 따라 링에 멤브레인을 장착할 때 사전 스트레치도 결정됩니다.
      알림: 장착 지지대는 기존 실험기구(예: 페트리 접시)를 기반으로 하는 간단한 솔루션이 될 수 있습니다. 보다 우아한 해결책은 높이를 사용자 정의하고 쉽게 변경할 수 있기 때문에 지지대를 3D 인쇄하는 것입니다(이 프로토콜에서 제공되는 이 부분의 FreeCAD 파일 참조, 보충 폴더 3 참조). 지지대의 중앙 부분 높이는 장착 시 PDMS 기판이 지지대에 닿지 않도록 하프 링 높이보다 작게 선택해야 합니다(3.4.2단계의 추가 사용 참조). 여기에는 폴리락트산(PLA) 필라멘트를 사용하는 3D 프린터( 재료 표 참조)가 적합합니다. 절단 링도 3D 프린팅하여 메스의 가이드 역할을 하도록 설계할 수 있습니다(그림 2A).
   3. 멤브레인을 장착하는 동안 링에 무게를 가하고(그림 2C) 재현 가능한 사전 장력을 유도할 수 있는 크기가 호환되는 황동 추를 설계하고 제작합니다.
      참고: 여기에 제공된 FreeCAD 파일( 보충 폴더 3 참조)은 이 프로토콜에 제시된 링 치수와 일치합니다.
2. PMMA 플레이트에서 PDMS 멤브레인을 제거합니다.
   1. 흰색 벤치 용지 위에 PMMA 링을 준비합니다.
      참고: 장착하는 동안 용지가 PDMS 멤브레인에 닿지 않도록 벤치와 용지를 평평하게 유지하는 것이 중요합니다.
   2. 블레이드로 플레이트의 가장자리를 조심스럽게 돌아다닌 다음(한 번 또는 두 번) 날카로운 핀셋으로 동일한 가장자리를 추적하여 PDMS가 전체 둘레를 따라 깨끗하게 절단되었는지 확인합니다(그림 2A).
   3. 핀셋을 사용하여 한쪽 가장자리에서 멤브레인을 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 엄지 손가락으로 PDMS 시트의 가장자리를 부드럽게 벗겨 가장자리에서 멤브레인을 고르게 들어 올립니다. 플레이트 둘레의 절반을 따라 플레이트에서 멤브레인 가장자리를 분리합니다(그림 2A).
      참고: PDMS 멤브레인 아래에 96% 에탄올 몇 방울을 부으면 멤브레인을 깨뜨리지 않고 들어 올리는 데 도움이 됩니다.
3. PDMS 멤브레인을 건조시킵니다.
   1. 이전에 준비한 PMMA 링의 전체 상단 표면 주위를 96% 에탄올(단계 3.2.1)하고 손가락을 사용하여 고르게 펴 바릅니다.
   2. PDMS 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 이전에 들어 올린 가장자리(3.2.3단계에서 설명)에서 들어 올려 에탄올로 덮인 PMMA 링에 대칭으로 놓습니다. PDMS에서 주름을 제거하되 멤브레인이 늘어나지 않도록 하십시오. 단지 그것을 곧게 펴십시오.
      참고: 이 단계에서 사전 스트레치를 적용하면 적용된 주어진 진공 수준에 대한 PDMS 변형성에 영향을 미칩니다.
   3. 에탄올이 완전히 건조되면 PDMS 멤브레인이 PMMA 링에 단단히 부착되었는지 확인합니다.
4. 스트레치 링을 조립합니다.
   1. 또 다른 빈 PMMA 링을 가져옵니다. 마운팅 링 위에 놓고 금속 클립을 사용하여 두 링 사이에 PDMS 멤브레인을 끼워 함께 밀봉합니다(PDMS 멤브레인 샌드위치, 그림 2B).
   2. 스트레치 링의 아래쪽 절반을 3.1.2단계(그림 2B)에서 설계된 장착 지지대에 놓습니다.
   3. PDMS 링 샌드위치를 스트레치 링에 놓고 끝까지 닿을 때까지 단단히 아래로 누릅니다. PDMS 기판은 장착 지지대에 닿지 않습니다. 개스킷을 올바른 위치에 고정합니다(그림 2B).
   4. 샘플 위에 원형 황동 추를 놓습니다(그림 2C). 이는 장착된 모든 링과 유사한 고정 프리텐션을 적용하여 시스템을 교정할 때 추가적인 재현성을 보장합니다.
   5. 나사 구멍이 정렬된 상태로 금속 스트레치 링의 위쪽 절반을 위에 놓고 모든 나사를 놓고 조입니다(그림 2C).
      참고: 이 단계에서는 PDMS 멤브레인에 구멍이 있으므로 프로토콜에서 마운트 해제하거나 뒤로 이동하지 마십시오.
   6. 블레이드로 링 주위의 PDMS를 부드럽게 자릅니다(그림 2C).
   7. 먼지로부터 멤브레인을 보호하기 위해 덮개(예: 페트리 접시 사용)를 사용합니다(그림 2C).
      참고: PDMS를 폴리아크릴아미드 겔로 기능화해야 하는 경우 섹션 5로 진행하십시오. 초기 교정 측정의 경우 섹션 6으로 진행하십시오. PDMS 링이 세포 시딩에 사용되는 경우 섹션 7로 진행합니다.

