마우스의 신원 인식을 검사하기 위한 행동 작업

요약

부정적이거나 긍정적으로 평가된 경험을 개인의 사회적 목표와 짝지음으로써, 우리는 C57BL/6 마우스의 신원 인식을 조사하기 위한 행동 과제를 개발했다. 이러한 작업을 통해 사회적 인지가 손상된 건강 및 질병 관련 마우스 모델에서 개별 사회적 대상의 사회적 기억 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

초록

설치류와 같은 사회적 동물은 친숙한 개인의 정체성을 인식하고 구별할 수 있습니다. 친숙한 개인의 정체성을 인식하는 것은 위계, 친족 관계, 가족과 같은 사회 구조를 발전시키는 데 중요합니다. 그러나 사회적 정체성 인식의 기저에 있는 메커니즘은 여전히 불분명하다. 사회적 인식에 대한 대부분의 설치류 연구는 설치류가 새로운 사회적 대상과 상호 작용하는 경향, 즉 사회적 새로움으로 알려진 현상에 기반합니다. 그러나 사회적 새로움을 검토하기 위한 행동적 과제는 그들의 정체성에 기초한 친숙한 동시적 존재에 대한 인식을 드러낼 수 없다. 여기에 제시된 행동 작업은 valenced experience가 있거나 없는 두 개의 친숙한 마우스를 연관시켜 C57BL/6 마우스의 ID 인식을 검사할 수 있도록 합니다. 피험자들은 두 마리의 쥐와 상호작용을 가졌는데, 그 쥐들은 없는 (중립적인) 또는 환상적인 경험(부정 또는 긍정적)을 가지고 있었고, 이 쥐들과 친숙해졌다. 음의 가치관을 가진 쥐는 쇼크와 관련이 있었고, 긍정적으로 평가된 쥐는 음식 보상과 관련이 있었습니다. 훈련 후, 이 친숙한 마우스의 정체성에 대한 인식은 사회적 차별 테스트에서 드러날 수 있으며, 이는 중립 마우스에 비해 긍정적으로 평가된 마우스에 대한 선호와 부정적인 평가된 마우스에 대한 회피로 표현됩니다. 정체성 인식을 위한 행동 과제는 자폐 스펙트럼 장애 또는 정신분열증과 같은 사회적 인지 장애가 있는 장애의 사회적 기억 메커니즘과 병태 생리학을 조사하는 데 유용할 수 있습니다.

서론

정체성 인식 또는 이전 경험을 바탕으로 친숙한 개체를 식별하는 능력은 사회적 동물의 생존에 매우 중요하다¹. 설치류의 경우, 사회적 위계, 짝과 자손 인식, 영역 방어, 집단의 형성 및 유지는 성공적인 정체성 인식에 필요한 행동이다 ^2,3. 사회적 기억에 대한 현재의 이해는 새로운 것과 익숙한 동시종을 식별하는 능력에 뿌리를 둔 설치류 연구를 기반으로 합니다. 이러한 작업은 해마 CA2⁴ 및 복부 CA1^영역5과 같이 사회적 기억을 매개하는 것으로 생각되는 뇌 영역을 밝히는 데 유용했습니다. 그러나 이러한 연구는 사회적 새로움에 대한 범주적 인식에 국한되어 있기 때문에 정체성 인식의 기저에 있는 메커니즘을 설명하는 데 한계가 있습니다.

정체성 인식은 가치있는 두드러진 경험이 두 개 (또는 그 이상의) 친숙한 사회적 목표 중 하나와 연관되는 연상 학습 패러다임을 통해 사회적 새로움과 독립적으로 입증되었습니다. 이러한 과제는 사회적 상호 작용이 종종 정서적 의미와 연결되어 있으며, 부정적인 경험은 갈등을 예방하는 행동으로 이어지는 반면, 장난스럽거나 양육적인 상호 작용은 일반적으로 보람이 있다는 개념에 기반합니다. 상호 작용에 수반되는 정서적 영향을 사회적 가치라고 합니다. 수컷 골든 햄스터는 한 마리가 이전에 공격했을 때 익숙한 두 개의 동종 표적을 구별할 수 있었다⁶. 개별 수컷 Wistar 쥐의 인식 기억은 사회적 계급⁷을 확립하는 데 중요했습니다.

최근에는 신경과학 연구에서 가장 널리 사용되는 마우스 균주인 C57BL/6 마우스에서 식욕 자극이 있거나 없는 개별 C57BL/6 마우스를 연관시켜 정체성 인식을 조사했습니다⁸. 이 접근 방식은 머리를 고정한 쥐를 사용하여 수백 번의 훈련 시험을 거쳤으며, 이는 자유롭게 움직이는 쥐의 자연주의적 행동을 검사하는 데 사용하는 데 제한을 두었습니다. 다른 연구에서, C57BL/6 마우스의 동일성 인식은 에탄올이 투여된 동종의 선호에 의해 뒷받침되었다 ^9,10. 그럼에도 불구하고 물질의 투여는 혼란을 유발할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 연구 중 일부는 남녀 설치류의 정체성 인식을 조사하는 데 사용되었습니다. 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 모두에 적용할 수 있는 쉽게 채택할 수 있는 방법은 신원 인식 연구를 발전시키는 데 중요한 도구입니다.

