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방법 논문

브릴루앵 분광법을 이용한 구체의 기계적 매핑

2K 조회수

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DOI:

10.3791/67538

⸱

2025년 12월 12일

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 글은 브릴루앵 미세 분광법을 이용한 3D 매트릭스 내 살아있는 구형체의 기계적 특성 규격 프로토콜을 설명합니다. 이 전광학 방법은 미시적 해상도와 정량적 기계적 특성을 가진 구형 시각화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 기계적 표현형 분석에 영향을 미칩니다; 예를 들어, 3D 미세환경 내에서 종양 구상체의 병리학적 상태를 결정하는 일이 있습니다.

초록

브릴루앵 분광법은 생의학 과학에서 큰 관심을 받고 있는 신흥 기법으로, 연구자들이 비파괴적이고 접촉 없는 방식으로 표본의 점탄성 및 구조적 특성을 조사하여 역학과 구조와 관련된 정보를 수집할 수 있게 합니다. 이 접근법은 가시광선과 열로 유도된 음향파/포논과의 상호작용을 측정하여 3D 시료의 기계적 특성을 평가합니다. 브릴루앵 분광법이 제공하는 정보는 생체 내 생물물리학 평가와 질병 병리 진단에 잠재력을 가지고 있습니다. 브릴루앵 분광법의 큰 장점 중 하나는 생물학적 샘플 내부의 미시적 역학을 평가할 수 있다는 점입니다; 원자력 현미경과 같은 기존 기존의 기존의 기법들은 직접 접촉이 필요해 2D 샘플만 탐침할 수 있습니다. 이 연구는 3D 하이드로겔 매트릭스 내에 내장된 살아있는 구체의 생체역학을 조사하기 위해 브릴루앵 미세 분광법을 적용하는 방법을 설명합니다. 세포 구체를 3차원 미세환경 내에 캡슐화하면 세포와 세포외 기질 간의 경계면을 생 체 내에서 유사하게 재현하는 구형 시스템을 구축합니다. 우리 프로토콜에서는 구형 샘플 준비와 순차 형광 영상을 이용한 브릴루앵 스펙트럼 측정을 설명합니다. 또한 스펙트럼 데이터 분석 절차와 광학 시스템에 관한 기술적 세부사항도 논의합니다.

서론

3D 모델에서 세포를 배양하는 것은 일반적인 2D 세포 배양 방법에 비해 유리하며, 생체 내에서 발견되는 조직 구조와 세포 간 상호작용을 더 잘 재현할 수 있습니다. 구체는 복잡한 세포 간 상호작용을 촉진하는 3D 세포 집합체이며; 이러한 상호작용은 조직 배양 플라스틱에 단일층으로 배양된 세포에서 저조됩니다. 구체는 세포가 기원한 미세 환경을 모방한 비계 내에서 배양할 수 있습니다. 예를 들어, 하이드로겔은 강성, 분해성, 기공 크기, 성장인자1의 도입과 같은 매개변수를 정밀하게 제어할 수 있어 세포/구형 배양에 사용되는 인기 있는 생체 재료입니다(그림 1A). 기계적 신호는 암과 섬유증과 같은 질병 병리에서 생화학적 변화에 앞서 나타나는 경우가 많으므로, 임상적으로 관련된 3D 질병 모델에서 생체역학적 특징을 획득하는 것은 치료 실천을 알리고 근본적인 병태생리를 이해하는 데 중요한 역할을 합니다.

