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방법 논문

결핵 발병기전을 이해하기 위한 Mycobacterium tuberculosis 배양 여과액의 제조

1.7K 조회수

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DOI:

10.3791/67540

⸱

2025년 3월 28일

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

이 논문에서

요약

여기에서는 박테리아가 분비하는 단백질로 구성된 박테리아 성장 배지인 Mtb 배양 여과액(CF)의 제조를 보여줍니다. Mtb 는 발병에 중요한 숙주 신호 전달 및 면역 반응을 조절하기 위해 단백질을 분비합니다. 준비된 CF는 모든 분비 인자를 식별하기 위해 질량 분석법으로 분석됩니다.

초록

결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 은 숙주 신호전달, 면역 반응, 세포사멸 등과 같은 다양한 세포 과정을 조절하여 생존을 향상시키기 위해 많은 단백질을 숙주로 분비합니다. 몇 가지 분비 인자의 기능이 밝혀졌지만, 많은 것들은 아직 규명되지 않았다. 따라서 Mtb 분비 단백질을 조사하는 것은 필수적인 연구 분야입니다. Mtb 는 세 가지 분비 시스템, 즉 일반, 트윈 아르기닌 및 특수 VII 형 분비 시스템의 도움으로 단백질을 세포질 외 공간으로 분비합니다. 새로운 분비 분자를 식별하고 알려진 인자를 기능적으로 특성화하기 위해 분비체를 준비해야 합니다. 여기에서는 질량 분석법을 위한 분비체 및 시료 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 분비체 준비는 세포질 단백질의 오염을 방지하기 위해 세심한 주의가 필요하며, 이는 잘 특성화된 막, 분비 및 세포질 단백질에 대한 항체를 조사하여 모니터링할 수 있습니다. 이렇게 제조된 배양 여액은 숙주 면역조절 특성을 조사하는 것을 포함하는 다양한 목적으로 사용될 수 있습니다.

서론

전 세계적으로 가장 치명적인 병원체 중 하나인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)은 재채기나 기침을 할 때 감염된 사람으로부터 전염되는 에어로졸을 통해 건강한 사람을 감염시킵니다1. 일단 폐로 들어가면 폐포 대식세포에 삼켜져 생존을 위해 숙주 면역 체계를 장악합니다. Mtb가 생존을 위해 가지고 있는 다양한 숙주 조절 메커니즘 중 분비 독성 인자도 그 중 하나입니다. 간균이 성장하는 동안 배양 배지로 분비되는 단백질을 배양 여과액(CF) 단백질이라고 합니다2. 이러한 배양 여과액 단백질은 박테리아가 숙주 세포 내부의 가혹한 조건에서 생존할 수 있도록 도와줍니다. Mtb는 특수 VII형 분비 시스템(T7SS), 일반 Sec 분비 시스템(Sec 시스템), 트윈 아르기닌 분비 시스템(Tat system)의 세 가지 분비 시스템을 갖추고 있습니다. T7SS는 그람 음성 박테리아3의 I-VI형과 달리 악티노박테리아에서 가장 독점적인 분비 시스템입니다. 막을 가로질러 펼쳐진 단백질의 분비는 주로 Sec 시스템에 관여하며, 단백질은 N-말단 신호 서열 4,5에 의해 인식됩니다. 접히거나 부분적으로 접힌 단백질은 트윈-아르기닌 모티프 6,7을 갖는 N-말단 신호 서열에 의해 식별되는 Tat 시스템을 통해 운반됩니다. Sec 및 Tat 시스템이 단백질 분비를 조절하는 방법은 아직 결정되지 않았습니다.

감염 시 숙주의 산화적 맹공격을 견디고 생존하는 데 도움이 되는 Mtb의 일부 알려진 배양 여과액 단백질은 KatG 및 SodA 8,9와 같은 효소로, 활성 산소 종을 분해하는 데 필요합니다. 또한 이종이량체 단백질 복합체인 CFP10-ESAT6는 사이토카인 반응, 박테리아 탈출, ROS 생성 등을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.10. RD1 유전자 자리는 CFP10-ESAT6의 분비를 포함하는 VII형 분비 시스템의 조절에 관여하며, cpf10-esat6의 유전자 결실은 체외 및 생체 내 감염 모델에서 박테리아의 생존을 저해합니다. 마이코박테리움 보비스 BCG 백신 균주는 독성 인자의 분비를 담당하는 RD1 자리가 없기 때문에 약독화 생백신으로 사용할 수 있습니다11. 아직 밝혀지지 않은 다양한 세포 돌기들이 분비 과정을 엄격하게 조절합니다. 배양 여과액 단백질에는 박테리아가 잠복 상태에서 재성장하도록 돕는 소생촉진인자(RpF)가 포함되어 있습니다. 소생촉진인자(Rpfs)는 휴면기에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 펩티도글리칸 가수분해 효소입니다. Mtb는 박테리아가 단독으로 또는 다른 단백질과 상호 작용하여 휴면 상태에서 다시 자라는 데 도움이 되는 5개의 rpf 유사 유전자(rpf A-E)를 암호화합니다12. Rpfs는 박테리아 배양 여과액에서 발견되며 Mtb 독성 및 숙주 면역에 관여하는 것으로 알려져 있습니다13,14. 널리 연구된 rpf 유전자 rpfE 및 rpfB는 in vitro13에서 보호 면역을 보여주고 in vivo 면역 반응을 향상시킵니다. 따라서 rpfE 및 rpfB를 Mtb 백신 후보로 사용할 수 있습니다.

