우리는 라이브 이미징이 가능한 ctenophore Mnemiopsis leidyi에서 statocyst 및 관련 조직을 제거하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
ctenophore Mnemiopsis leidyi 는 전신 재생의 고전적인 동물 모델입니다. 많은 실험실 기술에 대한 다루기 쉬움이 증가하고 나머지 후생동물의 자매 그룹으로서의 계통 발생 배치로 인해 최근 ctenophores 작업에 대한 과학적 관심이 새로워졌습니다. 그들은 며칠 동안 신체의 ~15%만큼 작은 조각에서 완전한 전신 재생을 포함하여 누락된 장기나 세포 유형을 재생할 수 있습니다. 대부분의 ctenophores와 마찬가지로 M. leidyi 는 신체 위치와 방향을 제어하기 위해 감각 입력과 운동 출력을 연결하는 잘못된 위치에 있는 중력 감지 기관을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 다음 몇 시간에서 며칠 동안 발생하는 상처 치유 및 재생 과정을 이미지화하는 데 적합한 배양, 취급 및 장착 방법과 함께 M. leidyi 의 배양 장기(AO) 복합체 및 관련 구조의 외과적 제거를 보여줍니다. 이러한 간단한 기술은 다양한 실험 패러다임과 실험실 상황에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
서론
빗 젤리라고도 알려진 Ctenophores는 지구의 해양 환경에 국제적이며 특히 먹이 그물의 일부로서 생태계의 주요 역할을 할 수 있습니다. ctenophore Mnemiopsis leidyi는 전신 재생의 역사적이고 점점 더 인기 있는 동물 모델입니다 1,2. 누락된 장기 또는 세포 유형을 재생하는 능력은 배아 발생이 끝날 무렵에 발생하며 배아 후 수명 3,4(신체 크기가 ~0.1 내지 >1,000mm) 동안 지속됩니다. 그들은 또한 평생 동안 투명하며 다양한 라이브 및 고정 이미징 기술을 사용할 수 있습니다. 모든 ctenophores의 가장 최근의 공통 조상은 많은 세포 유형과 복잡한 기관을 가지고 있었습니다. 현존하는 대부분의 ctenophores는 적어도 하나의 생애 단계에서 이들 중 대부분을 소유합니다: 낙태, 중력 감지 기관(역사적으로 정점 기관이라고 불림, 여기서는 aboral organ, AO라고 함), 조정된 방식으로 뛰는 고도로 조직화된 거섬모로 구성된 특수 운동 구조(빗 줄), 개폐식 섭식 촉수 및 유해한 자극에 반응하여 생물 발광하는 광세포(그림 1).
수많은 세포 유형과 복잡한 상황에 따른 행동에도 불구하고, 강력한 게놈 데이터는 ctenophores가 다른 모든 살아있는 동물의 자매 그룹일 가능성이 있음을 뒷받침합니다 5,6,7,8. 신경계를 소유한 다른 동물(양측성 및 자포류)과 ctenophore 신경계의 세포 및 기능적 기초의 주요 차이는 ctenophore 신경계가 독립적인 기원을 나타낸다는 가설을 제안했습니다. 그러나 이것은 여전히 불확실합니다 9,10,11,12.
외측 감각 기관 복합체는 여러 유형의 추정 신경 감각 세포 13,14,15,16,17,18을 포함하는 많은 세포 유형을 포함하는 스테이토낭종을 포함하며, 조작되지 않은 ctenophores에서 지속적인 유지 보수를 받고 있습니다. 기계적 감각 세포는 중력을 감지하기 위해 생체 광물화된 세포(암석세포라고 함)로 구성된 statolith에 의해 편향되는 큰 모양체 다발을 가지고 있습니다. 알 수 없는 기능의 추정 감각 구조(14)와 가능한 광감각 세포(16)를 포함하는 두 개의 "극성장"이 스테이토시스트에 인접해 있습니다.