브릴루앵 현미경(BM)은 생물학적 재료의 기계적 특성을 2차원 평면 5,6,7에서 측정할 수 있게 해주는 영상 기법입니다. BM은 원자력현미경(AFM)과 탄성학과 같은 더 일반적으로 사용되는 다른 방법들에 비해 몇 가지 중요한 장점이 있습니다. AFM이 높은 시공간 기계적 해상도를 달성할 수 있고, 엘라스그래피가 샘플 8,9 내부의 역학을 탐침할 수 있다는 것은 잘 문서화되어 있습니다. BM은 조사 대상 물질과 직접 접촉할 필요가 없어, 하이드로겔 내 구상체처럼 접근이 어려운 샘플/세포에 대해 AFM 대신 이상적인 기법입니다. BM의 또 다른 주요 장점은 샘플 라벨링이 필요 없으며, 일반적으로 사용되는 탄성학 기법으로는 달성할 수 없는 미세한 해상도를 생물학적 샘플 내에서 제공할 수 있다는 점입니다; 더 발전된 광학 탄성학 기술은 미시적 해상도10에서 작동할 수 있습니다. 이질적인 생물 샘플의 브릴루앵 영상에서 정확한 유효 해상도를 정의하는 것은 간단하지 않다는 점에 주목해야 합니다. 첫째, 주어진 조명 파장에 대해서는 초점 점의 크기(대물렌즈의 수치 조리개 NA, 샘플 불투명도)를 나타내는 광학 특성에 따라 달라집니다. 또한, 시료의 기계적 특성과 브릴루앵 스펙트럼의 형태를 탐지할 수 있는 정확도는 재료의 음향 특성(포논 파장과 전파 길이)에 의해 영향을 받습니다11,12. 브릴루앵 분광법의 근본 현상은 브릴루앵 산란으로, 입사하는 단색 레이저 빛이 생체 매질 내에서 자발적이고 열에 의해 유도된 음향 포논과 상호작용하는 현상입니다. 이로 인해 빛과 (브 릴루앵 주파수 이동, BFS)의 비탄성 산란이 발생하며, 이는 일반적으로 수 GHz 정도이며, 광자가 에너지를 잃거나 얻는지에 따라 산란된 빛의 스펙트럼에서 각각 브릴루앵 스톡스와 반스토크스 피크가 검출됩니다. 매질 내 국소 음속에 의존함으로써 BFS는 탄성 종방향 계수와 관련이 있으며, 이는 다시 경험적으로 영계수 계수 7,13과 상관관계가 있습니다; 그러나 이 모듈러스를 비교할 때는 주의가 필요합니다. (i) 이들 모듈러스는 서로 직접적으로 관련이 없고, (ii) 영 모듈러스는 생물학적 샘플과 연성 물질에서 보통 Pa-kPa 범위인 반면, 브릴루앵에서 얻은 종방향 모듈러스는 GPa 범위이며, (iii) 굴절률 변화와 재료 밀도와 같은 매개변수를 고려해야 합니다. 7. 브릴루앵 선폭(그림 1B)은 BM에서 얻은 또 다른 측정값입니다. 이는 종방향 손실 계수와 관련이 있어 시료의 점도에 대한 통찰을 제공합니다; 이러한 특성들은 점탄성14와 상관관계가 있습니다. 따라서 BM은 점탄성 특성을 평가할 수 있게 하는데, BFS가 클수록 재료가 더 단단하고, 선폭이 클수록 점성이 더 높은 재료를 의미한다(그림 1B). 광자가 주파수 이동을 겪지 않는 탄성(레일리) 산란은 브릴루앵 산란에 비해 현저히 더 높은 확률을 가진다는 점을 주목해야 합니다. 따라서 브릴루앵 분광기는 레일리 신호를 억제할 수 있도록 장비되어야 합니다.

BM은 다양한 조직, 생체재료, 3D 세포 배양 모델의 기계적 특성을 특성화하는 데 사용되어 왔습니다. 예를 들어, BM은 흑색종과 주변 건강한 조직을 구분하는 데 사용되었으며, 비암성 조직이 흑색종보다 유의미하게 부드러웠음을 보여주었습니다. Rad 등은 하이드로겔의 고분자 농도를 높이면 BFS와 선폭이 증가함을 보여주었습니다. 가장 낮은 폴리머 농도에서, 세포가 포함된 하이드로겔은 빈 하이드로겔에 비해 7일 동안 브릴루앵 주파수 이동이 더 크게 감소했는데, 이는 하이드로겔의 세포 재형성 때문이라고 제안되었습니다. 이는 10% 폴리머 농도에서는 관찰되지 않아, 이 하이드로겔에서 세포 생존 능력이 부족할 가능성을 강조했다16.

본 연구와 가장 관련성 있는 것으로, BM은 구형17, 18, 19, 20의 기계적 특성을 연구하는 데 사용되었다. 특히, 국소 미세환경이 구형 역학에 미치는 영향은 BM20을 사용하여 탐지할 수 있습니다. 순응 하이드로겔에서 배양된 종양 구체와 비교했을 때, 단성 하이드로겔에서 배양된 구상체는 더 높은 BFS를 보였으며, 이는 탄성 계수20이 증가함을 나타냅니다. 구형 내 기계적 특성의 공간적 변화도 BM으로 특징지을 수 있습니다. 예를 들어, 종양 구형의 BFS는 구형 중심부로 갈수록 증가하는 것으로 나타났다20,21. 더 나아가, BFS 감소는 종양 구체의 침습성 증가와 상관관계가 있습니다20. BM은 삼투압 충격에 반응하여 종양 구형의 기계적 변화를 연구하는 데 사용되었다. 연구에서는 구형 성장을 5일간 모니터링했으며, BM으로 관찰된 암과 건강한 구형 간의 초기 기계적 차이가 시간이 지남에 따라 사라진다는 사실을 발견했습니다. 또 다른 연구에서는 7일 후 구체의 BFS가 증가했으며, 이는 구체 크기와 세포 수 증가와관련이 있다고 밝혔습니다.

