Method Article

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

DOI:

10.3791/67556

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December 13th, 2024

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1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

In This Article

Summary

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우리는 형광 현미경을 통한 분석을 위해 폐 기도에서 곰팡이 포자의 자연스러운 위치를 보존하는 곰팡이 발병 모델에 대한 방법을 제시합니다.

Abstract

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곰팡이는 환경 포자가 폐로 흡입될 때 인간을 감염시킵니다. 폐는 이질적인 기관입니다. 기관지와 세기관지를 포함한 전도 기도는 가스 교환이 발생하는 폐포 공역에서 끝날 때까지 분기됩니다. 세기관지 또는 폐포에서 발생하는 감염은 뚜렷한 숙주 반응과 질병 징후를 유발합니다. 따라서 포자가 폐에서 자연적으로 어디에 위치하는지, 특히 감염 직후에 정확히 이해하면 숙주-병원체 상호 작용에 대한 조사 기회가 확대됩니다. 여기에서는 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia에 감염된 마우스의 폐에 대한 현장 분석을 자세히 설명합니다. 조직학적 보존을 위한 기존의 방법은 흡인된 진균 입자의 자연적인 위치를 대체하여 근위 세기관지에서 말단 기도로 포자를 밀어내는 고착 용액으로 기도를 액체로 팽창시키는 것입니다.

반대로, 혈액 혈관 관류 고정을 통한 공기 팽창 방법은 세기관지 내 곰팡이 포자의 생리학적 위치를 보존합니다. 또한 폐 표본을 동결 보존, 포매 및 이미징하는 간단한 접근 방식을 설명합니다. 또한 오픈 소스 QuPath 프로그램을 통해 고처리량 계산 기술을 공유하여 폐 내 곰팡이 포자의 공간 분포를 분석합니다. 여기에 제시된 방법은 간단하고 빠르며, 수행하는 데 최소한의 장비만 필요하고, 많은 호흡기 진균 감염 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

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인간은 다양한 환경 곰팡이로부터 하루에 최대 수십억 개의 포자를 흡입할 수 있습니다1. 이러한 흡입된 포자에 대한 장벽 방어를 이해하려면 이러한 포자가 기도와 폐 실질 내에 도달하는 정확한 미세해부학적 환경을 이해해야 합니다. 기도(즉, 상피 세포)의 세포 구성은 기관, 기관지, 세기관지 및 폐포를 따라 크게 변형됩니다. 이러한 각 영역은 병리학적 감염을 예방하기 위한 방어 무기고를 사용하는 별개의 기능을 가진 서로 다른 세포 유형으로 구성됩니다.

폐진균 포자 침착의 정확한 위치는 원주형 상피가 늘어선 세기관지, 폐포 관 또는 폐포2의 기도 내강에 따라 다를 수 있습니다. 임상적으로 관련된 대부분의 곰팡이 종은 직경 1μm에서 10μm 사이의 포자를 생성합니다3. 이러한 포자 입자가 폐에 침착하는 것은 공기 역학, 밀도, 전하 및 영동력과 같은 여러 요인에 따라 달라지며, 이는 흡입 후 침강 메커니즘에 영향을 줄 수 있습니다4. 일반적으로 큰 입자(> 6 μm)는 상기도에 침착하고, 중간 크기의 입자(2-6 μm)는 작은 기도에 침착할 수 있으며, 작은 입자(<2 μm)는 폐포 영역에 도달한다5. 아스페르길루스 포자(2-3 μm)가 폐포 공간에 도달하는 것으로 보고되었으나, 임상 병리학 보고서에서도 기관지 및 세기관지 질환의 상당한 부담을 시사하고 있다6. 또한 유연한 기관지 내시경 검사의 인기가 높아짐에 따라 Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida species, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum 및 Zygomycetes의 기관지 내 진균 감염에 대한 인식이 증가하고 있습니다7. 최근 생쥐의 아스페르길루스 감염에 대한 현미경 이미징의 발전으로 인해 기관지 및 세기관지와 같은 더 가까운 공기가 병리학적 진균 증식에 가장 큰 부담을 줄 수 있음이 밝혀졌습니다8. 폐진균 감염에 대한 숙주 반응에 대한 연구는 세기관지 상피 세포와 폐포 상피 세포가 모두 면역 파수꾼으로서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었으므로 포자 침착 및 상피 상호 작용의 정확한 위치를 밝히는 것이 향후 연구에 매우 중요할 것입니다 2,9,10.

