우리는 라이브 이미징이 가능한 ctenophore Mnemiopsis leidyi에서 statocyst 및 관련 조직을 제거하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
ctenophore Mnemiopsis leidyi 는 전신 재생의 고전적인 동물 모델입니다. 많은 실험실 기술에 대한 다루기 쉬움이 증가하고 나머지 후생동물의 자매 그룹으로서의 계통 발생 배치로 인해 최근 ctenophores 작업에 대한 과학적 관심이 새로워졌습니다. 그들은 며칠 동안 신체의 ~15%만큼 작은 조각에서 완전한 전신 재생을 포함하여 누락된 장기나 세포 유형을 재생할 수 있습니다. 대부분의 ctenophores와 마찬가지로 M. leidyi 는 신체 위치와 방향을 제어하기 위해 감각 입력과 운동 출력을 연결하는 잘못된 위치에 있는 중력 감지 기관을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 다음 몇 시간에서 며칠 동안 발생하는 상처 치유 및 재생 과정을 이미지화하는 데 적합한 배양, 취급 및 장착 방법과 함께 M. leidyi 의 배양 장기(AO) 복합체 및 관련 구조의 외과적 제거를 보여줍니다. 이러한 간단한 기술은 다양한 실험 패러다임과 실험실 상황에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
서론
빗 젤리라고도 알려진 Ctenophores는 지구의 해양 환경에 국제적이며 특히 먹이 그물의 일부로서 생태계의 주요 역할을 할 수 있습니다. ctenophore Mnemiopsis leidyi는 전신 재생의 역사적이고 점점 더 인기 있는 동물 모델입니다 1,2. 누락된 장기 또는 세포 유형을 재생하는 능력은 배아 발생이 끝날 무렵에 발생하며 배아 후 수명 3,4(신체 크기가 ~0.1 내지 >1,000mm) 동안 지속됩니다. 그들은 또한 평생 동안 투명하며 다양한 라이브 및 고정 이미징 기술을 사용할 수 있습니다. 모든 ctenophores의 가장 최근의 공통 조상은 많은 세포 유형과 복잡한 기관을 가지고 있었습니다. 현존하는 대부분의 ctenophores는 적어도 하나의 생애 단계에서 이들 중 대부분을 소유합니다: 낙태, 중력 감지 기관(역사적으로 정점 기관이라고 불림, 여기서는 aboral organ, AO라고 함), 조정된 방식으로 뛰는 고도로 조직화된 거섬모로 구성된 특수 운동 구조(빗 줄), 개폐식 섭....
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프로토콜
1. 도구 및 소모품 준비
- 표준 분젠 버너를 사용하여 유리 모세관 마이크로피펫에서 유리 해부 바늘을 손으로 당깁니다. 1mm 이상의 동물의 경우 액체 취급용으로 보정된 소다석회 유리 마이크로피펫을 사용하십시오.
참고: 100μl 크기는 0.5-3mm의 초점 범위에서 잘 작동합니다.- 분젠 버너에 날카로운 파란색 원뿔 불꽃을 설정합니다.
- 유리 피펫의 중심점을 부드러운 압력으로 움직일 수 있을 만큼 부드러워질 때까지 화염에 담그십시오.
- 불꽃에서 피펫을 제거하고 즉시 양쪽을 똑바로 당겨 짧고 강한 바늘을 만듭니다.
알림: 첫 번째 시도에서 만족스러운 결과를 얻지 못한 경우 유리 바늘을 다시 녹일 수 있으며 부러진 바늘을 저장하고 다시 당길 수 있습니다. 이 방법으로 당겨진 사용 가능한 바늘과 사용할 수 없는 바늘의 예는 그림 2 를 참조하십시오.
대안: 26G 1/2인치 바늘도 특히 초점 크기 범위의 더 큰 끝에서 잘 작동합니다.
- 0.22μm 필터를 통해 천연 또는 인공 해수를 통과시켜 멸균 해수를 준비합니다. ....
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결과
Cydippid-stage M. leidyi 는 일반적으로 손상 후 ~20분 이내에 상처 봉합을 완료하는 반면(그림 4 및 그림 5), 장기의 완전한 재생에는 1-3일이 소요될 수 있습니다. 이 시기는 약간의 생물학적 가변성이 있지만 거의 항상 수술 후 72시간까지 완료됩니다(그림 6).
외측 장기 복합체와 인근 조직에서 세포와 메조글레아를 외과적으로 제거한 후 상처를 빠르게 봉합하면 수술 전후 이미지에서 알 수 있듯이 전체적으로 신체 직경이 작아집니다(그림 3).
0.5-3mm 크기 범위의 cydippid 단계 M. leidyi 를 사용하여 우리 연구실의 학부생은 이 프로토콜에 따라 재.......
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토론
원하는 모든 크기의 M. leidyi에 대해 유사한 실험을 수행할 수 있습니다. 장기의 형태 형성은 재생 능력의 시작과 동시에 완료됩니다4. 동물은 야생에서 수집되거나 실험실에서 사육될 수 있다19 또는 실험실에서 사육될 수 있다20,21. 특정 신체 크기를 원하는 경우 동물을 산란시키고 자손을 원하는 크기로 키울 수 있습니다. 본체 크기는 프로토콜 단계 1.3에서 만든 측정 피펫을 사용하여 원하는 내경으로 절단하여 근사화할 수 있습니다(그림 3). 더 작은 피펫과 더 큰 피펫을 사용하면 다양한 크기의 동물 풀을 모을 수 있습니다. 더 큰 동물의 경우 취급이 더 쉬워지지만 고정 및 이미징이 더 어려워지고 신체 크.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 Jovita Joseph에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m SFCA 주사기 필터 | 써모/날진 | 723-2520 | 멸균 해수 생성 |
| 35mm 폴리스티렌 페트리 접시 | 팔콘/코닝 | 351008 | 컷을 수행합니다. 작은 동물 문화 |
| 60 mL 일회용 루어락 주사기 | BH 용품 | BH60LL | 멸균 해수 생성 |
| 보정된 유리 피펫, 100 & L | 드러먼드 | 2-000-100 | 컷 수행 |
| 커버 안경, #1.5, 18mm 정사각형 | VWR | 16004-326 | 이미징용 마운트 |
| ctenophores | 걸프 표본 | 살아있는 동물 | |
| 이중 캐비티 유리 함몰 슬라이드, 1.3 mm | VWR | 470200-930 | 이미징용 마운트 |
| 유리 현미경 슬라이드 | VWR | 16004-398 | 이미징용 마운트 |
| 인스턴트 오션 바다 소금 | 인스턴트 오션 | 동물 배양 배지 | |
| 미니 눈금자 | 테드 펠라 | 13623 | 플라스틱 피펫 측정 |
| 모델링 점토(플라스틱) | 페피 플라스틸리나 | 이미징용 마운트 | |
| 바셀륨 젤리 | 바 셀 린 | 이미징용 마운트 | |
| 플라스틱 이송 피펫(다양한 크기) | 콜-파머 | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | 작은 동물 이동 |
| Rain-X 유리 처리 | 레인-X | 현미경 슬라이드 실라나이즈 | |
| 통치자 | 웨스트콧 | 10564 | 플라스틱 피펫 측정 |
| 가위 | 옥소 | 플라스틱 피펫 절단 |
참고문헌
- Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
- Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
- Martindale, M. Q.
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