또한, 브릴루앵 현미경과 AFM 및 유변학을 병행한 다중 모드 연구가 수행되어 세포와 수소겔 16,23,24의 기계적 특성을 탐구하였습니다. Rad 등은 유변학을 활용해 BM과 측정된 추세를 맥락화하여, 하이드로겔의 고분자 농도에 대해 종방향 계수와 저장 전단 계수 사이에 강한 양의 상관관계를 확립하였다16. 브릴루앵 현미경과 광학 핀셋 미세 유변학을 사용하여 3D 하이드로겔에서 배양된 암세포의 역학을 측정했다23. 본 연구에서는 하이드로겔에 현탁된 단일 세포에 비해 구형 세포에서 기계적 이질성이 감소하는 것이 발견되었습니다.

이 연구에서는 상업용 브릴루앵 현미경을 이용해 하이드로겔에 내장된 살아있는 구체의 기계적 특성을 조사하는 프로토콜이 상세히 설명되어 있습니다(그림 1). Berghaus 등은 고해상도 브릴루앵 분광기를 구축하는 절차와 기준 물질을 이용한 보정 방법을 상세히 설명했다25. 또한 Shi 등의 프로토콜은 배아 조직의 기계적 특성 변화를 모니터링하기 위해 브릴루앵 현미경을 사용하는 방법을 설명한다26. 우리는 폴리(에틸렌) 글리콜(PEG)-말레이미드 하이드로겔 내 중간엽 줄기세포(MSC) 구체를 사용하여 골수 지위를 모방하고 이 환경의 기계적 특성을 연구합니다. 이 3D 모델은 백혈병, 다발성 골수종, 2차 골암 등 골수 질환의 기계적 특징을 밝혀낼 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 기계생물학이 병리학에서 중요한 역할을 할 수 있는 다른 질병의 3D 모델로도 직접 적용할 수 있습니다. 구형 및 하이드로겔 준비, 형광 영상, 브릴루앵 현미경 기법이 상세히 설명되어 있습니다. 권장 절차, 가능한 단점, 그리고 기술의 잠재적 개선점이 논의됩니다. 상세한 실험 장비 설명은 그림 S1 과 실험 장비 관련 보조 재료 및 방법 섹션에 제시되어 있습니다.

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프로토콜

1. 2D 세포 배양

참고: 가능한 경우 모든 세포 배양 작업은 오염을 방지하기 위해 조직 배양 표준 층류 후드를 사용하여 멸균 환경에서 수행되도록 하십시오. 본 프로토콜에서는 MSC가 사용되었으나, 연구의 구체적 목적에 따라 다른 세포 유형도 구체를 만들 수 있습니다.

  1. 세포를 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피의 MSC를 세포를 4.5 g/L D-포도당, + L-글루타민에 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 μM 피루브산나트륨, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하여 세포를 덮을 만큼 충분한 부피로 배양합니다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 배양합니다.
  2. 통과 세포는 70-80% 합류율에서 0.05% 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)(첨가된 트립신 부피는 DMEM 부피의 1/3이어야 함)과 3분간 37°C, 5%CO2 로 배양하여 세포를 플레이트에서 분리합니다. 반응을 멈추려면 FBS가 포함된 배양 배지를 추가하세요(트립신 양과 최소한 일치하는 양). 혈액세포계를 이용해 세포를 세세요.

2. 구형 준비

참고: 가능한 경우 모든 세포 배양 작업은 오염을 방지하기 위해 조직 배양 표준 층류 후드를 사용하여 멸균 환경에서 수행되도록 하십시오. 이 연구에서는 마이크로웰 플레이트를 사용해 MSC 구형체를 만들었습니다. 이 판들은 24개의 웰로 구성되어 있으며, 각 웰에는 직경 400 μm의 1200개의 마이크로웰이 포함되어 있습니다. 이로 인해 많은 수의 구형체를 준비할 수 있습니다(그림 2).