4. PDMS 멤브레인 제작의 변형: 참조 그리드를 패턴화합니다.

1. 포토리소그래피를 사용하여 생성된 SU8 기반 그리드로 "패턴화된" PMMA 플레이트(PDMS 스핀 코팅 이전)를 준비합니다(그림 2D). 이를 위해 관심 패턴을 디자인하여 포토마스크 필름(아세테이트 마스크)을 만듭니다.
   참고: 이 프로토콜에 제공된 pdf 파일( 추가 폴더 4 참조)은 대체 번호가 있는 그리드를 만듭니다. 그림 2D를 참조하십시오. 그리드는 패턴의 크기를 감안할 때 Inkscape와 같은 간단한 소프트웨어(또는 Clewin 또는 FreeCAD와 같은 대안)를 사용하여 만들 수 있습니다. 디자인은 외부 회사에서 사진 필름에 인쇄할 수 있습니다( 재료 표 참조).
2. PMMA 플레이트의 포토리소그래피 프로토콜(PMMA 광학 속성에 대한 보충 폴더 3 참조).
   1. 0.8bar의 일정한 산소 흐름으로 7W에서 20분 동안 PMMA 플레이트의 산소 플라즈마 처리를 수행합니다.
      참고: 플레이트의 가능한 플라스틱 보호가 제거되고 PMMA 플레이트가 완전히 투명한지 확인하십시오.
   2. 95 °C에서 5분 동안 굽습니다.
   3. 질소 건을 사용하여 PMMA 플레이트를 냉각한 다음 12cm PMMA 플레이트에 SU-8 2100 수지 4mL를 놓습니다(플레이트 크기가 다른 경우 부피 조정).
   4. 다음 매개변수로 스핀(또는 스핀 매개변수를 조정하여 약 10μm 높이의 레이어 생성): 100rpm/s의 가속도로 500rpm에서 5초, 300rpm/s의 가속도로 4000rpm에서 30초.
   5. 95°C에서 2.5분간 굽는다.
   6. 아세테이트 마스크가 있는 상태에서 PMMA 플레이트를 마스크 정렬기에 놓고 다음 매개변수를 사용합니다. i-line 없이. 광대역 노출 (260 및 460 nm 사이), 25 mW/cm², 7.5 s의 노출.
   7. 3.5 ° C에서 95 분 동안 굽습니다.
   8. 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트로 1분 동안 패턴을 개발합니다.
   9. 이소프로판올로 광범위하게 세척하십시오.
   10. 명시야 현미경에서 저배율 대물렌즈(2-10x)를 사용하여 패턴 품질을 육안으로 검증합니다.
       참고: PMMA 패턴 플레이트의 실란화는 반복 사용을 위한 패턴의 수명을 증가시킵니다. 이를 위해 산소 플라즈마 처리로 패턴이 있는 PMMA 플레이트를 30초 동안 작동시킨 다음 화학 후드에서 진공 상태에서 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란으로 1시간 처리를 수행합니다.
3. 2.2-2.5단계에서와 같이 패턴화된 PMMA 플레이트를 사용하여 PDMS 신축성 멤브레인을 스핀 코팅합니다.
   참고: 패턴화된 PDMS는 앞서 언급한 바와 같이 명시야 현미경과 주사 전자 현미경에서 시각화할 수 있습니다(그림 2D). 원하는 방향의 패턴을 얻기 위해 스트레치 링에 PDMS 멤브레인을 장착하는 동안 패턴의 어느 면이 위를 향하고 있는지 주의하십시오.

5. PDMS 멤브레인 위에 폴리아크릴아미드(PAA) 젤 부착

참고: 이 단계는 PMMA 플레이트에 부착된 PDMS 멤브레인(섹션 2 참조) 또는 이전에 장착된 스트레치 링(섹션 3 참조)에서 수행할 수 있습니다. 화학 후드 아래에서 작업하십시오. 가열과 관련된 단계는 화학 후드 아래에 맞는 작은 오븐을 사용하는 것이 편리합니다 ( 재료 표 참조). 그렇지 않으면 샘플을 오븐의 밀폐 상자에 보관하십시오).