가역적 인산화 15(Reversible phosphorylation15)는 다양한 세포 과정, 세포 항상성, 세포 분열 등을 변경하는 번역 후 변형(post-translational modification)입니다. 예를 들어, CFP10의 인산화는 CFP10의 인산절제 및 모방 돌연변이가 모두 CFP10-ESAT6 결실 균주16에서 관찰된 표현형을 복원하지 못하는 경우 중요한 조절 역할을 합니다. 한편, SecA2는 숙주 세포17의 DNA 손상에 관여하는 분비 단백질이다. SecA2 돌연변이의 분비체는 숙주 면역 반응과 신호 캐스케이드18,19를 변경하기에 충분합니다. 따라서 H37Rv의 분비체와 분비 단백질의 유전자가 삭제되는 Mtb 돌연변이(미공개 데이터)를 조사하여 숙주 면역 조절 및 생존에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻는 것은 필수적이고 흥미로운 일입니다.

이 보고서는 Mtb 배양 여과액 준비, 질량 분석을 위한 샘플 처리, 면역 조절 기능을 검사하기 위해 배양 여과액을 사용한 생체 외 실험 수행과 관련된 세 가지 측면에 중점을 둡니다. 이전 연구에서는 2D 겔 전기영동에 의한 배양 여과액 단백질의 식별에 이어 질량 분광 분석8을 보여주었습니다. 약물에 민감하고 내성이 있는 균주에서 배양 여과액 단백질을 질량 분석법을 사용하여 식별하여 분비체 변화에 대한 통찰력을 얻고 약물 내성에 역할을 할 수 있는 독성 인자를 식별했습니다20. 우리는 이전에 질량 분석법16의 도움으로 Mtb의 분비체와 인분비체를 조사했습니다. 2D 겔 전기영동과 같은 기술은 처리량이 낮고 단백질체 또는 분비체의 전반적인 변화를 조사하는 데 사용되지 않습니다. 배양 여과액 단백질은 박테리아 균주, 성장 세포의 단계, 심지어 다양한 스트레스 조건에서도 다양합니다. 다양한 상황에 따라 세포 내부의 분비 단백질 풀의 변화는 전체 분비체를 전체적으로 탐색하고 치료 개입을 위한 박테리아 분비 시스템에 대한 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 각 분비 시스템의 녹아웃 또는 고갈 균주에서 분비체를 관찰하여 각 분비 경로의 경로와 표적에 대한 추가 통찰력을 얻는 것이 훨씬 더 매력적일 것입니다. 박테리아 대신 배양 여과액 단백질로 세포를 치료하면 사이토카인 수치 및 기타 면역조절 인자에 변화가 생긴다17. 분비체 연구의 도움으로 새로운 독성 인자와 독성에서 그 역할을 확인할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 여기에서는 Mtb의 H37Rv 병원성 실험실 균주를 사용합니다. Biosafety Laboratory level 3 (BSL-3)에서 박테리아 배양을 성장시키고 배양 상층액을 분리하는 데 필요한 단계를 수행해야 합니다. 배양액의 부활부터 여과액 제제에 이르기까지 BSL-3 시설이 사용됩니다.