  1. 마이크로웰 플레이트를 준비하기 위해, 각 웰에 500 μL의 부착 방지 세척액을 미리 첨가하여 웰을 처리합니다. 원심분리기 플레이트를 1,300g 실온에서 5분간 사용하세요. 현미경으로 20배 배율로 공기방울이 있는지 확인해 보세요. 만약 있다면, 원심분리 과정을 반복하세요. 부착 방지 세척액을 제거하세요.
  2. 플레이트를 세척할 때는 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL를 넣고 흡입하세요. 이 과정을 두 번 반복하여 헹구는 용액이 완전히 제거되었는지 확인하세요.
  3. 구형당 세포 수와 젤당 구형 수를 결정합니다. 이는 개별 연구 질문에 따라 달라집니다. 예를 들어, 구형당 100개의 세포를, 겔당 100개의 세포를 사용했습니다. 따라서 이 프로토콜에서는 마이크로웰 플레이트의 웰 하나만 필요했는데, 이는 총 1200개의 구형체를 생성하기 때문입니다. 우물 1개에 필요한 셀 수를 계산하기 위해 다음과 같은 계산을 했습니다: 1200 x 100 = 1.2 x 105. 1.2 x 105 셀을 포함하는 셀 현탁액의 부피를 계산합니다. 세포 현탁액을 300g에서 실온에서 5분간 원 심분리한 후 상상액을 제거하세요.
  4. 세포를 1 mL의 DMEM(+4.5 g/L D-포도당, + L-글루타민)에 100 μM 피루베이트나트륨, 1% NEAA, 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 보충하여 재현탁합니다. 마이크로웰 플레이트의 한 웰에 1mL의 세포 현탁액을 추가하고, 세포를 웰 전체에 고르게 분산시키기 위해 부드럽게 피펫을 위아래로 움직입니다. 기포가 생기지 않도록 조심하세요. 플레이트를 100g 원심분리기에서 3분간 실온에서 돌립니다.
    참고: 현재 단계에서는 FBS를 미디어에 추가하지 않습니다. 이는 세포가 조직 배양 플라스틱에 부착하는 것을 방지하기 위함입니다.
  5. 세포가 고르게 분포되어 마이크로웰 바닥에 가라앉았는지 현미경으로 판을 관찰하세요. 세포를 37°C, 5%CO2에서 배양합니다. 24시간 후 구형 형성을 관찰하세요.
    참고: 구체는 세포 종류와 원하던 응집성에 따라 최대 48시간까지 판에 보관할 수 있습니다.
  6. 접시에서 구체를 채취하기 위해서는 먼저 배양 배지를 천천히 부드럽게 제거하며, 구체를 건드리지 않도록 주의합니다. 구체가 플라스틱 제품에 달라붙지 않도록 피펫 팁과 튜브에 1% FBS가 포함된 PBS를 코팅하세요. 피펫 끝에 구형이 끼지 않도록 팁을 잘라 입구를 넓히세요. 이 단계에서 최대 회수 팁을 사용해 구체 손실을 방지하는 추가 조치가 될 수 있습니다. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 500 μL의 PBS를 추가하고, 피펫을 위아래로 움직여 구형을 분리합니다. 튜브 안에 부유된 구형 PBS를 수집합니다(그림 2).
  7. 현미경 아래에서 20배 확대로 판을 관찰한 후 이 과정을 반복하여 대부분의 구형이 성공적으로 제거될 때까지 반복합니다.
  8. 현수액 내 구형 수를 세기 위해, 현탁에서 96웰 판의 웰로 50 μL를 옮긴다. 50 μL 내 구형 개수를 세어보세요. 세기를 돕기 위해 영구 마커를 사용해 우물 바닥에 십자가를 그릴 수 있습니다. 구형의 수를 식(1)을 사용하여 계산하라:
    figure-protocol-1

3. PEG 하이드로겔 제제

참고: 가능한 경우 모든 세포 배양 작업은 오염을 방지하기 위해 조직 배양 표준 층류 후드를 사용하여 멸균 환경에서 수행되도록 하십시오. 이 연구에서는 PEG-말레이마이드 하이드로겔이 사용되었으나, 다른 종류도 사용할 수 있습니다. PEG-말레이이미드 수소겔은 티올-마이클 첨가 반응27을 통해 형성되었다. 사용된 가교체는 PEG-디티올과 프로테아제 분해성 펩타이드의 혼합물이며, 두 개의 시스테인 잔기(VPM 펩타이드, GCRDVPMSMRGGDRCG)가 양옆에 배치되어 있었습니다. 본 연구의 젤은 70% PEG-디티올과 30% 분해성 VPM 펩타이드를 사용했습니다.