M. leidyi의 재생 능력에 대한 실험적 조사는 배아에서 부화한 새끼 전환(~100μm)에서 자유 생활의 거시적 성체(>2cm)까지 가장 작은 동물에 걸쳐 있습니다. 몸 직경이 ~1mm인 M. leidyi는 마이크로 매니퓰레이터와 같은 특수 기구 없이 수동 수술 조작이 가능할 만큼 충분히 크지만 고출력 대물렌즈로 이미징하기 위해 표준 현미경 슬라이드에 장착할 수 있을 만큼 작습니다. 이 프로토콜은 다음 몇 시간에서 며칠 동안 발생하는 상처 치유 및 재생 과정을 문서화하는 데 적합한 배양 및 이미징 방법과 함께 외측 감각 기관 및 관련 구조의 외과적 제거를 보여줍니다.
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프로토콜
1. 도구 및 소모품 준비
- 표준 분젠 버너를 사용하여 유리 모세관 마이크로피펫에서 유리 해부 바늘을 손으로 당깁니다. 1mm 이상의 동물의 경우 액체 취급용으로 보정된 소다석회 유리 마이크로피펫을 사용하십시오.
참고: 100μl 크기는 0.5-3mm의 초점 범위에서 잘 작동합니다.- 분젠 버너에 날카로운 파란색 원뿔 불꽃을 설정합니다.
- 유리 피펫의 중심점을 부드러운 압력으로 움직일 수 있을 만큼 부드러워질 때까지 화염에 담그십시오.
- 불꽃에서 피펫을 제거하고 즉시 양쪽을 똑바로 당겨 짧고 강한 바늘을 만듭니다.
알림: 첫 번째 시도에서 만족스러운 결과를 얻지 못한 경우 유리 바늘을 다시 녹일 수 있으며 부러진 바늘을 저장하고 다시 당길 수 있습니다. 이 방법으로 당겨진 사용 가능한 바늘과 사용할 수 없는 바늘의 예는 그림 2 를 참조하십시오.
대안: 26G 1/2인치 바늘도 특히 초점 크기 범위의 더 큰 끝에서 잘 작동합니다.
- 0.22μm 필터를 통해 천연 또는 인공 해수를 통과시켜 멸균 해수를 준비합니다.
- 측정 피펫을 만듭니다.
- 날카로운 가위나 면도날을 사용하여 플라스틱 전사 피펫을 잘라 원하는 크기의 내경으로 구멍을 만듭니다. 원하는 범위의 상단에 대해 하나 이상의 피펫을 준비하고 원하는 범위의 하단에 대해 하나 이상의 피펫을 준비하십시오. 측정 피펫 세트의 예는 그림 3 을 참조하십시오.
참고: 이 피펫은 최대 ~8mm까지 잘 작동합니다. 마이크로미터나 사진에서 측정 도구를 사용하여 크기를 추정하는 것도 가능합니다.
- 날카로운 가위나 면도날을 사용하여 플라스틱 전사 피펫을 잘라 원하는 크기의 내경으로 구멍을 만듭니다. 원하는 범위의 상단에 대해 하나 이상의 피펫을 준비하고 원하는 범위의 하단에 대해 하나 이상의 피펫을 준비하십시오. 측정 피펫 세트의 예는 그림 3 을 참조하십시오.
2. 실험을 위한 동물 준비
- 원하는 크기와 단계의 형태학적으로 정상적인 개체를 선택합니다.
참고: 직경 ~0.5-3mm의 동물이 슬라이드에 장착하기에 최적이라는 것을 알았습니다. 동물이 최하위 크기 피펫에 맞지 않지만 최상위 크기 피펫에 편안하게 맞는지 확인하십시오. - 실험 동물을 8-16시간 동안 굶주리게 합니다.
참고: M. leidyi 는 광학적으로 투명하고 자가형광이 높지 않지만 소화 시스템을 통해 순환하는 음식은 일반적으로 불투명하고 종종 자가형광을 나타냅니다.