여기에 제시된 것은 수컷 마우스와 암컷 마우스 모두에 사용할 수 있는 신원 인식 패러다임입니다. 새로움의 영향으로부터 독립적인 정체성을 연구하기 위해 두 가지 친숙한 사회적 목표가 사용되며, 이 중 하나는 상호 작용 행동을 알리는 것으로 추정되는 두드러진 정서적 경험과 관련이 있습니다. 부정적 사회적 가치연상(negative social valence association)의 경우, 사회적 공포 조건화(social fear conditioning)와 유사한 접근법을 채택하여 특정 사회적 목표에 대한 회피를 이끌어냈다¹¹. 혐오스러운 발 충격과 같은 부정적인 사회적 가치관이 개인과 관련이 있는 경우, 사회적 대상과의 상호 작용 감소가 예상될 수 있습니다. 반대로, 식욕 보상과 같은 긍정적인 사회적 가치가가 특정 개인과 관련이 있는 경우, 후속 테스트에서 이 마우스와의 상호 작용 증가가 예상될 수 있습니다. 종합하면, 개략적인 행동 과제는 C57BL/6 마우스 및 기타 마우스 균주의 신원 인식 연구를 위한 대부분의 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에는 수컷 성인 C57BL/6 마우스(8-10주령, 체중: 18-25g)가 사용되었습니다. 사회적 표적으로 사용된 마우스는 다른 출처( 재료 표 참조)에서 얻은 것으로, 다른 깔짚에서 온 것인지 그리고 이전에 피험자 마우스에게 익숙하지 않았는지 확인했습니다. 모든 프로토콜은 더글러스 연구 센터(Douglas Research Centre)의 시설 동물 관리 위원회(Facility Animal Care Committee)의 승인을 받았으며 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council on Animal Care)의 지침을 따랐습니다(프로토콜 번호: DOUG-5935).

1. 재료(그림 1 참조)

1. 커다란 투명 케이지(24cm x 36cm x 19.5cm)를 부정적 사회적 원자가 실험에서 중립적인 맥락으로 설정합니다.
2. 검은색 벽의 삼각형 충격 상자(각 측면의 길이 = 46cm, 높이 = 29cm)를 음의 원자가 컨텍스트로 사용합니다. 쇼크 박스의 바닥이 스크램블 그리드 전류 발생기에 연결된 금속 그리드로 구성되어 있는지 확인하십시오.
3. 긍정적 인 사회적 원자가 실험에서 큰 투명 케이지 (26cm x 47cm x 21cm)를 음식 습관화 맥락으로 사용하십시오.
4. 검은 벽으로 둘러싸인 큰 케이지(24cm x 36cm x 19.5cm)를 긍정적 사회적 원자가 실험에서 중립적 맥락으로 사용합니다.
5. 음식 항구가 있는 큰 흰색 벽 케이지(24cm x 36cm x 19.5cm)를 긍정적인 사회적 원자가 맥락으로 사용합니다. 푸드 포트로 벽의 한쪽을 통과하는 플라스틱 튜브(직경 0.5cm)를 사용하고 튜브 아래에 흰색 플라스틱 접시를 놓습니다.
6. 흰색 이젤 패드 종이를 미리 잘라 중립적 맥락(부정적 및 긍정적 사회적 원자가 실험 모두에서 중립 교육) 및 긍정적인 사회적 원자가 맥락의 바닥으로 사용합니다. 패드를 컨텍스트의 바닥 표면보다 약간 작게 잘라 대상 마우스가 종이 아래로 파고드는 것을 방지합니다. 대상 마우스 사이에 이젤 패드를 교체합니다.
7. 먼지가 없는 정밀 펠릿(20mg, 초콜릿 맛)을 긍정적으로 평가된 사회적 대상과의 상호 작용에 대한 보상 신호로 사용하십시오.
8. 긍정적 사회적 원자가 실험 기간 동안 매일 피험자 마우스의 무게를 측정하기 위해 저울을 사용합니다.
9. 사회적 차별 테스트를 위해 중간 챔버에 왼쪽과 오른쪽 챔버로 연결되는 구멍이 있는 3개의 챔버 상자(81cm x 23cm x 23cm)를 사용합니다. 탈착식 챔버 도어를 사용하여 세션 사이에 피험자 마우스를 중간 챔버에 격리하여 취급 스트레스를 방지하십시오.
10. 두 개의 동일한 직사각형 플렉시글라스 인클로저(10cm x 5cm x 30cm)를 사용하여 부정적인 사회적 원자가 훈련을 모두 제공합니다.
11. 사회적 차별 테스트를 위해 4개의 원형 와이어 컵(8cm x 8cm x 10cm)을 사용하십시오. 사회적 차별 테스트의 세션 1 동안 두 개의 와이어 컵을 비워 두십시오. 세션 2에서는 긍정적 또는 부정적 사회적 원자가 훈련에 사용되는 사회적 목표를 다른 두 개의 와이어 컵에 배치합니다.
    알림: 와이어 컵에 레이블을 지정하고(예: 테이프 사용) 동일한 와이어 컵을 구별합니다. 실험 내에서 실험 기간 동안 동일한 목적으로 와이어 컵을 사용합니다. 와이어 컵 내부에 다른 사회적 대상을 배치해야 하는 경우 비누, 물, 과산화수소 기반 속효성 소독제로 와이어 컵을 철저히 청소하십시오.
12. 사회적 차별 실험 중 뒤집힌 철사 컵 위에 유리병 두 개를 올려 놓아 피험자 쥐가 철사 컵 위로 올라가는 것을 방지한다.
13. 훈련용 인클로저에 부정적인 사회적 원자가 실험을 위한 비전도성 물질의 바닥이 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 전기 테이프로 덮인 플라스틱이나 판지를 사용하여 부정적으로 평가된 사회적 대상이 훈련 중에 충격을 받지 않도록 합니다.
14. 무음 타이머를 사용하여 동물의 행동에 개입할 수 있는 외부 신호를 피하십시오.
15. 노트북 컴퓨터에 연결된 고해상도(1,080p/30fps) 웹캠을 사용하여 교육 및 사회 차별 테스트 중 마우스 동작을 캡처합니다.
16. 컨텍스트의 중심에서 측정된 60dB의 정적 백색 잡음을 생성하는 백색 잡음 생성기를 사용합니다.
    알림: 모든 행동 절차는 동물의 행동에 영향을 줄 수 있는 환경 소리를 마스킹하기 위해 맥락 중앙에서 측정된 60dB의 정적 백색 소음으로 수행해야 합니다.
17. 모든 행동 절차에 빨간불 램프를 사용하십시오.
    참고: 이것은 생쥐의 탐험을 장려하고 비디오 녹화에서 동물 행동을 시각화할 수 있는 어두운 환경 조건을 제공합니다.
18. 속건성이 빠른 70% 에탄올이 함유된 피험자 마우스 사이에 비어 있거나 동물이 포함된 인클로저를 청소합니다. 이전 피험자 마우스의 후각 신호로 인한 행동에 대한 잠재적 영향을 제거하기 위해 과산화수소 기반 속효성 소독제로 피험자 마우스 간의 교육 및 테스트 컨텍스트를 청소합니다.