이러한 근위 기도 발병 기전을 연구하는 것은 어려운 일인데, 그 이유는 표준 폐 고정 및 절편 준비 기술이 상피 내벽의 이러한 근위 위치에서 포자를 대체하고 원위 말단 폐포 부위로 밀어 넣을 수 있기 때문입니다. 일반적으로 10% 포르말린 또는 4% 파라포름알데히드는 폐를 팽창시키고 폐 전체를 고정제에 빠르게 노출시키는 데 사용됩니다. 동결절편을 위해 폐를 준비할 때, 일부 그룹은 동결절제 성능을 개선하기 위해 폐에 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 투여합니다11. 이러한 관행은 올바른 맥락에서 유용하지만, 우리 실험실과 다른 그룹에서 포자와 입자를 근위 위치에서 치환하여 포자에 노출된 세포 유형과 후속 숙주 반응에 대한 해석을 방해하는 것으로 밝혀졌습니다12.

흡입된 진균 포자의 미세해부학적 국소화를 정확하게 확립하기 위해 당사는 생쥐의 기도에서 진균 포자의 위치를 보존하기 위한 빠르고 자원이 적은 방법을 개발했습니다. Thomas et al. (2021)의 쥐 공기-인플레이션 혈관 관류-고정 방법을 적용하여 만족스러운 결과를 달성하는 데 필요한 장비, 시간 및 기술의 양을 줄였습니다13. 여기에 설명된 방법에서 우리는 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia(3-5μm 크기)가 이전에 표시된 것보다 더 근접하게, 즉 말단 폐포보다는 원위 세기관지 및 기관지-폐포 접합부에 축적되는 것을 관찰했습니다. 이 정보는 폐의 이러한 영역과 관련된 중요한 세포 유형과 흡입된 곰팡이 포자에 대한 초기 반응에 미치는 영향에 관한 생물학적 질문에 초점을 맞출 수 있습니다.

Protocol

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이 프로토콜에 설명된 모든 방법은 Rutgers Biomedical Health Sciences의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 세포 내 형광으로 포자 표시

  1. 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE), 세포 추적기 오렌지 또는 세포 추적기 빨간색(또는 선택한 세포 내 염료)에 1 x 106 포자를 30°C에서 30분 동안 5μM로 염색한 다음 PBS로 세척하고 12,000 x g에서 포자를 회전시킵니다 . 이 세척을 한 번 반복합니다.
  2. 25μL에 마우스 한 마리에 대한 적절한 포자 용량이 포함되도록 적절한 농도에서 포자 접종을 준비합니다.

2. 이소플루란 마취를 이용한 흡인 흡입을 통한 포자 마우스 접종

주의: 이소플루란은 휘발성 마취제이며 덕트가 있는 생물 안전 캐비닛 또는 흄 후드 내에서 사용해야 합니다.

  1. 이소플루란 노출 용기를 준비하려면 접힌 냅킨을 1L 나사 상단 Nalgene 용기에 넣고 냅킨 위에 플라스틱 메쉬 원을 마우스용 플랫폼으로 놓습니다. 냅킨에 이소플루란 2mL를 넣고 용기를 닫은 다음 용기에서 가스가 평형을 이룰 때까지 1-2분 동안 기다립니다.