1. PDMS 멤브레인 사전 코팅(그림 2E)
   1. 마이크로 원심분리 튜브에서 96% 에탄올과 10%(3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)을 혼합하여 코팅 용액을 준비합니다(예: 180μL의 에탄올에 20μL의 APTES).
   2. 코로나 플라즈마 배출기로 PDMS 멤브레인을 1분 동안 활성화합니다(또는 산소 플라즈마 클리너를 사용하여 30초 동안 활성화).
   3. 200μL의 APTES/에탄올 용액을 멤브레인 중앙에 놓습니다.
   4. 멤브레인을 오븐 내부에서 65°C로 1시간 동안 그대로 둡니다.
   5. PBS로 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척의 경우 흔드는 동안 PBS를 10분 동안 그대로 두십시오.
   6. PBS에서 3% 글루타르알데히드(GA) 용액을 준비합니다. APTES로 처리된 멤브레인의 동일한 영역에 멤브레인당 200μL의 GA를 배치합니다.
   7. 25분 동안 기다립니다(30분 이하).
   8. PBS로 두 번 씻고 흔들면서 두 번째로 씻습니다.
   9. 액체를 흡입하고 PBS가 완전히 건조될 때까지 링을 기울어진 위치에 놓습니다.
2. 커버슬립 실란화
   1. Repel Silane 6mL를 준비하고 페트리 접시에 붓습니다.
   2. 정사각형 18mm 유리 커버슬립을 하나씩 조심스럽게 액체에 넣습니다.
   3. 커버슬립을 5분 동안 배양합니다.
   4. 두 개의 비커를 준비하십시오. 하나는 96% 에탄올을 함유하고 다른 하나는 초순수를 함유하고 있습니다.
   5. 핀셋으로 Repel Silane에서 커버슬립을 제거하고 먼저 96% 에탄올로 세척한 다음 초순수로 세척합니다(커버슬립은 물 세척에서 "건조"해야 함).
   6. 페트리 접시의 테두리에서 30분 더 건조시킵니다.
3. PDMS 멤브레인에 폴리아크릴아미드(PAA) 겔 부착
   1. Repel Silane 처리된 커버슬립의 절반을 페트리 접시 바닥에 배열합니다.
   2. 원하는 강성^16,18의 PAA 겔 혼합물을 준비합니다.
   3. 각 커버슬립 위에 10μL의 젤 믹스 한 방울을 떨어뜨립니다.
   4. 그 위에 또 다른 Repel Silane 처리된 커버슬립을 올려 젤을 펴 바릅니다. 두 개의 커버슬립을 정렬하지 마십시오. 쉽게 분리할 수 있도록 별 모양으로 배열되어 있는지 확인하십시오. 젤이 평평해지지만 커버슬립 영역을 초과하지 않도록 부드럽게 누릅니다.
   5. 45분에서 1시간 동안 기다립니다.
   6. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 분리합니다. 젤이 커버슬립 중 하나에 부착되어 있는지 확인합니다.
   7. 겔이 부착된 커버슬립을 취하고 이전에 GA로 처리한 PDMS 영역에 겔을 접촉시킵니다(그림 2E).
   8. 두 손가락으로 아래에서 위로 5초 동안 누릅니다.
   9. 37 °C에서 밤새 배양합니다.
   10. 다음 날, 30분 동안 PBS로 링을 채웁니다.
   11. 핀셋으로 상단 커버슬립을 부드럽게 분리합니다.
   12. PDMS 멤브레인의 다른 쪽에서 영구 마커가 있는 PAA 겔의 둘레를 그립니다. 이렇게 하면 다음 단계에서 샘플을 찾는 데 도움이 됩니다.
   13. PBS를 흡인합니다.
   14. 원하는 세포외 기질 단백질의 부착을 용이하게 하기 위해 기능화 단계를 수행한다¹⁵.