2. 행위 절차

1. 부정적 사회적 원자가
   1. 상황 습관화
      1. 실험이 진행되는 동안 실험실에 백색 소음과 주변 적색광을 비춥니다.
      2. 중앙에 비전도성 바닥이 있는 빈 플렉시글라스 인클로저를 배치하여 쇼크 박스를 준비합니다.
      3. 대상 마우스를 쇼크 박스의 구석에 놓고 5분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      4. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
      5. 나머지 마우스로 쇼크 박스 습관화를 반복합니다.
      6. 최소 1시간 후, 중립 상황에서 문맥 습관화 절차(단계 2.1.1.1-2.1.1.5)를 반복합니다.
   2. 음의 원자가 훈련
      1. 두 상황에 대한 습관화 후 최소 1시간 후에 음성 원자가 훈련을 시작하십시오.
      2. 전류를 0.3mA로 설정하여 쇼크 박스를 준비합니다.
         참고: 권장 전류 설정은 사용한 쇼크 박스와 실험 설계(3 교육일)를 기반으로 합니다. 이 설정은 다른 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다(예: 더 적은 수의 교육 시도 설계에서 더 강한 전류를 사용할 수 있음).
      3. 음의 가치로 평가된 사회적 표적을 쇼크 박스 중앙에 비전도성 바닥이 있는 플렉시글라스 인클로저에 놓습니다.
      4. 비디오 녹화를 시작하고 피사체 마우스를 쇼크 박스의 모서리에 놓습니다.
      5. 타이머를 시작하고 대상 마우스가 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      6. 4분 및 4.5분에서 1초 동안 전기 충격을 가합니다.
         참고: 이를 통해 피험자 마우스와 사회적 대상이 혐오적 충격을 경험하기 전에 충분한 상호작용 시간을 가질 수 있다.
      7. 5분에 대상 마우스를 제거하고 녹음과 타이머를 중지합니다.
      8. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
      9. 쇼크 박스를 소독하고 나머지 피험자 마우스에 대해 음성 원자가 훈련을 반복합니다.
   3. 중립 교육
      1. 음성 원자가 훈련 후 최소 2시간 후에 중립 훈련을 시작하십시오.
      2. 중립적인 사회적 대상을 비전도성 바닥이 컨텍스트의 중앙에 있는 인클로저에 배치합니다.
         참고: 비전도성 바닥은 negative 및 neutral 컨텍스트가 동일한 컨텍스트 신호를 갖도록 하는 데 사용됩니다. 중립 훈련에서는 충격이 전달되지 않습니다.
      3. 비디오 녹화를 시작하고 피사체 마우스를 중립 컨텍스트의 모서리에 놓습니다.
      4. 타이머를 시작하고 대상 마우스가 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      5. 5분에 대상 마우스를 제거하고 녹음과 타이머를 중지합니다.
      6. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
   4. 교육 순서
      1. 1일차: 두 상황의 습관화 후(2.1.1단계), 음성 원자가 훈련(2.1.2단계) 2시간 후에 중립 훈련(2.1.3단계)을 수행합니다.
      2. 2일차: 2일차에 훈련 순서를 반대로 하여 훈련을 반복합니다(2.1.3단계, 2.1.2단계, 즉, 중립 훈련을 수행한 다음 2시간 후에 음의 원자가 훈련을 수행합니다).
      3. 3일차: 3일차에 훈련 순서를 반대로 하여 훈련을 반복합니다(2.1.2단계, 2.1.3단계, 즉, 음의 원자가 훈련 후 2시간 후 중립 훈련).
2. 긍정적 인 사회적 가치
   1. 식량 부족
      1. 실험 기간 동안 각 피험자 마우스의 무게를 매일 측정합니다.
         참고: 어느 시점에서든 피험자 쥐가 원래 체중의 15% 이상을 잃게 되면, 음식 부족을 중단하고 추가 실험에서 쥐를 버려야 한다.
      2. 홈 케이지에 피험자 쥐당 일반 쥐 사료 1g을 제공합니다.
         참고: 피험자 마우스는 마우스당 1g의 음식을 사용할 수 있는 그룹 수용됩니다. 예를 들어, 4 마리의 쥐가 집단 수용 된 경우 4g의 음식이 가정용 케이지에 배치됩니다.
      3. 긍정적 사회적 가치론 실험 기간 동안 매일 음식 박탈을 반복합니다(즉, 매일 음식 펠릿 습관화, 맥락 습관화 및 긍정적 가치가 훈련 후).
   2. 자당 식품 펠릿 습관화
      1. 식량 부족이 시작된 후 12시간 후에 식품 펠릿 습관화를 시작하십시오.
      2. 실험이 진행되는 동안 실험실에 백색 소음과 주변 적색광을 비춥니다.
      3. 대상 마우스를 음식 습관화 컨텍스트의 한 구석에 배치합니다.
      4. 타이머를 시작하고 10분 동안 분당 1개의 자당 식품 펠릿을 제공합니다.
      5. 10분에 피험자를 제거하고 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
      6. 피험자 마우스가 섭취한 자당 식품 알갱이의 수를 기록합니다.
      7. 총 3일 동안 자당 식품 펠릿 습관화를 반복합니다.
         참고: 생쥐가 3일 후에 자당 식품 알갱이를 섭취하지 않으면 더 많은 습관 일수를 추가할 수 있습니다.
      8. 식품 펠릿 습관화 중 자당 식품 펠릿을 섭취하지 않는 피험자를 연구에서 제거합니다.