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그림 1: 포자 접종의 이소플루란 개방 드롭 방법을 위한 장치. 접힌 냅킨을 1L 나사 상단 항아리의 바닥에 놓은 다음 원형 플라스틱 메쉬를 삽입하여 마우스의 플랫폼 역할을합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 마우스를 마취에 노출시키기 전에 25μL의 접종물이 포함된 피펫을 준비합니다. 마우스를 이소플루란 용기에 넣고 용기를 기울여 마우스가 의식을 잃고 거꾸로 된 오른쪽 반사 상실을 모니터링합니다. 일반적으로 약 10초가 걸립니다.
  2. 안정시 RR의 약 50%인 분당 50-80회(bpm)로 일관되게 느려질 때까지 호흡수(RR)를 모니터링합니다. 이것은 일반적으로 10초가 더 걸립니다. 이때, 이소플루란 용기에서 마우스를 꺼냅니다.
    참고: 이것은 고농도의 이소플루란으로, 빠른 마취 유도를 일으키며 마우스는 매우 면밀히 모니터링해야 합니다. 치명적인 이소플루란 과다 투여는 이소플루란의 농도가 가변적일 수 있고 이소플루란에 대한 용량-반응 곡선이 매우 가파르기 때문에 위험합니다. 호흡 속도가 50bpm 미만으로 떨어지거나 불규칙한 경우 마우스를 이소플루란에서 제거하고 3-5분 동안 회복할 때까지 기다린 다음 다시 시도합니다(최대 2회 반복 시도).
  3. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 한 손으로 마우스를 누운 자세로 놓고 마우스가 증가하는 속도(50-60bpm에서 시작)와 활력으로 3-5번의 규칙적인 헐떡임 호흡을 할 수 있도록 합니다. 이것이 시작되면, 피펫 끝을 쥐 구인두의 뒤쪽에 놓고 흡입하는 동안 접종물을 방출합니다.
    참고: 입을 통한 이러한 헐떡임은 호흡을 위한 부속 근육의 동원으로 인해 머리를 열등하게 충격을 줍니다. 이러한 헐떡임 중에 피펫을 삽입하면 헐떡일 때마다 입이 열려야 합니다. 입이 열리지 않으면 마우스가 충분히 마취되지 않은 상태이며 구인두의 내용물을 흡입하지 못할 가능성이 높습니다. 피펫은 혀를 눌러 입의 아래쪽과 앞쪽으로 밀어 접종물을 삼키지 않도록 해야 합니다. 피펫이 입에 들어가고 마우스가 적절하게 마취되면 마우스는 헐떡일 때마다 입을 벌립니다.
  4. 손과 엄지손가락으로 마우스를 잡고 마우스 흉부의 뒤쪽과 앞쪽에서 딱딱거리는 소리를 느껴 접종물의 흡입을 확인합니다.

3. 쥐의 안락사

  1. 희생 시점 10분 전에 200mg/kg 케타민과 24mg/kg 자일라진의 칵테일을 마우스에 복강내 주사합니다.
  2. 주사 후 마우스가 수술 마취 평면에 들어갈 때까지 10분 동안 기다리며, 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 확인됩니다.

4. PBS와 포르말린을 가진 폐의 관류

  1. 마취된 마우스에 70% 에탄올을 분사합니다. 가위를 사용하여 마우스의 피부를 잘라내고 피부를 당겨 모든 면의 복막을 노출시킵니다. 마우스의 위쪽 절반에서 피부를 머리 위로 당기고 피부에서 팔을 빼냅니다.
  2. 흉골과 흉곽의 아래쪽을 따라 복막을 잘라 복막을 노출시킵니다. 간을 하위로 치환하여 횡격막을 드러냅니다. 폐 자체에 구멍이 뚫리지 않도록 가위를 사용하여 횡격막을 폐 실질에서 조심스럽게 뚫습니다.
    참고: 실수로 폐에 구멍을 뚫으면 후속 공기 팽창이 불가능해집니다.
  3. 횡격막에 구멍이 뚫린 후 공기가 흉부로 들어가 폐를 무너뜨립니다. 왼쪽의 흉곽을 잘라 심장을 드러냅니다. 30G 바늘로 5-10mL의 PBS를 5초당 1mL의 속도로 우심실에 주입하여(혈관 손상을 방지하기 위해) 폐를 빠르게 희게 합니다.
    주의: 포르말린은 덕트가 있는 생물 안전 캐비닛 또는 흄 후드 내에서 취급해야 하는 유해 휘발성 물질입니다.
  4. 완료되면 바늘을 제거하고 새 바늘을 사용하여 5mL의 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 동일한 비율로 우심실에 주입합니다.