1. Mtb 배양 접종

  1. BSL-3의 작업 영역 준비
    1. 사용하기 전에 10분 동안 생물 안전 캐비닛의 자외선을 켜십시오. 사용 전후에 75% 에탄올로 생물 안전 캐비닛을 청소하십시오. 사용된 물질은 생물 안전 지침에 따라 적절한 쓰레기통에 폐기하십시오.
  2. 1차 및 2차 Mtb H37Rv 배양 준비
    1. 글리세롤 스톡을 -80 °C에서 가져 와서 실온에서 해동합니다. 생물학적 네쌍둥이에 대해 4개의 독립적인 스톡을 사용합니다.
    2. 나사 캡이 있는 100mL 오토클레이브 원추형 플라스크에 10% ADC(7H9 배지 9mL 및 ADC 1mL)가 포함된 7H9 배지 10mL(표 1)를 복용합니다.
      참고 : 7H9 + ADC : 7H9는 상업적으로 얻어진 영양이 풍부한 배지로, ADC (ADC : 알부민, 포도당 및 카탈라아제; 표 2). ADC와 OADC 모두 배양을 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 원뿔형 플라스크는 문화에 더 많은 통기를 제공합니다. 그러나 조직 배양 플라스크를 사용하여 박테리아 세포를 성장시킬 수도 있습니다.
    3. 전체 글리세롤 스톡을 배지에 접종하여 배양액을 되살리면 1차 배양액이 됩니다. 글리세롤 스톡을 만들기 위해600 ~ 0.8 성장하는 Mtb 배양을 취하십시오. 15% 글리세롤과 성장하는 Mtb 배양액을 cryovial에 혼합하고 -80 °C에서 보관합니다.
    4. 배양 플라스크를 37°C의 인큐베이터 셰이커에서 100rpm으로 3-4일 동안 배양합니다.
    5. 5일째 에는 600nm(A600)에서 흡광도를 측정합니다. 배양액이 A600~0.8-1에 도달하면 500mL 플라스크에 7H9 +10% ADC 배지 100mL에 A600 ~0.2의 2차 배양을 접종하기 위해 배양액을 사용합니다. 반복실험에 대해 동일한 단계를 수행합니다.
      1. 기본 배양의 A600을 측정합니다. A600 이 ~ 0.8 인 경우, 2100 x g 에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 배양물을 펠릿으로 내립니다. 상등액을 버리고 펠릿을 5mL의 7H9 + 10% ADC 매체에 재현탁시킨 다음 A600을 측정합니다. A600 ~ 0.2의 2차 배양 100mL에 접종물을 얼마나 첨가할 것인지 계산한다. 예를 들어, A600 ~ 4를 사용하는 경우 A600 ~ 0.2의 신선한 7H9 + 10% ADC 2차 배양 100mL에 해당 배양액 5mL를 첨가해야 합니다.
    6. OD A600 ~ 0.8까지 2-3 일 동안 100 rpm의 인큐베이터 셰이커에서 37 ° C에서 성장합니다.
    7. 필터 팁이 장착된 피펫맨을 사용하여 10μL를 회수하고 박테리아 후드에 항생제가 포함되지 않은 LB 한천 플레이트에서 배양물을 찾습니다. 플레이트를 37°C에서 12-16시간 동안 배양하여 박테리아 오염(있는 경우)을 시각화합니다. 박테리아 오염이 감지되면 배양물을 폐기하고 실험의 새로운 배양을 되살립니다.
  3. Sauton의 배지에서 박테리아 성장
    1. A600~0.8에서 500mL 플라스크에 100mL의 Sauton 배지에 A600 ~0.2의 박테리아를 접종하고(표 3) OD가 ~0.8에 도달한 후 3-4일 동안 성장합니다.
    2. Sauton의 배지(Sauton의 1차 배양액)에서 A600 ~0.8까지 성장한 배양액을 배양액 제조에 사용할 배양액의 접종을 위해 사용합니다.
      참고: 7H9 + ADC는 알부민을 함유한 영양이 풍부한 매체입니다. 알부민은 알부민이 배양 여과액 단백질을 가릴 수 있으므로 분비체 분석에 사용할 수 없습니다. 따라서 Sauton의 배지는 배양 여과액을 제조하는 데 사용됩니다. Sauton의 매체는 표 3에 언급된 구성 요소를 재구성하여 준비됩니다.