   3. 상황 습관화
      1. 자당 식품 펠릿 습관화 하루 후(4일차), 컨텍스트의 한 모서리에 빈 플렉시글라스 인클로저를 배치하여 양의 원자가 컨텍스트를 준비합니다.
      2. 대상 마우스를 양의 원자가 컨텍스트의 모서리에 놓고 마우스가 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      3. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
      4. 나머지 마우스에 대해 긍정적 인 원자가 컨텍스트 습관화를 반복합니다.
      5. 최소 1시간 후에 중립 상황에서 문맥 습관화 절차를 반복합니다.
   4. 긍정적 인 원자가 훈련
      1. 두 상황에 대한 습관화 후 최소 1시간 후에 긍정적 원자가 훈련을 시작하십시오.
      2. 긍정적으로 평가된 사회적 대상을 긍정적 원자가 맥락의 중심에 있는 인클로저에 배치합니다.
      3. 비디오 녹화를 시작하고 대상 마우스를 양의 원자가 컨텍스트의 모서리에 놓습니다.
      4. 타이머를 시작하고 대상 마우스가 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      5. >2초인 사회적 대상과의 각 상호 작용 시합에서 식품 포트를 통해 1개의 자당 식품 펠릿을 전달합니다. 상호 작용은 피험자 마우스의 코가 플렉시글라스 인클로저의 주변에서 <2cm 떨어져 있는 기간으로 정의됩니다. 피험자의 머리 각도는 인클로저를 향해야 합니다.
         알림: 코를 찌르거나 냄새를 맡을 수 있지만 자당 식품 펠릿 전달에는 필요하지 않습니다.
      6. 10분에 대상 마우스를 제거하고 녹음과 타이머를 중지합니다.
      7. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
      8. 식품 포트를 통해 전달된 자당 식품 펠릿의 수와 대상 마우스가 소비한 펠릿의 수를 기록합니다.
      9. 이젤 패드 바닥을 교체하고, 양성 컨텍스트를 소독하고, 나머지 피험자 마우스로 긍정적 원자가 훈련을 반복합니다.
   5. 중립 교육
      1. 포지티브 원자가 훈련 후 최소 2시간 후에 중립 훈련을 시작하십시오.
      2. 중립적인 맥락의 한 구석에 있는 인클로저에 중립적인 사회적 대상을 배치합니다.
      3. 비디오 녹화를 시작하고 피사체 마우스를 중립 컨텍스트의 모서리에 놓습니다.
      4. 타이머를 시작하고 대상 마우스가 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      5. 10분에 대상 마우스를 제거하고 녹음과 타이머를 중지합니다.
      6. 피험자 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
      7. 이젤 패드 바닥을 교체하고, 장비를 소독하고, 남은 피험자 마우스와 함께 중립 훈련을 반복한다.
   6. 교육 순서
      1. 1-3일차: 식품 펠릿 습관화를 수행합니다(2.2.2단계).
      2. 4일차: 두 상황의 습관화 후(2.2.3단계), 먼저 긍정적 원자가 훈련(2.2.4단계)을 수행한 다음 2시간 후에 중립 훈련(2.2.5단계)을 수행합니다.
      3. 5일차: 5일차에 훈련 순서를 반대로 하여 훈련을 반복합니다(2.2.5단계, 2.2.4단계, 즉, 중립 훈련 후 2시간 후 포지티브 원자가 훈련).
3. 사회적 차별 테스트
   1. 실험실을 백색 소음과 주변 적색광으로 무장하세요.
   2. 피험자를 실험실로 이송하고 최소 1시간 동안 방해받지 않고 실험실에 익숙해질 수 있도록 합니다.
      참고: 습관화 기간 동안 사회적 목표가 실험실 밖에 남아 있는지 확인하십시오.
   3. 세션 1에서는 3개의 방으로 구성된 사회적 차별 상자의 왼쪽과 오른쪽 방의 반대쪽 모서리에 두 개의 빈 철사 컵을 놓습니다.
      알림: 동일한 큰 무게의 물체(예: 유리병)를 와이어 컵 위에 올려 대상 마우스가 와이어 컵 위로 올라가지 않도록 합니다.
   4. 비디오 녹화를 시작하고 대상 마우스를 중간 챔버 중앙에 놓고 타이머를 시작합니다.
      참고: 가능하면 피험자 마우스에 대한 실험자의 간섭을 최소화하기 위해 방을 나가십시오.
   5. 8분 후, 실험실로 돌아와 피험자 마우스를 건드리지 말고 챔버 도어를 사용하여 피험자를 중앙 챔버에 가둡니다.
   6. 빈 와이어 컵을 사회적 대상을 포함하는 동일하지만 다른 컵 세트로 교체하십시오.
      참고: 사회적 목표는 부정적이거나 긍정적인 사회적 가치가 훈련에 사용되는 목표입니다.
   7. 챔버 문을 제거하고 세션 2에서 피험자 마우스가 탐색하는 동안 타이머를 시작하십시오.
   8. 8분 후, 녹음을 중지하고 대상 마우스와 소셜 대상을 각각의 홈 케이지로 되돌려 놓는다.
   9. 70% 에탄올로 컵을 청소하고 소독제로 경기장을 청소하십시오.
   10. 나머지 피험자 마우스에 대해 사회적 차별 테스트(단계 2.3.3-2.3.9)를 반복합니다.
   11. 코호트의 절반이 테스트를 완료하면 와이어 컵 위치의 균형을 맞춥니다.
       참고: 사회적 대상은 후각 신호가 충돌하는 것을 방지하기 위해 각각의 와이어 컵으로 이동해야 합니다.
   12. 모든 와이어 컵을 비누, 물, 소독제로 세척합니다. 3개의 챔버로 구성된 사회적 차별 상자를 소독제로 청소하십시오.