3. 절단 수행
- 실험 동물의 신체 크기보다 넓은 이송 피펫을 사용하여 멸균 해수가 들어 있는 35mm 폴리스티렌 접시에 이송합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 샘플을 시각화합니다. 한 마리의 동물을 식도 면으로 굴립니다(그림 1). 이 보기는 배낭 기관을 제거하는 데 가장 쉬운 접근을 제공합니다. 배낭 기관에 집중하십시오.
알림: 가장 유용한 배율은 동물의 크기와 사용자 선호도에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 12-20배 배율이 잘 작동합니다. - 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 유리 바늘 하나로 동물을 부드럽게 제자리에 고정합니다.
- 주로 사용하는 손을 사용하여 바늘 끝을 배골 기관 약간 아래에 삽입합니다. 비스듬히 들어가 외측 기관의 눈에 보이는 한쪽 가장자리에서 기저부 아래로 한 번 자릅니다. 바늘을 빼내고 두 번째 절단을 하여 외측 기관의 모든 구조를 포함하는 쐐기 모양의 조직 조각을 제거합니다( 그림 4, 상단 패널 참조). 수술이 성공적인지 확인하기 위해 동물과 절제된 조직을 주의 깊게 검사하십시오.
- 동일한 이송 피펫을 사용하여 갓 자른 동물을 멸균 바닷물이 들어 있는 신선한 접시로 옮깁니다.
참고: 상처는 빠르게 닫히므로 실험 목표(예: 여러 개의 동기식 재생 샘플 또는 치유 및 재생의 초기 단계 이미징)에 따라 여러 샘플을 생성하기 위해 빠르게 움직여야 합니다. 타이머를 사용하여 수술 시간을 제한하여 재생 중인 동물 집단을 더 가깝게 유지하십시오.
4. 절단이 올바른지 확인
참고: 해부 현미경으로 주의 깊게 확인하더라도 때때로 수술 오류를 놓칠 수 있습니다.
- 아래 장착 단계에 따라 각 수술 후 개인을 유리 슬라이드에 임시로 장착하여 DIC가 있는 복합 현미경으로 의도한 모든 구조가 올바르게 제거되었는지 확인합니다. 현재 추가 이미징을 수행하지 않더라도 이 검사를 수행합니다.
참고: ctenophores의 우수한 치유 능력은 접목 실험에 적합합니다. 우리는 제거된 AO의 절단면과 제거된 동물의 나머지 부분이 서로 달라붙어 융합될 가능성을 방지하기 위해 항상 절제된 배양 장기를 배양 용기에서 제거합니다.
장기 이미징을 직접 진행하지 않으면 슬라이드를 밀봉하지 마십시오. 이것은 빠른 회복을 촉진하고 이 실험 동물의 배양으로 돌아갈 것입니다. 고배율에서 수술 정확도를 확인하는 것이 좋습니다. 특히, 수술을 완료하지 않고도 돔에서 statolith를 녹아웃시킬 수 있습니다.
5. 라이브 이미징
- 장착
- 표준 유리 현미경 슬라이드를 유리 처리용 발수제와 같은 실리콘화제로 처리하고 완전히 건조시킵니다.
- 수술 후 동물 한 마리를 이송 피펫을 사용하여 준비된 슬라이드로 옮깁니다. 물이 안에 있는 동물과 함께 구슬이 맺히는지 확인합니다.
- 커버글라스의 각 모서리에 소량의 모델링 점토(~1.5mg)를 놓아 커버글라스를 동물에게서 들어 올리는 스페이서 역할을 할 "발"을 만듭니다.
- 클레이다운 덮개를 동물 위에 부드럽게 놓습니다. 커버 글라스의 각 모서리를 잡고 동물을 이미징을 위한 위치에 굴립니다. 아래로 눌러 동물을 약간 압축하고 제자리에 고정합니다. 만족스러운 보기에 도달하기 위해 필요한 만큼 샘플의 위치를 변경하십시오.
- ~30분 이상 이미징의 경우 표본의 건조를 방지하기 위해 커버글라스의 각 가장자리에 바셀린을 얇게 도포합니다.