  1. VPM 펩타이드 200 mg/mL 스톡 용액을 만들고 젤당 2.4 μL의 펩타이드를 첨가합니다. PEG-디티올 200 mg/mL 스톡 용액을 만들고 젤당 5.6 μL을 추가하세요.
  2. 구체를 PBS에 재현탁한 후 가교체와 혼합합니다(그림 2). 구형 현탁액을 PEG-디티올(겔당 5.6 μL)과 VPM(겔당 2.4 μL)과 혼합합니다. 이 해법을 솔루션 B라고 부릅니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 겔당 100개의 구형이 추가되었습니다.
  3. 250 mg/mL PEG-말레이마이드 스톡 용액을 만드세요. 젤당 50 μg의 피브로넥틴을 추가하세요. PEG-말레이마이드와 피브로넥틴 용액을 혼합하세요; 이를 용액 A라고 합니다. 피펫 용액 A(100 μL 젤 시 40.3 μL)를 12웰 조직 배양 플레이트 바닥에 부착합니다. 완전한 가교를 보장하기 위해 1:1 말레이마이드:티올의 몰 비율로 용액 B(100 μL 겔에 59.7 μL 투여)를 첨가합니다; 겔화가 즉시 일어나도록 하세요. 최종 하이드로겔 부피는 100 μL입니다.
  4. 겔을 37°C, 5%CO2 에서 30분간 배양하여 겔화를 가능하게 합니다. 웰에 완전 배양 배지(DMEM에 10% FBS, 100 μM 피루브산나트륨, 1% NEAA, 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 보충)를 추가하여 젤이 완전히 잠기도록 합니다(그림 2). 젤을 37°C, 5%CO2 에서 배양하여 브릴루앵 현미경으로 측정할 준비가 될 때까지 보관합니다.
    참고: 브릴루앵 측정 전 하이드로겔 내 구형 배양 기간은 세포 유형과 연구 질문에 따라 달라집니다. 예를 들어, 본 연구에서는 구형체를 최대 7일간 하이드로겔 내에서 배양하며, 이 기간 동안 브릴루앵 현미경으로 구형체를 모니터링합니다. 구형 캡슐화가 있든 없든 수소겔의 점탄성 특성을 특성화했으며, 구체가 겔 역학에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(그림 S2).

4. 하이드로겔 내 구체의 형광 염색 및 영상

참고: 본 연구에서는 세포 핵과 세포골격을 구성하는 액틴 필라멘트를 브릴루앵 측정 전에 형광 염색 및 영상 촬영하였습니다.

  1. 액틴 염색을 위해서는 영상 촬영 3시간 전에 1:500 희석 비율로 생액틴 염색을 배양 배지에 첨가하세요. 샘플을 은박지로 감싸서 빛에 닿지 않게 하세요. 젤을 37°C, 5%CO2에서 배양하세요.
  2. 핵 염색을 위해 영상 촬영 40분 전에 젤 주변 배양지에 생핵염색 2방울/mL를 첨가합니다. 샘플을 인큐베이터로 돌려보내세요.
  3. 염색 인큐베이션 시간이 끝난 후 가능한 한 빨리 형광 이미지를 획득하세요. 적절한 광학 경로(현미경 카메라를 노출하는 경우)와 올바른 필터 휠 위치가 선택되었는지 확인하세요. 방 안의 조명을 어둡게 하고 배경을 담으세요. 발광 다이오드(LED) 광원을 켜고 염색 프로토콜에 따라 파장을 선택합니다(여기서는 핵에 385 nm, 액틴 이미징에 621 nm가 사용됨). 선호하는 소프트웨어로 20배 배율로 구상체의 형광 이미지를 획득할 수 있습니다. 완성되면 LED 전원을 끄세요.