3. 행동 분석

1. 훈련
   1. 각 소셜 대상과의 상호 작용 시간을 분석하고 상호 작용 시합 횟수를 점수화합니다.
      참고: 분석은 수동으로(동물 머리<인클로저 주변에서 2cm 거리, 머리 각도 180°) 또는 자동화된 프로그램을 사용하여 점수를 매길 수 있습니다.
   2. 긍정적 인 사회적 가치 훈련 중에 소비 된 식품 펠릿의 수를 기록하여 사회적 행동의 변화가 식품 보상 소비 동기의 차이로 인한 것이 아닌지 확인하십시오.
2. 사회적 차별 테스트
   1. 피험자 쥐가 각 컵을 조사하는 시간을 측정합니다. 실험자가 방을 나간 후 8분 동안 중단 없이 실험이 시작됩니다.
      참고: 분석은 수동으로(와이어 컵 주변에서 동물 머리 <2cm 거리, 머리 각도 180°) 또는 자동화된 프로그램을 사용하여 점수를 매길 수 있습니다.
   2. 쌍별 분석을 계산하여 테스트 세션 내의 개별 변경 사항을 더 잘 포착할 수 있습니다. 또한 양방향 반복 측정 ANOVA(세션 및 컵의 요인 포함)를 수행하여 탐색에서 세션 간 차이를 감지합니다.

결과

우리는 C57BL/6 마우스의 신원 인식을 평가하기 위해 긍정적 및 부정적 사회적 가치 과제를 사용했습니다(그림 2). 자당 식품 펠릿 습관화 1일차(H1, 그림 2B)와 비교하여 대부분의 마우스는 식품 습관화의 마지막 날(H3)까지 주어진 펠릿을 모두 섭취했습니다. 훈련 세션(T1 및 T2) 동안 피험자 마우스는 서로 다른 상황에서 개별적으로 상호 작용하여 두 개의 CD1 마우스, 즉 중성(Neu) 및 양성 원자가 관련 마우스(PV)와 친숙해졌습니다. 먹이 보상은 마우스 PV와의 상호 작용 후에만 대상 마우스에게 주어졌습니다. 사회적 차별 과제 중에 훈련된 마우스가 중립 마우스와 비교할 때 PV 마우스와 상호 작용하는 것을 선호한다는 것을 발견했습니다(* p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-검정). 세션 2 상호작용 시간 대 세션 1 상호작용 시간의 세션 간 비율도 PV 마우스에 대한 선호도를 나타냈습니다(* p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-검정).

또한 신원 인식을 조사하기 위해 부정적 사회적 가치가(negative social valence) 과제를 사용했다(그림 2C). 피험자 마우스는 서로 다른 맥락에서 별도로 상호 작용함으로써 두 개의 CD1 마우스인 Neu 및 NV(negative valence-associated mouse)와 친숙해졌습니다. 마우스 NV와의 상호 작용 세션이 끝날 무렵에 두 번의 전기 충격이 주어졌으며 Neu 마우스와의 상호 작용 후에는 충격이 가해지지 않았습니다. 각 훈련일에 피험자 마우스와 Neu 또는 NV 마우스 간의 상호 작용 시간에서 차이를 발견하지 못했습니다. 그러나 피험자 마우스가 사회적 차별 테스트(* p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-테스트) 동안 NV 마우스와의 상호 작용 시간이 감소했음을 발견했습니다. 세션 2 상호작용 시간 대 세션 1 상호작용 시간의 세션 간 비율은 Neu 마우스에 대한 선호도를 보여주었습니다(* p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-test).