참고: 이러한 방식으로 마운트된 M. leidyi 는 추가 배양 또는 기타 분석을 위해 쉽게 회수할 수 있습니다. 그러나 동물은 일반적으로 1-2시간 이내에 자신을 자유롭게 하고 위치를 변경하므로 2시간 이상의 연속 타임랩스 캡처에는 다른 이미징 접근 방식이 필요합니다.
6. 배양
- cydippid 배양 조건
- 배양은 실온 근처에서 여과된 천연 또는 인공 해수에서 동물과 대조군을 외과적으로 조작했습니다. 일관된 결과를 보장하기 위해 20-22°C로 설정된 인큐베이터를 사용하십시오.
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결과
Cydippid-stage M. leidyi 는 일반적으로 손상 후 ~20분 이내에 상처 봉합을 완료하는 반면(그림 4 및 그림 5), 장기의 완전한 재생에는 1-3일이 소요될 수 있습니다. 이 시기는 약간의 생물학적 가변성이 있지만 거의 항상 수술 후 72시간까지 완료됩니다(그림 6).
외측 장기 복합체와 인근 조직에서 세포와 메조글레아를 외과적으로 제거한 후 상처를 빠르게 봉합하면 수술 전후 이미지에서 알 수 있듯이 전체적으로 신체 직경이 작아집니다(그림 3).
0.5-3mm 크기 범위의 cydippid 단계 M. leidyi 를 사용하여 우리 연구실의 학부생은 이 프로토콜에 따라 재...
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토론
원하는 모든 크기의 M. leidyi에 대해 유사한 실험을 수행할 수 있습니다. 장기의 형태 형성은 재생 능력의 시작과 동시에 완료됩니다4. 동물은 야생에서 수집되거나 실험실에서 사육될 수 있다19 또는 실험실에서 사육될 수 있다20,21. 특정 신체 크기를 원하는 경우 동물을 산란시키고 자손을 원하는 크기로 키울 수 있습니다. 본체 크기는 프로토콜 단계 1.3에서 만든 측정 피펫을 사용하여 원하는 내경으로 절단하여 근사화할 수 있습니다(그림 3). 더 작은 피펫과 더 큰 피펫을 사용하면 다양한 크기의 동물 풀을 모을 수 있습니다. 더 큰 동물의 경우 취급이 더 쉬워지지만 고정 및 이미징이 더 어려워지고 신체 크...
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 Jovita Joseph에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m SFCA 주사기 필터 | 써모/날진 | 723-2520 | 멸균 해수 생성 |
| 35mm 폴리스티렌 페트리 접시 | 팔콘/코닝 | 351008 | 컷을 수행합니다. 작은 동물 문화 |
| 60 mL 일회용 루어락 주사기 | BH 용품 | BH60LL | 멸균 해수 생성 |
| 보정된 유리 피펫, 100 & L | 드러먼드 | 2-000-100 | 컷 수행 |
| 커버 안경, #1.5, 18mm 정사각형 | VWR | 16004-326 | 이미징용 마운트 |
| ctenophores | 걸프 표본 | 살아있는 동물 | |
| 이중 캐비티 유리 함몰 슬라이드, 1.3 mm | VWR | 470200-930 | 이미징용 마운트 |
| 유리 현미경 슬라이드 | VWR | 16004-398 | 이미징용 마운트 |
| 인스턴트 오션 바다 소금 | 인스턴트 오션 | 동물 배양 배지 | |
| 미니 눈금자 | 테드 펠라 | 13623 | 플라스틱 피펫 측정 |
| 모델링 점토(플라스틱) | 페피 플라스틸리나 | 이미징용 마운트 | |
| 바셀륨 젤리 | 바 셀 린 | 이미징용 마운트 | |
| 플라스틱 이송 피펫(다양한 크기) | 콜-파머 | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | 작은 동물 이동 |
| Rain-X 유리 처리 | 레인-X | 현미경 슬라이드 실라나이즈 | |
| 통치자 | 웨스트콧 | 10564 | 플라스틱 피펫 측정 |
| 가위 | 옥소 | 플라스틱 피펫 절단 |
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