2. Mtb 배양 여과액 단백질의 제조

  1. 배양 상등액을 위한 원심분리
    1. Sauton의 1차 배양액을 사용하여 A600 ~0.2에서 Sauton의 2차 배양 300mL를 접종합니다. OD A600 이 ~0.4-0.5가 될 때까지 배양을 성장시킵니다. 사멸 세포로 인한 오염을 방지하기 위해 활발하게 성장하는 초기 로그 단계 배양을 사용합니다.
      1. 2차 배양의 OD를 측정합니다. OD가 A600 ~ 0.8에 도달하면 2,100 x g 에서 10 분 동안 원심 분리로 배양물을 펠릿으로 만듭니다. 상등액을 버리고 펠릿을 Sauton의 배지 10mL에 재현탁한 다음 OD를 다시 채취합니다. 측정된 OD에서 0.2 OD의 300mL 배양물에 얼마나 많은 접종물이 추가될지 계산합니다. 예를 들어, OD가 8인 경우 해당 배양액 7.5mL를 0.2 OD의 신선한 Sauton 배지 300mL에 추가해야 합니다.
        참고: 세포 용해 및 GroEL 오염을 줄이기 위해 언급된 OD를 고수하십시오. GroEL은 샤프롱(chaperon)이며 박테리아 세포에서 구조적으로 발현됩니다. 일부 문헌에서는 성장 중 스트레스로 인해 배양 여과액에 GroEL이 존재함을 보여주었습니다. 여기에서 우리는 세포에 가벼운 스트레스를 제공하는 배양 여과액 준비를 위해 Sauton의 배지를 사용하고 있습니다. 따라서, GroEL은 배양 여과액에 존재할 수 있다. 또한 배양 OD가 1 이상이면 세포 용해가 발생하여 배양 여과액에서 GroEL 오염이 발생합니다.
    2. 4°C에서 10분 동안 2,100 x g 의 6, 50mL 튜브에 300mL의 성장 배양물을 펠렛으로 떨어뜨립니다(그림 1A).
    3. 펠릿을 손대지 않은 상태로 45mL의 상층액을 회수하고 25mL 혈청학 피펫을 사용하여 각 경우에 새 튜브에 넣습니다. 전장세포 용해물(WCL) 준비를 위해 펠릿을 따로 보관하십시오.
    4. 2,100 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리를 반복합니다. 25mL 혈청학적 피펫으로 40mL의 상등액을 회수하고(5mL의 배양액은 그대로 두고) 새 튜브로 원심분리 단계를 반복합니다.
    5. 35mL의 상등액을 새 튜브에 넣고 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 배양 상등액을 여과합니다. 병원성 박테리아 오염을 제거하기 위해 새 튜브에 여과하십시오. 300mL의 배양액에서 복제물당 210mL의 배양 여과액이 회수됩니다.
      참고: 배양 여과액을 걸러내기 위해 사용된 필터는 0.22μm(SY25PL-S형)의 멸균 주사기 필터입니다.
    6. 배양 여과액을 여과한 후 여과된 배양 여과액 분취액 1mL를 한천 플레이트에 접종하고 37°C 인큐베이터에서 4주 동안 배양하여 배양 여과액에 다른 병원성 박테리아 오염이 존재하는지 확인합니다. WCL(Whole Cell Lysate)에서 1mL의 부분 표본을 취하고 동일한 안전 조치를 따릅니다.
    7. 샘플 튜브를 75% 에탄올로 닦고 패스 박스를 통해 BSL-3에서 꺼냅니다.
  2. 전세포 용해물(WCL)의 준비
    1. 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유한 1x PBSG 1mL, 1x 프로테아제 억제제 칵테일에 펠릿을 재현탁하고, 용해물을 1/3 부피의 0.1mm 지르코니아 비드를 함유한 2mL 스크류캡 비드 비팅 튜브로 옮깁니다.
      참고: 1x PBSG는 1x PBS + 5% 글리세롤로 구성됩니다. 펠릿 대 버퍼 중량 비율을 1:3으로 취합니다.
    2. 미니 비드 비터에서 비드 비트로 샘플을 용해합니다 : 1 분 비드 비트 후 얼음에서 2 분 배양합니다. 이 작업을 8번 반복합니다.
    3. 18,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 새 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 상층액을 모아 얼음 위에 보관합니다.
    4. 원심분리 단계를 반복합니다. 0.2μm 주사기 필터를 통해 상층액을 통과시켜 병원성 박테리아 오염을 제거합니다.
      참고: 여기에서 배양 여과액을 여과하는 데 사용되는 필터는 0.22mm(SY25PL-S형)의 멸균 주사기 필터입니다.
    5. 75% 에탄올로 샘플을 닦고 패스 박스를 통해 BSL-3에서 꺼냅니다. 아래와 같이 BCA 분석 키트를 사용하여 용해물의 농도를 확인하십시오. 용해물을 -80 °C에서 보관하십시오.
  3. Centrifugal Filter Units를 사용하여 배양 여과액 단백질을 농축합니다.
    1. 210mL의 Mtb 배양 여과액 단백질을 원심 필터 장치를 사용하여 농축합니다. 3kDa 15mL 원심 필터 장치 튜브(원심체)를 사용하여 배양 여과액을 ~1mL로 농축합니다(그림 1A). 3 kDa 원심 필터 장치 튜브는 크기가 같거나 3 kDa보다 큰 단백질을 유지합니다.
    2. 하나의 센트리콘 튜브에 각 배양 여과액 복제물을 약 15mL 추가하고 4°C에서 1시간 동안 2,100 x g 로 원심분리합니다.
    3. 규범에 따라 플로우 스루를 폐기하고 배양 여과액 농축액 210mL가 ~1mL가 될 때까지 15x–16x에 대해 2.3.2단계를 반복합니다.
    4. 농축된 배양 여과 단백질 100μL를 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브 10개에 분취하고 BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.
  4. 농축 단백질의 추정
    1. BSA를 기준으로 단백질 농도를 추정합니다. 25 μL 부피의 1 μg, 2 μg, 3 μg 및 4 μg의 BSA를 중복하여 사용합니다. 샘플이 희석되지 않은 경우, 추정을 위해 25μL 부피의 5배 희석된(PBS 단위) 샘플을 중복하여 사용합니다. 추정은 96개의 웰 플레이트에서 수행됩니다. 25μL의 PBS를 포함하는 무시료 대조군(블랭크)을 사용합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 175μL의 혼합 시약을 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 샘플을 혼합하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. ELISA 리더를 사용하여 562nm에서 판독값을 측정합니다. 빈 값에서 값을 빼서 BSA 및 샘플에 대한 값을 구합니다.
    3. 표준 곡선을 선형 회귀 곡선에 맞추고 표준을 기준으로 표본을 추정합니다. 단백질 추정 매뉴얼에 대한 BCA 키트를 따르십시오.