6. 스트레칭 장치 작동, 변형률 교정 및 분해능 평가

1. 변형률 보정을 위해 형광 비드가 있는 PDMS 스트레치 링을 준비합니다.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에서 0.1μm 또는 0.2μm 형광 비드( 재료 표 참조)를 1:50000 희석하여 연속 희석(PBS 내 1mL의 1mL 중간 용액과 2μL의 비드 스톡 용액을 사용한 후 중간 용액에서 10μL를 1mL의 PBS로 최종 희석)하여 준비합니다.
      참고: 멤브레인에 대한 높은 비드 밀도는 보정 단계에 최적입니다. 비드 덩어리는 보정 중 작동을 돕기 때문에 용액을 초음파 처리하지 마십시오.
   2. PDMS 중앙에 10-30μL 방울을 떨어뜨립니다.
      참고: 장착 지지대는 cross-to-center 샘플 증착으로 편리하게 설계할 수 있습니다.
   3. 경화 후 혼란스러운 문제를 피하기 위해 40 °C 이하에서 건조시키십시오.
2. 해상도 평가를 위해 형광 비드가 있는 PDMS 스트레치 링을 준비합니다.
   1. Cole과 ^al.19 의 프로토콜에 따라 회절 한계보다 작은 직경의 비드(일반적으로 0.1μm 직경의 비드)를 사용하여 비드 용액을 준비합니다.
      ( 재료 표 참조). 각 중간 단계에서 비드 용액을 조심스럽게 초음파 처리합니다.
   2. 링 중앙에 코로나 처리를 사용하여 PDMS 기판을 활성화합니다.
   3. 즉시 처리된 PDMS 중앙 부위 위에 비드 용액 20μL를 펴 바르고 건조시킵니다.
      참고: 이 경우, 비드 용액은 친수성 PDMS에서 고도로 희석되고 배양되어 광범위한 퍼짐을 보장하고 기판에 흡착된 단일 분리된 0,1μm 비드를 얻습니다.
3. 스트레칭 장치를 현미경 스테이지 홀더에 장착합니다(그림 1F).
   1. 현미경에 스트레칭 포스트를 장착합니다.
   2. 포스트의 원형 영역(중간 부분, 그림 1D, F) 위에 윤활제(바셀린)를 넉넉하게 도포합니다.
      참고: PDMS 기판이 마찰을 극복하고 포스트에서 미끄러지려면 윤활제를 반드시 사용해야 하며, 각 샘플 사이에 윤활유를 새로 고쳐야 합니다. 바셀린은 이 프로토콜에 제시된 설정에서 매우 편리한 윤활제로 사용됩니다.
   3. 6.1단계에서 준비한 스트레치 링을 스트레치 포스트에 장착하고 상단 캡을 나사로 조여 어셈블리를 밀봉합니다.
   4. 진공 컨트롤러를 진공 소스와 스트레치 포스트에 연결합니다(그림 3A).
      1. 진공 제어 상자의 후면을 진공 소스에 연결합니다(그림 3A).
      2. 상자 전면을 스트레치 포스트에 연결합니다(그림 1B, D, F).
         알림: 진공 소스는 건물의 기반 시설에서 사용할 수 있는 진공 라인일 수 있습니다. 충분한 스트레칭을 위해서는 적당한 진공이 필요하지만 스트레치 링 직경에 따라 다릅니다(더 작은 직경에 대해 동일한 진공 수준에서 더 작은 변형률을 얻을 수 있음). 또는 진공 펌프가 상업적으로 이용 가능합니다(Fluigent 또는 Elveflow는 자율 진공 펌프를 제공함). 이 경우 진공 소스에 연결하기 위한 제조업체 지침을 따르십시오. 진공 제어 소스(예: 이 프로토콜에 제시된 맞춤형 진공 제어 상자 또는 시중에서 판매되는 시스템) 없이 진공 공급 장치를 사용하지 마십시오.
4. 스트레인 캘리브레이션
   1. 시야 전체에 걸쳐 높은 비드 밀도와 사용자가 인식할 수 있는 비드 덩어리를 포함하는 관심 분야를 선택하십시오( 그림 3B 참조).
   2. 선택한 시야의 "정지된" 이미지를 획득합니다(위치 저장).
   3. 낮은 진공 수준(이 설정에서는 -20mbar)에서 스트레칭을 적용합니다. 샘플이 모든 방향(X-Y-Z)으로 이동합니다.
   4. Z 평면에서 먼저 초점을 다시 맞춥니다.
   5. 스테이지를 x-y 방향으로 이동하여 정지 상태에서 이미지화된 것과 동일한 관심 영역을 찾고, 늘어난 상태의 비드 이미지에 미세 초점을 맞추고, 이미지를 획득합니다.
      참고: 샘플이 중심에서 매우 벗어나면 변형률 크기에 따라 관심 영역이 크게 이동합니다. 변위는 중심에서 멀어질수록 더 커지지만 변형률 크기는 기판에서 샘플의 위치와 무관합니다. 2048x2048 해상도로 비닝 없이 이미지를 녹화할 수 있습니다.