5. 구형의 브릴루앵 현미경

  1. 장치 전원과 레이저 방출
    1. 컴퓨터, 분광기, 현미경 카메라, 현미경, 레이저 냉각 팬, 레이저 방출 등 장치를 컨트롤러의 키를 켜서 작동시킵니다. 이 작업은 분광기 최적화 15분 전에 수행하여 레이저가 열화되었는지 확인하세요. 방출되는 레이저 전력이 예상대로 출력계(실험에서 100 mW)로 맞는지 확인하세요.
  2. 온도 제어 애플리케이션을 켜고( 재료표 참조) 에탈론 온도가 최적화되었는지 확인하려면 에탈론 이후에 빔 파워를 측정합니다. 만약 광학 밀도(OD) 필터를 고려한 후) 예상보다 현저히 낮으면, 목표 온도를 1 °C 변경하고 시간이 지남에 따라 출력이 증가하는지 관찰합니다. 감소가 있다면, 변화 방향을 반대로 돌리세요. 출력이 예상에 가까워지면 0.1 °C처럼 조금씩 조율하여 최대값에 도달합니다.
  3. 아크릴 큐브 안에 대물렌즈 초점 스팟을 설정하는 방법
    참고: 탄성 산란과 '펌프 킬러' 간 결합 억제는 각 실험 전에 단단하고 균질한 기준 물질 샘플로 최적화됩니다. 이 연구에서는 아크릴 큐브를 사용합니다.
  4. SpectraLok 소프트웨어를 열고 모든 장치가 감지될 때까지 기다리세요. 메인 창의 왼쪽(그림 3)에서 분광기 카메라를 선택하세요.
    1. 아크릴 큐브를 현미경 샘플 홀더에 설치하고, 투명한 면이 대물렌즈를 향하게 하세요. 대물렌즈를 최대한 낮추고 큐브를 그 아래에 위치시키세요. 현미경의 광학 경로가 분광기 카메라가 노출되도록 선택되도록 하세요(회전 포트 선택기를 L로 설정).
      참고: 저희 설정에서는 L 포트가 공초점 순환기에, R 은 현미경 카메라 포트에 연결되어 있습니다.
    2. SpectraLok 카메라 창에서 센서 노출 시간을 500ms, 소프트웨어 게인을 100ms로 설정하세요. 소프트웨어 게인 설정은 시각화를 위해 대비를 강화할 뿐입니다.
  5. 레이저 셔터를 막아주세요.
    참고: 레이저 방출이 켜져 있을 때, 머리나 눈을 레이저 빔 경로에 넣지 않도록 주의하세요.
    1. 캡처 버튼을 누르고 대물렌즈를 위로 움직입니다. 신호 강도가 크게 증가하고 포화 패턴(그림 4A)이 나타납니다. 이는 공기-아크릴 큐브 계면에서 레이저 빛이 강하게 반사되면서 발생합니다. 렌즈를 더 위로 올리면 신호 세기가 감소하고 브릴루앵 피크가 뚜렷해집니다. 브릴루앵 피크의 세기가 일정해질 때까지 대물렌즈의 위치를 계속 재조정합니다(그림 4B). 이는 아크릴 큐브 내부에 완전히 위치한 초점 지점에 해당합니다.
  6. 잔류 탄성 산란광을 최소화하기 위해 에탈론 압력 최적화
    참고: 다음 단계의 목적은 탄성 산란된 레일리 신호를 억제하여 주파수 이동이 걸린 브릴루앵 빛만이 분광기 카메라에 도달하도록 하는 것입니다.
  7. SpectraLok 소프트웨어에서 펌프 킬러(PK) 제어 창(그림 5)을 엽니다.
  8. 가장 밝은 브릴루앵 명령 중 하나를 확대하여 압력 액추에이터 위치를 100 μm 단위로 조절하여 Move rel을 클릭해 레일리 피크 강도를 최소화합니다. 레일리 신호가 증가하면 ' 리버스'를 클릭하여 변화 방향을 반대로 돌립니다. 그 후 에탈론 압력을 10 μm 단위로 미세 조정합니다.
    참고: 아크릴 큐브에서는 레일리 조명을 완전히 억제할 수 있습니다; 이질적인 생물학적 샘플에서는 그렇지 않을 수 있습니다.
  9. 스펙트럼 데이터를 "언래핑"하기 위해 스트라이프 오버레이 최적화
    참고: 다음 절차는 룩업 테이블 LUT 를 적용하여 카메라 센서의 (x, y) 픽셀 좌표가 파장에 적절히 매핑되도록 보장합니다.
  10. 카메라 창에서 브릴루앵 주문 중 하나를 확대하세요.
  11. 카메라 이미지에 LUT가 적용되는 줄무늬를 시각화하려면 s 키를 누르세요(그림 6A). 설정 창을 열고 빠른 보정 을 눌러 스트라이프의 최적의 수평 오프셋을 다시 계산하세요. 센서가 포화 상태라면 이 단계 전에 노출 시간을 줄이세요.
    1. 카메라 창에서 보라색 줄무늬가 브릴루앵 봉우리의 중심 영역과 잘 겹쳐져 있는지 확인하세요(그림 6B).