3. 다양한 마커를 이용한 배양 여과액 단백질 확인

  1. Coomassie 염색에 의한 단백질 검출
    1. 배양 여과액에서 단백질의 존재를 확인하려면 단백질 30μg을 복용하고 10% 나트륨 도데실 설페이트 – 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE; 표 4).
      알림: 표 설명에 따라 SDS-PAGE, Coomassie 염색 및 탈염 용액 완충액을 만드십시오.
    2. 20mL의 Coomassie 염색 용액(표 5)을 겔에 추가하고 실온에서 로커에서 30분 동안 배양합니다. 염색 용액은 버리십시오.
    3. 30mL의 탈염 용액(표 6)을 겔에 넣고 실온의 로커에서 30분 동안 배양합니다. 탈염 용액을 버리고 새 탈염 용액을 추가하십시오. 젤이 제대로 얼룩 질 때까지 반복하십시오.
    4. 트랜스 조명기의 단백질 줄무늬를 확인합니다(그림 1B). 배양 여과액 단백질에는 여러 단백질이 포함되어 있기 때문에 탈색 후 겔에서 단백질 띠 줄무늬를 볼 수 있습니다(그림 1B).
  2. 분비 단백질 마커에 대한 웨스턴 블롯 확인
    1. 분비된 단백질의 항체를 이용하여 배양여과액에서 분비된 단백질의 존재 여부를 확인합니다. Ag85B(ab43019)는 배양 여액에서 잘 알려진 Mtb 분비 단백질이며 세포질에 존재합니다. Ag85B(농도 5mg/mL) 항체(5% BSA에 1:5000 희석)는 분비된 단백질에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다.
    2. WCL에 배양 여과액 단백질을 로드하여 세포졸성/멤브레인과 분비된 단백질 분획을 구별합니다. Ag85B는 세포질이며 분비되므로 두 분획 모두에 존재해야 합니다. 반면에, PknB는 멤브레인에 국한되어 있는 것으로 알려져 있으며, 배양 여액에는 존재하지 않는다.
    3. BCA 키트를 사용하여 WCL/배양 여과액의 단백질 농도를 측정합니다. 30 mL 부피에 30 μg의 WCL/배양 여과액과 2x-lamelli 완충액을 혼합합니다(표 7). SDS 겔 runnimg 버퍼를 사용하여 염료 전면이 바닥에 도달할 때까지 PknB의 경우 10% SDS-PAGE, Ag85B의 경우 12% SDS-PAGE에서 샘플을 분해합니다(표 8). 염료가 젤에서 흘러나오지 않도록 하십시오.
      참고: Ag85B의 크기는 ~35kDa이므로 12% SDS-PAGE가 사용됩니다.
    4. 9cm x 6cm 0.2μm 니트로셀룰로오스 멤브레인을 절단하여 겔에서 멤브레인으로 단백질을 이동시킵니다(표 9). 전사 카세트를 사용하여 전사를 설정하고 카세트, 폼 패드, 블로팅 페이퍼, 젤 및 멤브레인을 1x 얼음-냉기 전사 버퍼에 담그십시오.
    5. 폼 패드를 카세트의 한쪽 면에 놓은 다음 블로팅 페이퍼를 놓고 젤을 바르고 젤 위에 니트로셀룰로오스 멤브레인을 놓고 블로팅 페이퍼를 다시 놓고 마지막으로 다른 폼 패드를 놓고 카세트 홀더를 닫습니다. 카세트 홀더를 이송 탱크에 놓아 멤브레인 면이 양극을 향하고 젤 면이 음극을 향하도록 합니다.
    6. 음극과 양극 리드를 탱크에 연결하여 설정을 닫고 120분 동안 120mA 전류로 설정합니다. 추운 방에서 전송을 시작합니다.
    7. 전송이 끝난 후 멤브레인을 작은 플라스틱 상자에 넣습니다. 1x PBST20 으로 만든 10mL의 5% BSA 용액을 사용하여 멤브레인을 차단하여 로커의 실온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 줄입니다.
    8. 차단액을 제거하고 항-마우스 Ag85B 항체인 1차 항체 5-10mL(5% BSA 용액에 1:5,000 희석)를 첨가하고 로커에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 항체를 -20°C에서 보관하고 최대 3배까지 재사용하십시오.
    9. 1차 항체를 제거하고 1x PBST20 5-10mL를 첨가한 후 실온에서 8분 동안 격렬하게 흔들어 멤브레인을 세척합니다. 첫 번째 세척을 제거하고 5x PBST20 5-10mL 를 다시 첨가한 후 세척합니다. 이 작업을 2회 반복합니다.
    10. 항-마우스 HRP(Redox peroxidase) 접합 항체(1:10,000 희석)인 2차 항체가 포함된 1x PBST20 5-10mL를 추가하고 로커에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    11. 3.2.9 단계에 따라 2 차 항체 후 멤브레인을 세척합니다. 동일한 양의 HRP 기질과 인핸서를 추가하여 화학광계(chemiluminometer) 아래에서 멤브레인을 개발합니다(그림 1C).
      참고: 세포질 단백질 오염이 없음을 확인하기 위해 항-PknB 항체로 웨스턴 블롯을 조사했습니다(그림 1C). 이 항체는 동물 시설인 국립면역학연구소(National Institute of Immunology)에서 정제된 PknB의 세포질외 도메인(extracytoplasmic domain)에 대해 제기되었습니다. 배양 여과액이 아닌 WCL에서 PknB 띠를 관찰할 수 있으며, PknB는 단독으로 세포질이고 막에 결합되어 있으므로 배양 여과액에 존재해서는 안 됩니다.