5. 관류된 폐를 공기 팽창시키기

  1. 흉곽의 앞쪽 절반을 제거합니다. 기관을 노출시키려면 목의 오른쪽과 왼쪽에 있는 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 자릅니다. 기관이 놓일 정중선 근처에서 절단하지 않도록 주의하십시오. 집게로 목 정중선에 남아 있는 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 잡고 기관이 노출될 때까지 위쪽으로 당깁니다.
  2. 10cm 길이의 봉합사를 준비하여 기관 아래로 당기고 노출된 기관의 아래쪽 끝에 느슨한 매듭을 미리 묶습니다. 18G 카테터로 1mL 공기 주사기를 준비합니다. 18G 바늘을 사용하여 노출된 부위의 위쪽 끝에 있는 기관에 구멍을 뚫습니다.
  3. 카테터를 그 구멍에 삽입하여 공기가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 비교적 단단히 끼워지도록 합니다. 10초 동안 1mL의 공기를 폐에 천천히 주입하면서 모든 엽의 폐 팽창을 관찰합니다. 완전히 팽창하면 폐가 심장을 약간 감싸고 구멍이 뚫리지 않은 횡격막에서 차지하는 부피를 채웁니다.
  4. 기관 주위의 매듭을 단단히 당기고 카테터를 제거합니다. 기관을 잡고 뭉툭한 가위를 사용하여 쥐에서 폐를 제거하고 폐에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.

6. 침수 기질 및 탈수

  1. 50mL의 10% NBF 20ml로 채워진 10mL 원추형 튜브의 상단 가장자리에 폐를 놓습니다. 봉합사 나사산을 원뿔형 바깥쪽에 두고, 캡을 조이고, 원뿔형을 뒤집어 폐가 20mL의 NBF에 거꾸로 매달려 있도록 합니다. 4 ° C에서 24-48 시간 동안 두십시오.
  2. PBS로 폐를 헹군 다음 30% 수크로오스-PBS(w/v) 용액에 4°C에서 72-96시간 동안 넣어 폐를 탈수시켜 동결 보존을 준비합니다. 자당에서 폐를 제거하고 폐를 최적 절단 온도(OCT) 매체의 극저온 몰드에 넣고 표본을 -80°C에서 동결합니다.

7. 냉동 절편

  1. 절편 전 1시간 동안 OCT cryoblocks의 시료를 저온 유지 장치의 -20°C 온도로 평형을 이룹니다. 20-100 μm 두께로 블록을 절단합니다.
    알림: 공기 팽창은 시편의 취약성을 증가시킬 수 있으며 증가된 두께로 절단하면 절편 중 조직 파손을 방지할 수 있습니다.
  2. 유리 슬라이드에 절편을 모으고 조직이 슬라이드에 부착되도록 30분에서 1시간 동안 건조시킵니다.
    참고: 이 단계에서 슬라이드는 -80°C에서 유지될 수 있습니다.

8. 슬라이드 준비 및 차단

  1. 슬라이드를 PBS 수조(접시 또는 Coplin 용기에 담기)에 실온(RT)에서 30분 동안 놓아 슬라이드에서 OCT를 제거합니다.
    참고: 두꺼운 부분(40-100μm)은 유리 슬라이드와 얇은 부분에 달라붙지 않을 수 있으므로 Coplin 항아리에 옆으로 눕히는 것보다 접시에 평평하고 똑바로 세우는 것이 가장 좋습니다.
  2. OCT가 조직에서 용해된 후 슬라이드를 건조시킵니다. 물티슈를 사용하여 조직 표본 주변의 슬라이드 주변에서 과도한 물방울을 건조시킵니다.
  3. 소수성 Pap 펜을 사용하여 표본 주위에 둘레를 그리고 5분 동안 건조시킵니다.
  4. 슬라이드당 300mL에 0.3% Tween-20 및 1:100 Fc 블록으로 동물이 없는 차단 용액의 차단 완충액을 준비합니다.
    참고: 세포 내 타겟의 경우 1% Tween-20을 사용할 수 있습니다. 일반적으로 300μL의 부피로 충분하지만, 조직을 완전히 덮는 데 필요한 부피는 소수성 마커의 둘레 크기에 따라 다릅니다. 이 시점부터 조직이 건조되어서는 안 됩니다.
  5. RT에서 1시간 동안 슬라이드의 차단 용액을 그대로 둡니다.