   6. 변형을 해제합니다. 더 높은 진공 수준(-30mbar, -40mbar 등)으로 6.4.3-6.4.5단계를 반복합니다.
      참고: PDMS는 변형 시 히스테리시스 거동이 발생하므로 보정을 위해 다시 스트레치하기 전에 항상 정지 상태로 돌아가십시오( 보충 그림 3A 참조).
   7. 두 번째 스트레치 링을 장착하고 6.4.1-6.4.6 단계를 반복합니다. 최소 3개의 서로 다른 스트레치 링에 대해 이 보정을 수행합니다.
   8. 획득한 이미지를 샘플별로 정리된 폴더에 저장합니다.
   9. 각 폴더에서 미사용 reference_str1에서 획득한 참조 비드 이미지의 이름을 지정하고 진공 stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 등이 증가할 때 늘어난 이미지의 이름을 지정합니다.
      참고: 이 단계는 시스템의 핵심 보정을 구성합니다. 사용자의 필요에 따라 유사한 비드 샘플을 사용하지만 다른 진공 어플리케이션 프로토콜을 사용하여 추가 보정을 수행해야 합니다. 생물학적 샘플에 적용된 변형률과 유사한 변형률 프로토콜을 적용합니다(대표 결과 섹션 참조).
5. Matlab 코드를 사용하여 균주²⁰을 정량화합니다.
   1. 다음 링크에서 전체 Matlab 폴더를 다운로드하십시오 https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      참고: 실행할 기본 코드의 이름은 gel_strain 이며 기본 코드와 동일한 폴더에 저장된 제공된 대로 보관해야 하는 다른 Matlab 코드 파일을 호출합니다.
   2. Matlab을 열고 코드 gel_strain 엽니다.
   3. 매개변수를 설정합니다(권장 설정은 표 3 Code_Parameter 참조).
   4. 코드에 표시된 대로 부모 및 실험 폴더 경로를 정의합니다.
      참고: 폴더가 없으면 코드에 경고 팝업이 표시됩니다. 경로에 추가를 선택하고 이미지가 저장된 실험 폴더를 찾습니다.
   5. gel_strain 코드를 실행합니다.
   6. 코드의 요청에 따라 stretched_str1 엽니다.
   7. 코드의 요청에 따라 reference_str1 엽니다.
      참고: 이 프로토콜에 표시된 대로 서로 다른 진공 수준에서 스트레치된 모든 이미지를 한 번에 처리하는 것이 편리합니다. 모든 파일은 동일한 실험적 폴더에 저장해야 하지만 코드는 첫 번째 스트레치 이미지만 열도록 요청합니다. 이미지 이름은 strX 이름으로 끝나야 하며, X는 이 장의 포인트 6.4.9에 표시된 대로 증분 숫자 1, 2, 3 등이어야 합니다.
   8. 결과 폴더에 4개의 하위 폴더가 있는지 확인합니다. Croppeddata: 잘리고 정렬된 데이터가 포함되어 있습니다. 비드 변위 파일을 포함하는 변위; 방사형 변위와 변형률의 플롯을 포함하는 이미지; 각 진공 수준에 대해 얻은 변형률 매트릭스의 스프레드시트를 포함하는 변형률.
      1. 각 진공 수준에 대한 스트레인 매트릭스의 중앙값을 계산합니다.
      2. 각 샘플에 대해 반복합니다(최소 3개).
      3. 검량선을 얻기 위해 3개 샘플에 대한 진공 수준 대비 중앙값 변형 매트릭스를 플롯합니다(그림 3C).
         참고: 비드 이미지가 코드에서 제대로 처리되지 않는 경우 몇 가지 매개변수를 수정할 수 있습니다. 이렇게 하려면 Matlab에서 set_settings_stretch 파일을 열고 코드 주석의 권장 사항에 따라 Settings.Resolution 과 Settings.Overlap 을 수정합니다( 표 3 참조). 실험적 필요성에 따라 생물학적 샘플에 적용되는 균주는 다양할 수 있으며(순환 변형, 더 큰 변형 등) 이러한 조건의 보정이 권장됩니다( 보충 그림 2 및 보충 그림 3의 예 참조).
6. 분해능 평가(Cole et ^al.19의 프로토콜 따름)
   1. 6.2단계에서 준비한 스트레치 링을 장착합니다.
   2. 단일 비드 점을 포함하는 시야를 이미지화합니다(사용된 대물렌즈와 관련된 Z-단계 거리가 있는 스택 이미지).
   3. Cole et al.에서 지적한 바와 같이 MetroloJ(Fiji 플러그인)를 사용하여 스트레치 설정의 X-Y-Z 해상도를 특성화합니다(그림 3D 및 보충 그림 4).