  12. PK 분광기 결합 최적화
  13. 콜리메이터 렌즈 축을 조정하면 PK에서 분광기로 빛을 결합하는 효율을 극대화할 수 있습니다.
  14. 스펙트럼 창을 열고 ' 언래핑 '을 클릭하면 스펙트럼을 불러옵니다(그림 7).
  15. PK 제어 창을 열어. 0.0005° 단위로 콜리메이터 축 1과 2를 반복적으로 조정하여 브릴루앵 신호를 최대화합니다. 필요 시 에탈론 압력 제어를 더욱 최적화할 수 있습니다. 균질 아크릴 큐브에서는 레일리 신호를 완전히 억제할 수 있습니다(그림 7A). 잔류 레일리 신호가 남아 있는 정확한 브릴루앵 측정은 가능하지만(그림 7B), 억제가 부실한 경우(그림 7C) 탄성 산란 빛이 브릴루앵 신호를 가립니다.
  16. 달성된 브릴루앵 신호가 기준 진폭과 비교되는지 확인하세요. 예를 들어, 우리 시스템에서 500 ms 노출 시 OD 0.3에서 브릴루앵 피크 강도 진폭은 약 3000 카운트입니다. PK 매개변수 변경 사항을 설정 파일에 저장하려면 PK 창에서 모두 새로고침 후 모두 저장하세요. 또한 메인 창에서 파일 I/O 섹션에서 저장을 누르세요.
  17. 스캔 소프트웨어로 전환하고 파라미터가 여전히 최적화되어 있는지 확인하기
  18. SpectraLok을 닫고 스캔 소프트웨어를 열어보세요. 현재 프로토콜에서는 LabVIEW 기반 소프트웨어가 사용되었으며, 그림 S3에 더 자세히 설명되어 있습니다. 스캔 기하학을 설정하기 위해 이 독점 사용자 인터페이스(UI)를 사용하여 이전 XY-Z 변환 단계를 제어합니다; 하지만 다른 방법도 사용할 수 있습니다.
    1. 아크릴 큐브 대신 하이드로겔-구형 샘플과 함께 유리 바닥 페트리 접시를 설치하세요(그림 8). 겔의 탈수를 방지하기 위해 인큐베이터는 37°C, 상대습도 95%로 설정되어 있습니다. 페트리 접시 뚜껑을 떼고 젤을 담그는 미디어를 추가하세요. 젤 윗부분에 커버슬립을 덧대어 젤이 움직이지 않도록 하세요.
    2. 구형 위치를 찾아라. 레이저 빔이 차단된 상태에서 현미경 광 경로를 접안렌즈로 전환하세요. 백색광 조명을 켜. 조이스틱을 사용해 샘플 단계를 수동으로 제어하고, 구체를 찾아 초점을 맞추세요.
    3. 구형의 밝은 시야 이미지를 확보하세요. 조종 휠을 돌려 조명 밝기를 조절하세요. 광학 경로를 R로 설정하여 현미경 카메라를 노출시킵니다. 노출 시간은 필요에 따라 조절하여 고대비 이미지(예: 50ms)를 얻을 수 있습니다.
    4. 분광기와 언래핑 파라미터가 여전히 최적화되어 있는지 확인하세요. 현미경 포트를 L 로 설정하고 레이저를 차단한 채 배경을 캡처하세요. 레이저를 막으려면 바퀴를 돌려 발사하세요. 원하는 신호 대 잡음비를 바탕으로 노출 시간을 선택하세요. 이 측정에 대한 일반적인 노출 시간은 200-500ms입니다.
    5. 초기 보정 이후 일정 시간(즉, 몇 시간)이 지났거나 시스템에 기계적 교란이 발생했다면, 에탈론 압력 설정이나 PK-분광기 결합이 더 이상 최적이 아닐 수 있습니다. 필요하다면 5.3-5.5단계를 반복하여 앞서 언급한 부분을 다시 최적화하세요.
    6. 포장되지 않은 스펙트럼 중에서 브릴루앵 피크 적합 범위를 선택하세요. 임계 값을 브릴루앵 봉우리의 강도의 약 절반으로 조정하세요. 이 임계값 이하의 브릴루앵 봉우리에서는 진폭이 무시됩니다. 모든 확인된 브릴루앵 피크 쌍에 맞춰 레이저 파장을 보정합니다.
  19. 다차원 스캔 기하학 설정
  20. 스캔 영역의 폭과 스텝 크기를 조정하여 래스터 스캔 기하학을 선택하세요.
    참고: 약 70 μm 크기의 구상체의 경우, 저해상도 스캔의 경우 일반적으로 150 μm × 150 μm, 10 μm 스텝 크기를 사용합니다. 이로 인해 약 3.4분 만에 저해상도 2D 지도가 완성됩니다.
    1. 스캔 시작해.
  21. 브릴루앵 시스템 차단
    1. 소프트웨어를 닫고 컴퓨터를 끄세요. 컨트롤러의 키를 사용해 레이저 방출을 끄세요. 셔터 휠은 막힌 위치에 두세요. 레이저 팬 냉각을 꺼. 현미경과 분광기 카메라를 꺼. 마지막으로, 현미경을 끄세요.