9. 면역염색

  1. 유체를 피펫으로 분리하고 300-500 μL의 PBS를 첨가하여 슬라이드를 세척합니다. 세탁을 한 번 반복합니다.
  2. 0.33% Tween-20(또는 세포 내 표적의 경우 1%)을 함유한 비동물 차단 용액에 1차 AlexaFluor-647 접합 쥐 항-마우스 EpCAM(클론 G8.8) 항체(기도 상피 마커)를 준비합니다. 이 용액의 슬라이드당 300μL를 추가하고 4°C에서 밤새 염색합니다.
    참고: 항체는 염색 농도, 시간 및 온도에 대해 경험적으로 테스트해야 합니다. 얇은 부분(8-20 μm)은 37 °C에서 30분 동안, 더 두꺼운 부분(20-100 μm)은 대부분의 항체에 대해 1:100 희석액을 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 염색합니다. 비접합 항체를 사용하는 경우 2x(위와 같이)를 세척하고 경험적으로 결정된 시간과 온도에 대해 2차 형광 항체를 적용합니다. 일반적으로 2차 항체 염색은 1:1000 희석에서 1시간 동안 RT에서 수행됩니다.
  3. 검체에서 항체 용액을 제거하고 PBS 300mL로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 이 세척을 한 번 반복하십시오. 슬라이드를 건조시켜 표본과 주변 유리에서 과도한 액체를 모두 제거합니다.
  4. 각 조직 조각에 RT 소프트 세트 마운팅 미디어(예: SlowFade Glass) 한 방울을 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 병을 거꾸로 놓고 한 방울 한 방울을 티슈에 천천히 떨어뜨립니다. 적절한 크기의 커버 슬립을 샘플과 소수성 마커 둘레를 넘어 확장할 수 있도록 배치합니다.

10. 형광성 현미경 검사법을 통한 화상 진찰

  1. 멀티채널 형광 현미경을 사용하여 개별 포자 및 숙주 세포를 분해하기에 충분한 해상도의 대물렌즈를 사용하여 편향되지 않은 방식으로 전체 폐 절편을 스캔합니다(예: NA = 0.8 또는 이와 유사한 20x 오일 대물렌즈를 사용하는 Zeiss Axioscan 7).
    알림: 레이저 출력 및 PMT 전압 이득은 FMO(Fluorescence Minus One) 제어로 결정된 배경에서 대상의 신호 대 잡음비를 최대화하도록 설정됩니다.
  2. 전체 폐엽을 캡처할 수 있는 충분한 이미지 타일을 수집합니다(예: 400μm x 400μm 크기의 ~200개 타일). 현미경 소프트웨어 프로그램(예: Zeiss ZEN 3.7 또는 이와 유사한 것)을 사용하여 다운스트림 처리를 위해 병합된 타일 이미지를 내보냅니다.

11. QuPath를 통한 공간 분석

  1. 무료 오픈 소스 소프트웨어인 QuPath(14)에서 프로젝트 파일을 만들고 파일에 형광 이미지를 추가합니다.
  2. 상단 메뉴 옵션인 Classify(분류)를 클릭한 다음 Pixel classification(픽셀 분류) > Create Thresholder(임계값 생성)를 클릭하여 EpCAM+ 픽셀을 상피로 분류합니다. 해상도, 채널, 평활화 시그마 및 대상 영역을 가장 잘 식별하는 임계값을 선택합니다. 분류자를 고유한 이름으로 저장하고 개체 만들기를 선택합니다.
  3. 새 Create objects(개체 만들기 ) 창에서 New object type(새 개체 유형 )을 Annotation(주석)으로 선택합니다. 폐 상피의 경우 최소 개체 크기와 최소 구멍 크기를 100mm2로 설정합니다. 여기서 개체 분할 을 선택할 필요가 없습니다. 확인을 선택하면 주석이 생성되고 왼쪽 상단 영역에 있는 브러시 도구를 사용하여 눈으로 수정할 수 있습니다.
  4. 포자를 분류하려면 포자가 캡처된 채널을 사용하여 11.3-11.4의 단계를 반복하고 새 개체 유형을 주석이 아닌 감지로 만듭니다. 최소 객체 크기와 최소 구멍 크기를 0mm2로 설정하고 객체 분할을 선택합니다.
  5. 포자의 공간 분석을 수행하려면 상단 메뉴 옵션인 Analyze > Spatial Analysis > Calculate signed distance to annotations 2D를 선택합니다. 감지된 각 포자에 대해 EpCAM+ 상피까지의 거리가 계산됩니다. 상단 메뉴 옵션인 Measure > Export Measurements를 통해 내보냅니다.