4. 질량 분석법을 위한 샘플의 준비

  1. 트립신(Trypsin)에 의한 용액 내 단백질 분해를 수행합니다.
    1. 배양 여과액 단백질 100μg을 취하고 얼음처럼 차가운 아세톤 6배를 첨가한 후 -20°C에서 하룻밤 동안 유지합니다.
      참고: 유리 제품을 사용하여 질량 분석 샘플에 대한 모든 시약을 준비합니다. 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브와 저단백질 결합 팁을 사용합니다. 질량 분석 분석에서 폴리머 오염을 방지하기 위해 플라스틱 재료를 사용하지 마십시오.
    2. 18,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 단백질을 침전시킵니다. 상등액을 버리십시오.
    3. 펠릿을 500μL의 아세톤으로 세척하고 18,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 펠릿을 아래로 내립니다. 상등액을 버리십시오. 진공 농축기를 사용하여 잔류 아세톤을 제거하십시오.
    4. 25mM 중탄산암모늄(MS 등급의 물에서 준비된 2M 스톡)에 용해된 8M 요소 20μL를 추가합니다. 샘플을 소용돌이치고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    5. 광고 60 μL의 25 mM 중탄산 암모늄을 사용하여 8 M 요소를 2 M로 희석합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 4μL의 TCEP(25mM 중탄산암모늄에서 만든 10mM 최종 농도)를 추가하고 1,800 x g에서 진탕하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    6. 4 μL의 IAA(25 mM 중탄산암모늄에서 만들어진 25 mM 최종 농도)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하고 어둠 속에서 1,800 x g 으로 진탕합니다. 110μL의 25mM 중탄산암모늄을 추가합니다.
    7. 트립신을 추가합니다(1:20; 트립신: μg 단위의 단백질)을 용액에 넣고 37°C로 유지하고 300rpm으로 흔들어 하룻밤 동안 분해합니다(그림 2). 10% TFA(트리플루오로 아세트산)를 첨가하여 분해 반응을 중지합니다. 샘플을 진공 청소기로 완전히 건조시킵니다.
  2. 시료 탈염
    1. 분해된 펩타이드에 100μL의 5% ACN + 0.1% TFA를 추가합니다. 실온에서 1,500rpm에서 30분 동안 와류.
    2. 18,000 x g 의 원심분리기를 실온에서 10분간 사용합니다. 펠릿을 건드리지 않고 상층액(펩타이드)을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 탈염을 진행합니다. 탈염 단계 전에 모든 세척 및 용출 용액을 만드십시오.
    3. 용액을 피펫팅하고 이 과정을 5회 반복하여 C-18 컬럼 팁을 100μL의 100% ACN + 0.1% TFA로 평형을 이룹니다.
    4. 100μL의 50% ACN + 0.1% TFA를 추가하고 이 과정을 5회 반복합니다. 100μL의 5% ACN + 0.1% TFA를 추가하고 이 과정을 5회 반복합니다.
    5. 30x 피펫팅을 통해 C-18 컬럼 팁에서 펩타이드 결합이 발생하도록 합니다. 샘플이 질량 분석을 위해 처리될 때까지 용액을 -20°C로 유지하십시오. 이제 펩타이드는 C-18 컬럼에 결합됩니다.
    6. 피펫팅으로 C-18 컬럼을 100μL의 MS 등급 물 + 0.1% TFA로 세척하고 이 과정을 5회 반복합니다.
    7. 피펫팅을 통해 C-18 컬럼을 100μL의 5% ACN + 0.1% TFA로 세척하고 이 과정을 5회 반복합니다. 30x 피펫팅을 통해 C-18 컬럼의 펩타이드를 100μL의 50% ACN + 0.1% TFA로 용리합니다(그림 2).
      참고: 용리 후 C-18 컬럼 팁은 질량 분석이 완료될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    8. 용리된 펩타이드를 완전히 진공 청소기로 청소하고 샘플이 질량 분석을 위해 제공될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  3. 펩타이드 시료를 질량 분석법(Mass spectrometry)에 주입합니다.
    1. 건조된 펩타이드 샘플에 20μL의 용액 A(질량 분석 시설에서 제공)를 추가합니다. 4°C에서 샘플을 30분 동안 소용돌이치고 90분 동안 원심분리기를 합니다.
    2. 20μL의 시료를 질량분석기에 주입하여 90분 동안 그래디언트를 실행합니다.