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결과

스캔 후 얻은 파일에는 스펙트럼, 스캔 피팅 파라미터(.csv), 스캔 파라미터 및 분석, BFS 및 선폭 맵, 관심 스캔 영역이 식별된 밝시야 이미지, UI 창 스크린샷이 포함됩니다. 다차원 브릴루앵 스캔의 각 지점마다 BFS 값이 획득됩니다. 그림 9에는 밝은 영역 이미지와 함께 고해상도 스캔 예시와 액틴 필라멘트 및 핵을 보여주는 형광 이미지가 표시되어 있습니다. 우리 시스템에서는 형광이 정밀 정량화보다는 브릴루앵 지도의 이미징 및 해석을 안내하는 데 사용된다는 점에 유의하세요. 현미경은 공초점 이미징 모듈 대신 에피 형광 기능을 갖추고 있기 때문입니다. 여기서 시료의 초점이 맞지 않은 형광이 유효 해상도에 영향을 미칩니다. 그림 9에 나타난 2D 브릴루앵 스캔 데이터와 밝은 시야 이미지를 사용하여 구형을 분할할 수 있으며, 구형체의 평균 BFS를 얻을 수 ...

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토론

우리는 하이드로겔에 박혀 있는 구체체를 미세한 해상도로 생체역학적으로 이미징하기 위해 브릴루앵 현미경 프로토콜을 확립했습니다. 하이드로겔은 BFS 값의 차이로 생체 구체와 구분할 수 있습니다. 대표적인 결과에서는 MSC 구형체와 PEG-말레이미드 수소겔을 사용했습니다. 그러나 이 프로토콜은 암 세포주와 같은 다른 세포 유형에도 널리 적용 가능합니다. 이 연구의 세포들은 생체 상태에서 관련 3D 미세 환경 내에서 촬영되었으며, 이는 생물학적으로 관련 있는 모델과 결합하여 이 플랫폼의 실현 가능성을 입증합니다. 비인간 종의 뇌, 근육, 피부, 연골 등 다양한 체외 조직에 대한 브릴루앵 이동 값이 측정되었습니다. 브릴루앵 현미경은 이전에 인간 수정체와 각막31 같은 생체 내 조직 역학을 측정하는 데 효과적이었습니다. 이 프로토콜에서 사용된 3D 마이크로환경은...

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공개 사항

저자들은 T. Allen과 G. Wardle이 이 연구에 사용된 브릴루앵 분광기를 제조 및 판매하는 LightMachinery의 직원임을 언급합니다. 이 연구의 출판은 회사에 이익을 줄 수 있습니다. 다른 모든 저자들은 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

저자들은 이 방법 개발을 지원하기 위해 MechanoMeds 2단계 보조금(UKRI/EPSRC, 보조금 번호 EP/X033554/1)으로부터 받은 자금을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4암 PEG-말레이마이드 (20 kDa)크리에이티브 PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
애그르웰 400 플레이트스템셀 테크놀로지34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
공기 공간 에탈론라이트머신러리HF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
부착 방지 세척 용액스템셀 테크놀로지7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
볼드 라인 탑스테이지 인큐베이터오콜랍H301-니콘-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
코볼트 플라멩코-100 660 nm 레이저휴브너0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
공초점 순환기라이트머신러리HF-13311해당 없음
D-LEDi 형광 조명 시스템 니콘MBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
EPI-FL 모듈니콘Ti2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
피브로넥틴 (인간)요단백질663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
깁코 둘베코' s 개조 이글 미디엄 (DMEM)서모피셔11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
하이퍼파인 브릴루앵 분광기라이트머신러리HF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B 쿼드러플 밴드 필터 큐브니콘MXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
중간엽 줄기세포(MSC)프로모션셀C-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
모터 번역 단계 이전 과학 경력H117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ 라이브 레디프로이브와 트레이드; 시약 (호에스트 33342)서모피셔R37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
목표, S 플랜 플루어 20X NA 0.45, 대공니콘MRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
ORCA-퓨전 CMOS 카메라하마마츠C14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
페그-디티올, 2 kDa크리에이티브 PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS 카메라  텔레다인 비전 솔루션01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin 스피로크롬CY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
온도앱온도 제어 소프트웨어
VPM 펩타이드, GCRDVPMSMRGGDRCG젠스크립트해당 없음해당 없음
이클립스 Ti-2A 현미경니콘이클립스 Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

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