7. 세포 파종 및 스트레칭

1. PDMS를 세포 접착 단백질로 코팅
   1. PDMS 링을 15분 동안 자외선에 노출시켜 멸균합니다(그림 4A). 무균 상태를 보장하기 위해 biohood에서 프로토콜의 모든 후속 단계를 수행합니다.
   2. 후드 아래의 플레이트를 멸균 PBS로 헹굽니다.
   3. 고리 중앙에 용액을 100-200 μL 방울 떨어뜨려 세포 접착 단백질 11,14,15를 배양합니다 (그림 4A).
      참고: 일반적으로 10μg/mL의 피브로넥틴 용액이 적절합니다¹¹. PDMS를 코팅하기 위해 관심 있는 다른 접착 단백질을 사용할 수 있습니다(예: 라미닌, 케라틴¹⁵; 특정 처리/프로토콜이 필요할 수 있음). 피브로넥틴 코팅을 위한 배양은 4°C에서 밤새 권장됩니다. 대체 방법은 37°C에서 1시간입니다.
   4. PDMS 멤브레인의 아래쪽에서 영구 마커로 드롭의 둘레를 그립니다. 이렇게 하면 다음 단계에서 샘플을 찾는 데 도움이 됩니다.
2. PDMS 링의 세포 시딩(Cell seeding)(그림 4A).
   1. 필요한 경우, 스트레칭 실험 전에 형광 단백질로 관심 세포를 transfection하거나(transfection의 경우, transfection 방법 및 특성에 따라 실험 1-3일 전) 특정 프로토콜을 사용하여 관심 형광 마커를 시각화합니다.
      참고: 초기 실험의 경우 GFP-mem^11,12와 같은 원형질막 마커를 사용하여 세포막 반응 및 잠재적 파열을 시각화하는 것이 편리합니다. 마커는 transfection이 용이하며, 원형질막 파열로 이어질 strain threshold를 평가하기 위해 변형률 수준을 증가시키는 방식으로 transfection된 세포를 늘리는 것이 좋습니다. Supplementary Folder 5의 plasmid map을 참조하십시오. 이는 세포 유형에 따라 다르며 세포 단층에 비해 단일 세포 실험에서 더 낮을 것입니다. 이 멤브레인 마커는 낮은 스트레치 수준에서 원형질막 파열을 유발하는 것으로 관찰된 일부 멤브레인 삽입 염료와 달리 세포 스트레칭과 호환됩니다.
   2. 실험 당일에는 세포 배지를 따뜻하게 하고 CO₂ 독립 배지를 준비합니다.
      알림: 현미경에 스트레치 시스템과 호환되는 CO₂ 제어 기능이 있는 경우 일반 세포 배양 배지에서 실험을 수행할 수 있습니다(이는 CO₂ 독립 배지에서 생존할 수 없는 섬세한 샘플에 필요한 설정입니다). 표백 방지제를 보충한 CO₂ 독립이 권장됩니다(예: GFP 단백질의 경우 10mg/mL에서 루틴 보충제²¹ ).
   3. 세포를 트립신화하고 계수합니다.
   4. 세포 부착을 촉진하고 CO₂-습도 제어 인큐베이터에 보관하기 위해 표준 세포 배지를 사용하여 소량(20-50 μL)으로 적절한 수의 세포를 시딩합니다.
      참고: 편평하고 큰 섬유아세포 및 단세포 실험의 경우 5000개의 세포; 숫자는 세포 유형과 실험 자체에 따라 다릅니다.
   5. 20-30분 배양 후(초기 세포 부착 확인) 세포 위에 500μL 배지를 부드럽게 추가합니다. 세포가 더 퍼질 수 있도록 인큐베이터에 다시 넣습니다.
      참고: 시딩 시간은 세포 유형과 실험 요구 사항에 따라 다릅니다. 하룻밤 배양으로 단층을 형성하는 것도 가능합니다. 그에 따라 배양 배지의 양을 조정해야 합니다. 2차 세포 염색: 일단 부착되면 세포를 SpyDNA와 같은 염료( Table of Materials(재료 표 참조)로 염색하여 핵(보충 그림 5)을 시각화하거나 다른 염색을 통해 관심 구조를 시각화할 수 있습니다. transfection에 의한 살아있는 세포 염색 또는 단백질의 과발현은 특히 세포 피질, 원형질막 또는 기계에 민감한 단백질/구조에서 늘어나기 위한 세포 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 항상 주의하십시오.
   6. CO₂ 독립 미디어로 교환하고 스트레칭 장치에 즉시 사용하십시오.
      참고: 이제 샘플은 스트레치 실험을 할 준비가 되었습니다.
3. 세포 스트레칭 실험: 섬유아세포의 동적 PM 리모델링을 캡처하기 위한 단일 스트레치-릴리스 주기 및 원형질막(PM) 이미징의 예.
   1. 스트레치 링을 현미경 스테이지에 장착합니다.
   2. 관심 세포를 찾고, 그 위치를 기록하고, 미리 늘어난 세포의 이미지를 촬영합니다(그림 4B).
   3. 검량선에 따라 원하는 기판 변형률과 일치하는 원하는 진공을 적용합니다.
   4. 늘어난 셀을 찾으려면 먼저 Z에서 초점을 다시 맞춘 다음 X-Y 방향으로 이동하여 셀을 찾아 시야의 중심에 다시 맞춥니다.
   5. 원하는 시간 동안 이미지를 기록합니다(그림 4B).
      참고: 초기 실험은 일반적으로 유형에 따라 인장 변형률에 대한 세포 반응을 결정하기 위해 필요합니다(평균적으로). 서로 다른 기질 변형률에서 세포를 늘려 세포가 견딜 수 있는 최대 인장 하중을 결정합니다. 원형질막 파열은 원형질막 형광막 마커를 통해 시각화된 바와 같이 세포에 대한 변형이 과도한 경우 발생합니다.
   6. 세포 방출의 경우 정지 상태의 세포 위치로 돌아가 현미경의 수집 모드를 켜 서 샘플의 초점을 다시 맞추는 즉시 수집이 시작될 수 있도록 합니다.
   7. 스트레칭을 풀고 Z에서 수동으로 빠르게 다시 초점을 맞춥니다.
   8. 원하는 시간 동안 방출된 세포의 이미지를 기록합니다(그림 4B). PDMS 멤브레인의 유연한 특성으로 인해 샘플은 시간이 지남에 따라 쉽게 초점이 흐려집니다. 따라서 이미지 획득 전반에 걸쳐 초점을 수동으로 조정하십시오.
      참고: 릴리스 후 이미징 중에 성공적으로 다시 초점을 맞추려면 이미지를 충분히 자주 시각화해야 합니다. 3초마다 3-5분 분량의 비디오 이미징이 합리적입니다. PDMS 기판은 현미경의 퍼펙트 포커스 시스템과 호환되지 않기 때문에 일반적으로 빠른 획득을 위해 사용자가 수동으로 조정해야 합니다. 소프트웨어 초점은 정산될 수 있지만 스트레치 포스트 파트에 부딪혀 대물렌즈를 손상시킬 수 있는 가능한 오류와 큰 스테이지 이동에 주의하십시오. 사용자는 실험에 따라 샘플을 여러 번 늘리기로 결정할 수 있습니다.
4. 후처리: 피지를 사용하여 이미지 정렬
   1. 정지 상태에서 이미지를 열고 변형시킵니다.
   2. Fiji 플러그인 템플릿 일치를 사용하여 정렬할 셀 영역을 선택합니다(그림 4C).
      참고: 정렬된 변형 이미지의 상대적 변위는 Fiji에 의해 렌더링되고 이미지는 잘리고 정렬됩니다. 이 링크에서 template_matching 플러그인을 다운로드하십시오 : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. 미리 연신된 기질에 세포 파스팅