5. 배양 여과액에 존재하는 분비 단백질에 대한 데이터 분석

  1. 단백질 식별
    1. Quadrupole 질량분석기를 사용하여 단백질체학 시료를 분석합니다. Mtb H37Rv UniprotKB 데이터베이스에 대해 얻은 스펙트럼을 쿼리합니다.
    2. 전구체 및 단편 질량 허용 오차를 10ppm 및 0.5Da로 설정합니다. 효소를 최대 누락된 절단 값 2로 Trypsin으로 설정합니다.
    3. 시스테인의 카바미도메틸화를 고정 변형으로 사용하는 검색 알고리즘으로 Sequest를 사용하는 프로테옴 소프트웨어를 사용합니다.
    4. 1%의 거짓 발견률로 모든 펩타이드-스펙트럼 일치(PSM)를 식별합니다. 다른 모든 매개변수에 대해 기본 설정을 적용합니다.
    5. 펩타이드 염기서열의 원시 질량 분석 파일을 각 Mtb 단백질의 UniProt ID와 매핑합니다. Mycobrowser 데이터베이스를 사용하여 모든 Mtb 단백질, Uniprot ID 및 기능 분류를 나열합니다.
    6. 추가 분석을 위해 식별된 단백질의 UniProt ID를 해당 Rv 번호에 매핑합니다. PRIDE 파트너를 통해 질량분석법 분비체 데이터를 ProteomeXchange Consortium에 기탁합니다.

6. H37Rv 를 배양 여과액 단백질로 처리하여 숙주 신호의 변화를 확인합니다.

  1. 마우스에서 복막 대식세포의 분리.
    참고: 복막 대식세포 분리, 세포 파종 및 감염에 대해서는 참고 문헌21 을 따르십시오.
    1. Balb/c 마우스(4-6주령)에게 1mL의 4% 티오글리콜레이트를 주입하고 감염 4일 째에 마우스 복막에서 복막 대식세포를 분리합니다21 (그림 3).
    2. 마우스 복막에 1x PBS를 주입하여 대식세포 세포를 수집합니다. 1,800 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 상층액을 버리고 10% FBS(소 태아 혈청, 완전 배지) 및 1x pen-strep(항생제)이 보충된 1640-RPMI 배지 5mL를 추가합니다.
    3. 24개의 웰 플레이트에 웰당3 x 10 5개의 세포를 파종하고 37°C 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날, 배지를 신선하고 완전한 배지로 바꾸면 세포는 감염 또는 배양 여과액 단백질로 처리할 준비가 됩니다.
  2. 배양 여과액 단백질을 이용한 복막 대식세포의 처리
    1. 대식세포 세포를 BSL-3로 가져가 인큐베이터에 보관합니다. 1mg/mL 배양 여과액 단백질로 세포를 처리합니다(그림 3). 4시간, 24시간 및 48시간 배양 후 여과액 처리의 서로 다른 시점에서 세포를 수확합니다.
      1. 분리된 대식세포 세포를 24개의 웰 플레이트에 각 시점마다 3회씩 파종합니다. 세포를 1mg/mL의 배양 여과액 단백질로 처리하고 CO2가 있는 상태에서 37°C 인큐베이터에서 배양합니다. 처리 후 4시간, 24시간 및 48시간의 세 가지 시점에서 세포를 수확합니다.
      2. i) 2x-lamella buffer로 세포를 처리하여 대식세포 세포를 용해시키고 Western blotting을 수행하여 다른 숙주 세포 마커를 확인하고, ii) 키트와 함께 제조업체에서 제공하는 면역학적 분석을 위한 다른 buffer로 세포를 처리합니다.
    2. 숙주의 세포 용해물을 준비하고 배양 여과액 처리된 대식세포 세포에서 다양한 마커, 숙주 세포의 사이토카인 프로파일링 및 다양한 신호 경로 단백질 발현을 확인합니다.
      참고: 실험실에 분비 경로 단백질의 유전자 대체 돌연변이가 있는 경우 Mtb H37Rv 및 Mtb 돌연변이에서 준비된 배양 여과액을 사용하여 숙주 면역 조절 매개변수에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