그림 1: 신원 인식 작업을 위한 장치. (A) 부정적인 사회적 원자가 테스트에 대한 중립 원자가 맥락. 흰색 이젤 패드 종이가 컨텍스트의 맨 아래에 배치됩니다. (B) 긍정적 인 사회적 원자가 맥락. 상자 중간 하단에 있는 음식 포트(화살표)를 주목하십시오. (C) 긍정적 인 사회적 원자가 테스트를위한 중립 원자가 맥락. (D) 음식 습관화 맥락. 음식 배달 포트는 E (점선 원) 및 F (확대)와 같이 상자의 오른쪽에 설치됩니다. (G) 쇼크 박스. (H) 플렉시글라스 인클로저. (I) 와이어 컵. (J) 사회적 차별 테스트를 위한 3개의 챔버 사회적 차별 상자. 피험자 마우스를 중앙 챔버에 격리하기 위한 탈착식 챔버 도어는 K (화살촉)로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 신원 인식 작업의 설계 및 예상 결과. (A) 정체성 인식 과제의 긍정적 (위) 및 부정적 사회적 원자가 버전의 개략도 (아래). C57BL/6 마우스는 중립(마우스 Neu) 및 원자가 관련 사회적 목표(마우스 PV 또는 NV)와 매일 상호 작용하도록 훈련되었습니다. 훈련 다음 날, 피험자 쥐들은 사회적 차별 테스트를 위해 3개의 챔버로 구성된 기구에 넣었다. 긍정적 및 부정적 사회적 원자가 훈련 후, 피험자 마우스는 각각 긍정적 가치(녹색, 마우스 PV) 및 음성적 가치(빨간색, 마우스 NV)에 대한 선호와 회피를 나타낼 것으로 예상합니다. (B) 긍정적 사회적 가치가 훈련 실험의 대표 데이터. 피험자 마우스는 2일 동안 매일 양성 valenced 마우스(마우스 PV) 및 중립 마우스(마우스 Neu)와 상호 작용하도록 훈련되었습니다. 상호 작용의 순서는 2일차에 반전되었습니다. 왼쪽: 히스토그램은 마우스 PV를 사용한 습관화(습관화 1-3일을 나타내는 H1-3) 및 훈련(훈련 1-2일을 나타내는 T1-2) 동안 소비된 자당 식품 펠릿의 비율을 보여줍니다. 오른쪽: 히스토그램은 사회적 차별 테스트 동안 긍정적으로 평가된 마우스 PV와의 사회적 상호 작용 시간의 증가를 보여줍니다. Intersession 비율(세션 2 상호 작용 시간/세션 1 상호 작용 시간)은 긍정적으로 평가된 마우스 PV에 대한 선호도를 나타냈습니다. * p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-test. (C) 부정적 사회적 가치가 훈련 실험의 대표 데이터. 피험자 마우스는 3일 동안 매일 음성 valenced 마우스(마우스 NV) 및 중성 마우스(마우스 Neu)와 상호 작용하도록 훈련되었습니다. 상호 작용의 순서는 매일 바뀌었습니다. 왼쪽: 히스토그램은 서로 다른 훈련일 동안 마우스 Neu 및 NV와의 상호 작용 시간을 보여줍니다. 오른쪽: 히스토그램은 사회적 차별 테스트에서 음의 평가를 받은 마우스 NV와의 사회적 상호작용 시간이 감소했음을 보여줍니다. Intersession ratio는 음의 valenced mouse NV의 회피를 보여주었습니다. * p < 0.05, 쌍을 이룬 학생의 t-test. 약어: Neu = 중립; PV = 양의 원자가; NV = 음의 원자가; H = 습관화; T = 교육. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

신원 인식 패러다임은 최소한의 특수 장비와 일주일 이내에 몇 번의 교육 세션으로 실험실에서 쉽게 구현할 수 있도록 설계되었습니다. 사용 가능한 자원과 원하는 연구 질문에 따라 대안적인 평가 경험이 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 공격적인 사회적 대상의 공격에 따른 부정적으로 평가된 정체성 인식은 황금 햄스터에서 처음 설명되었으며 모델 ^6,12의 쥐에 적용되었습니다.

valenced identity recognition 패러다임은 사회적 기억 분야에서 더 광범위하게 적용될 수 있습니다. 이러한 작업은 사회적 기억 또는 사회적 가치 메커니즘을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 사회적 인식 장애가 있는 것으로 알려진 질병 모델을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 정체성 인식의 장애는 정신분열증 13,14,15 및 자폐 스펙트럼 장애 16,17,18과 같은 장애에서 사회적 행동 결핍의 기저에 깔려 있으며, 자폐증을 앓고 있는 성인의 1/3이 개인 정체성 인식에 직면하는 데 어려움을 겪는 것으로 추정된다 ¹⁹. 예를 들어, Shank3 녹아웃 마우스와 Df(16)A^+/-는 자폐 스펙트럼 장애 및 정신분열증 마우스 모델로, 손상된 사회적 인지를 나타내는 것으로 알려져 있습니다 20,21,22. 우리의 새로운 패러다임은 사회적 기억 결핍을 요약하고 질병 모델의 특성화와 사회적 행동 결핍을 개선하는 조작 또는 치료법의 식별에 채택될 수 있습니다. 무생물은 또한 사회적 인식과 비교하여 대상을 지지하는 메커니즘을 더 분석하기 위해 사회적 대상을 대체하는 연구를 할 수 있다¹².

그림 1에 사용된 사회적 표적은 동성 CD1 균주 마우스이지만, 당사는 동일 균주 C57BL/6 표적을 사용하여 유사한 valenced identity recognition을 달성했습니다. 따라서 우리는 뇌 질환의 동물 모델에서 사회적 가치 처리, 사회적 정체성 및 이러한 사회적 인지 기능의 결핍에 대한 추가 연구에 사용할 수 있는 쉽게 채택할 수 있는 방법을 개발했습니다.

신원 인식 패러다임은 특정 개인의 기억을 살펴본다. 실험을 설계할 때, 훈련 세션과 테스트 세션이 완전히 달라지고, 유일하게 일정하게 유지되는 단서가 사회적 대상의 정체가 되도록 주의해야 한다. 예를 들어, 교육 및 테스트가 수행되는 방, 사회적 목표를 포함하는 인클로저, 교육 및 테스트 컨텍스트와 관련된 단서가 모두 달라야 합니다.

4개의 와이어 컵은 서로 동일해야 하지만 플렉시 유리 인클로저와 가능한 한 달라야 합니다. 와이어 컵과 인클로저는 재료(예: 플렉시 유리 대 금속), 모양(예: 직사각형 대 원형) 및 색상(예: 투명 대 로즈 골드) 측면에서 달라야 합니다. 이는 테스트 중 탐색 행동을 알리는 유일한 단서가 사회적 대상의 신원인지 확인하기 위해 수행됩니다.