1. 접착 단백질로 코팅된 스트레칭 링을 스트레칭 장치에 장착합니다.
2. PDMS 기판을 원하는 변형률 수준으로 늘립니다.
3. 섹션 7과 같이 세포를 파종합니다.
   참고: 이 실험에서는 무균 상태에서 시딩이 수행되지 않으므로 프로토콜이 모든 세포 유형에 적합하지 않을 수 있습니다.
4. 세포가 부착된 후 배지를 CO₂ 독립 배지로 교환합니다.
   참고: 접착 시간을 최소화하기 위해 빠르게 접착되는 셀을 선택하십시오.
5. 원하는 배양 시간이 지나면 스트레칭을 해제하고 관심 세포를 이미지화합니다.
   참고: 이 단계에서는 정지 중인 세포의 위치를 알 수 없고 PDMS 기질 이동을 쉽게 예측할 수 없기 때문에 스트레치 방출 후 동일한 세포를 찾기가 어렵습니다.

9. 늘어나거나 이완된 세포 고정

1. 늘어난 상태로 세포 고정(화학적 후드 아래에서 작업)
   참고: 파라포름알데히드(PFA)는 표준 고정제입니다. 빠른 고정을 위해 37°C에서 따뜻하게 사용하십시오. 대안적으로, 글리옥살 용액²² 는 우수한 시료 보존으로 빠른 시료 고정을 허용합니다.
   1. 고정제를 준비합니다.
   2. 7.2단계에 따라 고리에 있는 종자 세포.
   3. 스트레치 포스트와 컨트롤러를 케미컬 후드 내부에 장착하고 진공 공급 장치에 연결합니다.
   4. 스트레칭 포스트에 씨를 뿌린 세포가 있는 고리를 놓습니다.
   5. 늘어난 상태를 고정하려면 원하는 변형률로 늘립니다. 세포 배양 배지를 제거하고 37°C에서 10분 동안 세포에 4% PFA 용액을 첨가하여 고정합니다. 그런 다음 PBS로 씻고 항상 스트레칭을 유지하십시오. 천천히 진공 청소기를 풀고 더 많은 PBS로 씻으십시오.
      참고: 비스트레치 제어 상태를 준비하는 것을 잊지 마십시오(이를 위해 작은 PDMS 조각을 자르고 건조할 수 있으며 그 아래에 유리 커버슬립 위에 소량의 96% 에탄올 용액을 놓을 수 있음). 고정된 샘플을 이미지화하려면 샘플을 동일한 크기로 다시 늘리는 것이 좋습니다. PFA는 독성이 있으므로 이 단계에서 적절한 예방 조치를 취해야 합니다. 후드 아래에 보관할 수 있는 작은 오븐을 사용하는 것이 편리합니다( 재료 표 참조).
   6. 샘플을 이미지화하고, 가급적이면 진공 청소기를 다시 적용하여 고정할 때 사용한 것과 동일한 수준으로 샘플을 "재편lattening"을 보장합니다(그림 4D).
2. 스트레치 릴리스 후 세포를 고정합니다(화학 후드 아래에서 작업).
   1. 세포를 원하는 변형률과 시간으로 늘립니다. 스트레치 릴리스 직전에 샘플을 완전히 건조시키지 않고 대부분의 매체를 제거하고 변형을 해제합니다. 또는 특정 기간의 순환 스트레치를 적용합니다.
   2. 매체를 빠르게 제거하고 10분 동안 정착 용액으로 즉시 고정합니다. PBS와 이미지로 세척하십시오.
      참고: 샘플은 사전 스트레칭된 기질에 파종할 수도 있으며, 사용자 정의 시딩 시간 후에 9.2.2단계와 같이 스트레치 후 방출을 고정할 수도 있습니다.
3. 고정 샘플의 면역형광: 늘어나거나 분리될 때 면역형광에 대한 표준 프로토콜을 따릅니다. Fish Gelatin을 사용한 차단이 BSA¹⁷보다 선호됩니다.
4. 샘플을 이미지화합니다(그림 4E).
5. 시료 보존
   1. 샘플 보존을 위한 장착 매체를 준비합니다(Mowiol 또는 Prolong).
   2. PBS를 제거하고 장착 매체 한 방울(약 75μL)을 추가합니다.
   3. 핀셋으로 커버슬립을 잡고 그 위에 섬세하게 놓습니다(시각화를 방해할 수 있는 거품을 피하십시오).
   4. 실온(RT)에서 최소 48시간 동안 건조하십시오.
   5. PDMS 고정 샘플 주위를 자르고 나중에 이미징할 수 있도록 다른 유리 커버슬립에 장착합니다.
      참고: 보존 매체를 사용하여 PDMS 멤브레인을 커버슬립에 장착하는 것은 멤브레인을 편안한 상태로만 보존해야 하기 때문에 이 단계는 늘어난 멤브레인에서 샘플의 사후 이미징과 호환되지 않습니다.

10. 다른 모드에서 동일한 샘플 영역을 이미징하기 위한 그리드에 고정 - SEM 이미징을 예로 들 수 있습니다.

참고: 이 프로토콜은 여기에 제시된 바와 같이 형광 현미경과 주사 전자 현미경의 두 가지 다른 현미경에서 동일한 단일 세포를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 상관 이미징에는 이 프로토콜의 범위에 속하지 않는 고급 이미지 처리가 필요합니다. 다른 유용한 응용 분야로는 예를 들어 라이브 모드에서 샘플의 시각화, 후드 아래의 추가 고정, 면역염색 후 동일한 세포의 시각화( 보충 그림 5에 사용된 프로토콜)가 있습니다.

1. 섹션 4의 패턴화된 PMMA 플레이트를 사용하여 스트레치 링을 준비합니다.
2. 7.2단계와 같이 셀을 시드합니다.
   참고: 작은 그리드 구멍에서도 PDMS의 완전한 적용 범위를 보장하기 위해 코팅 용액을 조심스럽게 적용해야 합니다.
3. 섹션 8에 설명된 대로 수정하되 샘플 및 전자 현미경 이미징과 호환되는 적절한 고정제 및 프로토콜을 사용합니다.
   참고: PFA + 글루타르알데히드(예: 2%-2.5%)를 혼합하여 사용하는 경우 글루타르알데히드 시약의 존재로 인한 자가형광에 주의하고 결국 담금질 단계²³을 수행합니다.
4. 형광 모드에서 샘플을 이미지화하고 세포 위치를 기록합니다(예: 그리드를 인쇄하고 십자 표시로 위치를 기록).
5. 모든 이미지를 촬영한 후 먼저 샘플 주위의 PDMS를 절단하여 EM용 샘플을 준비합니다(이전에는 윤활제 제거).
6. 주사 전자 현미경을 위한 PDMS 멤브레인 + 샘플을 처리합니다(샘플 탈수 및 금속 스퍼터링의 표준 프로토콜 포함)¹².
7. SEM 현미경에서 이미징할 때 그리드 위치를 찾고 이전에 형광 모드에서 이미징된 세포를 찾습니다(그림 4F,G).

결과

캘리브레이션 및 방사형
얻어진 균주의 적절한 특성화는 실험의 재현성 및 제어를 보장합니다. 변형률을 정확하게 기록하기 위해 각 샘플에 형광 비드를 추가할 수 있지만, 이전 보정 단계에서는 실험자가 실제 스트레칭 전에 샘플에 적용하려는 변형률의 크기를 알고 있어 실험에 대한 적절한 계획을 수립할 수 있습니다. 변형은 적용된 진공에 따라 달라질 뿐만 아니라 스트레치 링 치수, PDMS 구성(1:10과 다른 혼합물), 멤브레인 두께 및 링에 클램핑하기 전 PDMS 멤브레인의 사전 스트레치에 따라 달라집니다. 따라서 각 실험 설정을 개별적으로 보정해야 합니다. 형광 비드의 균일한 이미지를 사용하고 적용된 다양한 수준의 진공에 대한 신호를 기록하면(보충 그림 3A 참조) 변형률과 적용된 진공의 보정 곡선을 구축할 수 있을 뿐만 아니라 변형률의 등방성과 기판에 대한 균질성을 확인할 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 6에 설명된 대로 이러한 이미지를 기록하고 Matlab 코드를 ...