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결과

이 프로토콜에서는 Mycobacteria 에서 배양 여과액 단백질을 분리하는 것을 입증했습니다(그림 1A). 그런 다음 배양 여과액 분리를 확인하기 위해 다른 마커에 대해 배양 여과액 단백질을 검사했습니다. 프로토콜에서 언급한 바와 같이, 단백질 로딩을 확인하기 위해 Coomassie 염색을 수행했습니다. WCL 분획( 마지막 레인 그림 1B)에서 줄무늬 단백질 띠를 관찰할 수 있는 반면, CF(배양 여과액) 레인에서는 모든 단백질이 보이지 않았고 모든 레인의 단백질 로딩이 동일했습니다. 분리된 서로 다른 분획을 확인하기 위해 서로 다른 항체로 웨스턴 블롯을 수행했습니다. Ag85B를 사용하여 배양 여과액 분획을 확인하였다. ~35 kDa 단백질 띠는 배양 여과액과 WCL 모두에 존재하는 그림 1C 의 Ag85B에 해당하는 것으로 관찰되었습니다. PknB...

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토론

중요한 연구 분야 중 하나는 Mtb 발병 기전을 이해하고 효과적인 진단 및 백신을 개발하는 것과 관련이 있습니다22,23. Mtb 배양 배지에서 배양 여과액 단백질을 분리하는 것은 병원체가 분비하는 독성 인자를 식별할 수 있는 프로세스입니다. Mtb 발병 기전을 조절하는 데 있어 분비 단백질의 역할을 조사하면 기계론적 통찰력을 얻을 수 있으며 치료 개입을 위한 후보를 제공할 수도 있습니다. 연구에 따르면 H37Rv 배양 여과액에는 숙주 세포의 항상성, 세포 과정 및 전사 조절을 조절하는 단백질이 포함되어 있습니다. 일부 배양 여과액 단백질은 숙주 세포의 침입을 돕고 박테리아가 대식세포 내에서 생존하도록 돕습니다. 이러한 단백질은 숙주 세포 경로를 조작하여 박테리아 생존을 위한 틈새를 만들 수 있습니다....

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; m 주사기 필터mdiSYPL0601MNXX204
0.2µ m 니트로셀룰로오스 멤브레인Amersham10600001
37% HClMerckH1758
아세톤EMPLURA MERCKSL9F690866
아세토니트릴시그마-알드리치34851-2L
아크릴아미드BIORAD1610107
알부민바이오 베이직 캐나다고양이 번호: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
암모늄 바이오카보네이Sigma-Aldrich09830-500G
과황모늄Sigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-mouse HRP conjugated secondary antibodyThermo Fischer62-6520
AsparagineSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrylamideSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 컬럼Thermo FischerSEM SS18V
Catalase Sigma-AldrichC1345
시트르산Sigma-AldrichC0759-500G
덱스트로스Sigma-AldrichG7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 육수   Fisher Scientific271310
페릭 암모늄(III) 구연산염 시그마-알드리치F5879-100G
포름산 98-100%머크Z0823704246
빙초산 100%머크CD0C700160
글리신시그마-알드리치G8898-1KG
글리신시그마G8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP 기판MerckWBKLS0500
IodoacetamideAmershamRPN6302V
마그네슘 황산Sigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
올레산시그마고양이 번호: O1008
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteom Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (단백질체학 실험 - 펩타이드 염기서열분석, 단백질 식별 및 정량화)Thermo Fischer Scientific
염화나트륨시그마고양이 번호 : S3014
염화나트륨시그마 - 알드리치S7773-1KG
나트륨 도데 실 황산염시그마 - 알드리치L3771-1KG
TCEP시그마 - 알드리치C4706-25
테메드시그마 - 알드리치T9281-100ML
트리스 베이스BioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
트윈 80Sigma-AldrichP1754
UniProt 단백질 데이터베이스
우레아MP 바이오194857
트

참고문헌

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