상황 습관화는 교육 1일차에 수행됩니다. 이것은 훈련 중에 맥락보다는 사회적 목표에 대한 탐색을 장려하기 위해 수행되며, 이는 이미 대상 마우스에게 알려져 있습니다. 또한, 평가 훈련 세션과 중립 훈련 세션 사이에 최소 2시간의 대기 시간이 권장됩니다. 피험자에게 훈련 세션 사이에 시간을 제공하는 것은 더 가까운 시간에 할당된 경험이 연결될 가능성이 더 높기 때문에 일반화를 줄이는 것으로 생각됩니다²³. 이와 같은 이유로 훈련은 반복되지만 다음 날에도 순서대로 균형을 이룹니다. 반복은 그 경험을 각각의 사회적 목표와 더 많이 연관시키도록 장려하는 것으로 생각된다. 이상적으로는, 훈련 세션 사이에 더 많은 시간이 주어지면 피험자 마우스가 사회적 목표를 그들 각자의 가치있는 경험과 연관시키는 방법을 더 배울 수 있습니다. 실용적인 목적을 위해 대기 시간은 8-12 마리의 마우스 코호트에서 1 일 안에 중립 및 평가 교육 세션을 모두 수행 할 수 있도록 2 시간으로 결정되었습니다. 예를 들어, 12마리의 마우스를 훈련시키는 데는 약 2시간이 소요될 수 있으며, 이 시점에서 먼저 훈련된 피험자 마우스는 다음 훈련 세션을 시작할 준비가 됩니다. 물론, 대기 시간을 늘리면 피험자 마우스의 성능이 향상될 수 있지만 실험자에게는 더 많은 시간이 소요됩니다.

피험자 생쥐와 사회적 대상은 수송 스트레스의 영향을 최소화하기 위해 행동 훈련을 시작하기 최소 7일 전에 동물 시설에 도착해야 합니다. 사회적 대상은 새장에서 나오는 후각 신호가 정체성 인식을 손상시킬 수 있으므로 단독집이어야 합니다. 동일한 두 개의 사회적 표적을 최대 12명의 피험자 마우스로 구성된 코호트에 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 사회적 표적은 피험자 생쥐 사이의 각 청소 및 설정 기간 동안 자택 우리로 되돌려 보내야 한다는 것입니다. 사회적 표적을 우리로 되돌려 보내는 것이 중요한데, 우리 안에 장기간 감금되어 있으면 그들의 행동이 바뀔 수 있고, 그 결과 피험자 쥐가 상호작용하는 결정에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.

피험자 마우스와 사회적 표적은 동일하거나 다른 균주의 특이적일 수 있습니다. 동일 균주의 사회적 표적을 사용하는 경우, 대상 생쥐와 같은 새끼가 아닌 것이 중요하며 사회적 표적은 서로 익숙하지 않아야 합니다. 이는 다른 동물 공급자로부터 피험자 마우스와 사회적 대상을 주문하거나 약간 다른 연령의 동물(즉, 8주 된 피험자 마우스와 7주 된 사회적 목표)을 주문함으로써 보장될 수 있습니다. 귀에 태그를 달아야 하는 경우, 행동 교육을 시작하기 최소 24시간 전에 실시해야 합니다. 이는 피험자 쥐의 행동에 대한 외부 스트레스 요인의 영향을 최소화하기 위함이다. 모든 행동 훈련 및 테스트의 경우 한 번에 하나의 피험자 마우스로 작업하는 것이 좋습니다. 여러 피험자 마우스에 대한 동시 훈련 및 테스트는 시간을 절약할 수 있지만 실험실에서 식별 인식의 인코딩 또는 회상에 영향을 줄 수 있는 후각 신호도 증가합니다. 따라서 8-12명의 피험자 마우스 코호트를 권장합니다. 긍정적 인 사회적 가치 실험의 경우, 새로운 음식 섭취를 억제 할 수있는 취급 스트레스를 최소화하기 위해 훈련 전에 매일 동물을 다루는 것이 좋습니다. 또한 습관화 과정을 용이하게 하기 위해 습관화 전 3일 동안 마우스 당 2-3개의 자당 식품 펠릿을 가정용 케이지에 배치하는 것이 좋습니다.

제시된 데이터는 수동으로 점수를 매겼지만 행동 분석을 위한 사용자 친화적이고 자동화된 옵션이 존재하며 교육 및 테스트 비디오에서 사회적 상호 작용의 보다 효율적인 채점을 위해 적용될 수 있습니다. 예를 들어, DeepLabCut은 동물 위치의 마커 없는 주석을 위해 사용자 훈련된 신경망을 사용하는 소프트웨어이며 조사 행동²⁴을 충족하는 프레임의 정확한 식별을 위해 최적화될 수 있습니다.