토론

신체의 생리적 조건을 모방하여 생물학적 샘플에 기계적 스트레칭을 적용하기 위해 많은 스트레칭 장치가 사용되었습니다^24,25. 문헌에서 수많은 설정을 사용할 수 있으며, 샘플 반응의 관찰은 일반적으로 스트레칭 장치를 원자력 26 또는 형광 현미경^27,11에 연결하여 수행됩니다.

여기에 제시된 스트레칭 장치의 설계 및 작동은 형광 마커로 표지된 고배율 형광 이미징을 통해 살아있는 세포에서 이러한 이미지를 기록할 수 있습니다. 장치의 단순한 디자인으로 인해 접근하기 쉽고 사용하기 쉬우며 공압 기반 시스템을 선택하면 기계 기반 설정에 비해 간단하고 저렴합니다. 이 연구에서 제시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세테이트 마스크	JD 포토데이터
아크릴아미드	바이오라드	161-0140	40% 아크릴아미드 용액
APS	시그마 알드리치	A3678	전기영동용 과황산암모늄, ≥ 98%
압테스	시그마 알드리치	281778	(3-아미노프로필)트리에톡시실란
자율 미세유체 펌프	엘브플로우 코발트	코발트 듀얼	코발트 듀얼
비사크릴아미드	바이오라드	161-0142	2% Bis 용액
잎	피셔 사이언티픽	11733919	교훈 그룹 Hoja didá ctica X100 절름발이 비스투리 멸균 N° 23  램드23
클립	스프린티스	AKXX000001	불독 클립, 32mm, 금속, 용량 10mm, 니켈 도금
코로나 처리기	전기 기술 제품	BD-20AC, SKU:12051A	BD-20AC 실험실 코로나 처리기
컵	VWR	611-1368	VWR, 비커 컵, 일회용, 250mL
DAPI	로슈	10236276001	DAPI 염색
에탄올 96%	Panreac Quí 운모, SLU	131085-1212	에탄올 96% v/v para aná 리시스, ACS- 2,5 L
피브로넥틴	시그마	F0895	피브로넥틴, 인간 혈장, 액체 에서; 0.1%
FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어, 0.1 및 마이크로; m	라이프 테크놀로지	F8801, F8803	분해능 평가를 위한 노란색, 녹색 및 빨간색 형광 비드
FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어, 0.2 및 마이크로; m	피셔 사이언티픽	F8809, F8810	변형률 보정을 위한 황록색 및 빨간색 형광 비드
글루타르알데히드	시그마 알드리치	지6403	H2O에 글루타르알데히드 용액 50%
간섭계	비코	와이코 NT1100	PDMS 멤브레인 두께를 측정하는 간섭계
이소프로파놀	Panreac Quí 운모, SLU	131090-1212	2-프로판올 (Reag. Ph. Eur.) para aná 리시스, ACS, ISO
Laiton의 무게			맞춤 제작
보푸라기가 없는 티슈	버크셔	DURX670, DR670090920	부직포 물티슈
윤활제(바셀린)	시그마	16415	바 셀 린
마스크 정렬기	Sü ss 마이크로텍	MJB4	PMMA 플레이트의 포토리소그래피를 위한 마스크 정렬기
모위올	칼비오켐 - 머크	475904	MOWIOL 4-88 시약
NIKON 현미경 회전 디스크 공초점	니콘	이클립스 Ti-E/B	Nikon Ti-S-ER  장착; 무대
NIKON 현미경 업라이트	니콘	이클립스 Ni-E	Nikon NI-SH-E 스테이지 장착
목표 60배	니콘	CFI 아포 근적외선 60X W	NIR 아포 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
PBS 솔루션	깁코	14200067	DPBS, 10배
PDMS	다우 코닝	2401673921	실가드 - 184 실리콘 엘라스토머 키트 DN 109
페트리 접시 링 커버(대)	프로키노르테	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 직경 100
페트리 접시 링 커버(소)	프로키노르테	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
플라즈마 클리너	해릭	PDC-002	산소 플라즈마 발생기
PMMA 플레이트 및 링			보충 문서의 Excel 사양 표 참조
연장	인비트로젠	P36930 /P36934	ProLong Gold 퇴색 방지 시약
밀어내기-실란	GE 헬스케어	17-1332-01	PlusOne 반발-실란 ES
반지/고무 링	테크니필		맞춤 제작
스핀 코터	월계관	WS-650Sz	스핀 코터
스파이650-DNA	스피로크롬	SC 501	스파이650-DNA
스티어링 스푼	VWR	231-0416	에코 숏 일회용 주걱, 양단 숟가락 및 국자, PP 및 에코퓨어 첨가제
SU8 수지 2100	마이크로켐	Y111075	SU8-2100
SU8-개발자	시그마-알드리치	484431	프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트
테메드	시그마-알드리치	T9281-50ML	N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, 바이오시약 suitab. 전기영동 시약
트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란	시그마 알드리치	448931	트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란
핀셋	IESMAT	T5039	Dumont HP 핀셋 7 스테인리스 스틸. 0.17 x 0.10mm 팁. (한천 과학 주식회사)
진공 컨트롤러	GARCAP/파커	990-005203-005	Controlador de vacio
진공 컨트롤러 fluigent	유창한	루-FEZ-N800	라인업 플로우 EZ (n800mbar)
흰색 벤치 페이퍼	라이마	931.1001	종이 라이마 42 x 52