성공적인 신원 인식 프로토콜이 달성되었는지 확인하기 위해 추가 제어 실험을 사용할 수 있습니다¹². 훈련 순서를 반대로 하면 계속해서 신원 인식을 유도하고 결과가 정당하고 중립적인 훈련 순서에 의한 것이 아님을 확인해야 합니다. 훈련은 또한 설명된 대로 수행될 수 있지만, 테스트는 중립적이고 새로운 사회적 목표로 이루어질 수 있으며, 새로운 목표와의 상호 작용이 증가하면 피험자 마우스가 중립 대상에 대한 사회적 기억을 가지고 있고 그것이 친숙하다는 것을 인식했음을 시사합니다. 마찬가지로, 두 마리의 새로운 피험자 마우스로 테스트를 수행하여 회피 또는 접근 행동이 실제로 각각 부정적으로 평가된 사회적 목표와 긍정적으로 평가된 사회적 목표에 특이적임을 확인할 수 있습니다. 동일한 피험자 마우스가 음성 및 긍정적 사회적 가치 훈련을 모두 받을 수 있는지 여부는 현재 테스트되지 않았지만, 실험자가 여러 사회적 목표 균주 또는 훈련 상황에 접근할 수 있다면 가능하다고 생각합니다. 긍정적 및 부정적 원자가 실험에 동일한 사회적 표적 균주를 사용하면 균주와 특정 원자가의 연관성이 복잡해질 수 있습니다. 가능하다면, 다른 사회적 목표 균주를 사용하면 탐색을 장려하고 긍정적 경험과 부정적 경험 사이의 일반화를 피할 수 있다. 마찬가지로, 동일한 훈련 컨텍스트를 재사용하면 반대 가치로 평가되는 경험 간의 일반화가 증가하고 훈련을 위해 고유한 컨텍스트를 사용함으로써 최소화됩니다. 실험 일정이 허용하는 경우 양의 원자가 실험과 음성 원자가 실험을 몇 주 정도 분리하는 것도 권장됩니다.

신원 인식 프로토콜 수립에 어려움이 있는 경우, 일반적으로 직면하는 문제에 대한 솔루션을 제안합니다. 집단 주거 대상 마우스는 사회적 대상과 관련된 원자가가 정상적인 케이지메이트 상호 작용 후 소멸됨에 따라 멸종 훈련으로 기능할 수 있지만²⁵ 사회적 고립이 사회적 기억을 손상시키고 사회적 행동을 변화시키기 때문에 필요합니다^26,27. 실제로, 우리는 단일 주택이 수컷 쥐에서 정체성 인식을 이끌어내지 못한다는 것을 발견했습니다. 그러나 동물이 정위 수술에서 회복 중이거나 박리에 민감할 수 있는 두개내 임플란트가 있는 경우 단일 하우징이 필요할 수 있습니다. 이러한 경우, 우리는 구멍이 뚫린 칸막이로 분리된 큰 우리에 쥐를 성공적으로 쌍으로 수용했으며, 이 조건¹²에서 신원 인식을 복제했습니다.

긍정적 인 사회적 가치 과제의 경우, 생쥐가 새로운 자당 알갱이를 섭취하는 것을 주저하는 것이 일반적입니다. 이 문제를 해결하려면 먹이 부족 시간을 늘리거나 습관화 세션 2-3일 전에 몇 개의 펠릿을 집 케이지에 넣어 쥐가 펠릿에 익숙해지도록 하는 것이 도움이 됩니다. 대부분의 생쥐가 음식 알갱이를 섭취하지 않는 일부 상황에서는 습관화 세션 수를 늘리는 것도 도움이 될 수 있습니다. 우리는 수컷 마우스가 일반적으로 암컷 마우스보다 음식 펠릿 습관화 중에 덜 먹는다는 것을 알아차렸지만, 긍정적으로 평가된 사회적 대상을 인식하는 능력에는 영향을 미치지 않았습니다.

마지막으로, 신원 인식 작업의 파라미터를 수정하여 작업의 난이도를 줄이거나 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 생물학적 요인이 신원 인식에 미치는 미묘한 영향을 밝히기 위해 교육 시간과 교육 세션 수를 줄여 작업의 난이도를 높일 수 있습니다.

이 프로토콜에서 제시한 행동 작업은 간단하고 쉽게 설정할 수 있으며 신원 인식을 연구하기 위해 수컷 및 암컷 마우스에 적용할 수 있습니다. 이러한 과제에서 식욕적 또는 혐오적 자극을 유연하게 사용하는 것은 또한 정체성 인식에서 사회적 가치의 역할을 조사할 수 있게 한다. 이러한 작업은 건강한 마우스에서 정체성 인식의 생물학적 메커니즘 또는 사회적 장애를 나타내는 질병 관련 마우스 모델에서 이러한 메커니즘의 결함을 연구하는 데 유용할 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% 에탄올
검은색 벽 케이지 (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)		중립적 맥락, 긍정적 인 사회적 원자가 실험
C57BL / 6 마우스	찰스 리버, 잭슨 연구소	잭슨 연구소
먼지 없는 정밀 펠릿	BioServ	F05301	20 mg, 초콜릿 맛
전기 테이프
유리병 (2)
과산화수소 기반 소독제
플라스틱 또는 판지			인클로저 바닥용 비전도성 재료
직사각형 플렉시글라스 인클로저 (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)		동일한
쇼크 박스(삼각형, 각 측면의 길이 = 46cm, 높이 = 29cm)
무음 타이머
단일 출력 스크램블 애니멀 쇼커	라파예트 악기	HSCK100AP
세 개의 챔버 박스 (81 cm x 23 cm x 23 cm), 중간 챔버에 구멍이 있어 왼쪽과 오른쪽 챔버에 연결되어 있습니다.	사회적 차별 테스트
투명 케이지 (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)		부정적인 사회적 가치
투명 케이지 (26cm x 47cm x 21cm)			음식 습관화(긍정적 사회적 가치)
웹캠	Logitech	C920x
체중계
흰색 이젤 패드 종이			중립적 맥락의 바닥
백색 소음 발생기			60 dB
흰색, 플라스틱 접시
흰색 벽 케이지 (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)와 1 cm 직경의 플라스틱 튜브를 식품 포트로 사용합니다.	긍정적 인 사회적 원자가 맥락
와이어 컵 (원형, 4 개, 8cm x 8cm x 10cm)