Results

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이 방법은 궁극적으로 생리학적 공기 팽창을 사용하여 기도가 방해받지 않도록 마우스 폐의 면역 형광 이미지를 생성합니다. 중요한 것은 그 과정에서 여러 체크포인트를 통해 프로토콜의 구성 요소가 성공적으로 수행되었는지 확인할 수 있다는 것입니다. 접종하는 동안 액체가 기도로 들어갔다는 것을 나타내는 마우스의 뒤쪽 흉벽에서 "딱딱거리는 소리"를 느껴 접종이 흡인되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 딱딱거리는 소리가 나지 않으면 쥐가 접종물을 삼켰을 가능성이 있습니다. 생쥐 폐에 PBS를 관류하면 폐가 하얗게 변한 후 폐 전체가 완전히 하얗게 됩니다(그림 2A). 불완전한 미백이 있는 경우, 후속 포르말린 관류가 폐 실질의 모든 영역에 도달하지 않습니다(그림 2B). 폐를 공기로 팽창시킬 때 폐는 생리학적 크기에 도달할 때까지 천천히 팽창해야 합니다. 폐 내부의 공기를 확보하기 위해 기관 봉합사를 묶은 후에는 폐의 크기가 수축하지 않아야 합니다. 만약 그렇다면, 시술 중에 폐에 구멍이 났을 가능성이 있습니다.

여기에서는 공기 팽창 및 포르말린 액체 팽창 폐 모두에서 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 포자(녹색) 및 EpCAM+ 원주 세기관지 상피(자홍색)가 표시된 단면의 대표 이미지를 보여줍니다(각각 그림 3A, B ). 이 포자는 주로 원위 세기관지와 원위 세기관지에 바로 인접한 폐포 공간에 축적되며, 아마도 치조관에 축적됩니다. 공기로 팽창된 고정제가 관류된 폐에는 포자가 세기관지 상피에서 약간 더 분산되어 보이는 액체 고정액(그림 3B)보다는 세기관지 내에서 더 자주 나타나고 세기관지에 더 가깝게 군집하는 포자(그림 3A)가 포함되어 있습니다. QuPath 공간 분석을 통해 개별 포자가 가장 가까운 EpCAM+ 세기관지 상피까지의 거리를 측정하여 포자가 세기관지에서 더 멀리 떨어진 더 원위적인 폐포 공간으로의 분산 수준을 나타냅니다. 우리는 액체 팽창이 생리학적 공기 팽창에 비해 포자를 세기관지에서 더 멀리 분산시킨다는 것을 보여줍니다(그림 4A, B). 공기 팽창 혈관 관류는 원위 세기관지에서 이러한 포자의 자연스러운 위치를 보존하고 기관 내 고정 점안에 의해 이러한 포자가 더 원위 폐포 공간으로 인위적으로 분산되는 것을 방지합니다.

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그림 2: 폐 관류 성공 표시. (A) 성공적으로 관류된 폐는 완전히 흰색이 됩니다. (B) 불완전하게 관류된 폐는 분홍색 또는 얼룩덜룩한 모양으로 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 공기가 팽창된 포르말린이 주입된 폐와 포르말린이 팽창된 폐의 포자 분포를 보여주는 대표적인 이미지. 세포 내 형광 포자(녹색)는 (B) 포르말린이 팽창된 폐보다 (A) 공기로 팽창된 폐에서 EpCAM+ 세기관지 상피(자홍색)에 더 가깝게 분포하는 것으로 보입니다. 이미지는 20배 배율로 다중 채널 형광 현미경에서 각 치료 그룹의 마우스의 왼쪽 엽 후방면에서 1.2mm 깊이의 절편에서 얻었으며 현미경 소프트웨어를 사용하여 타일을 스티칭했습니다. 스케일 바 = 800μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 공기로 팽창된 폐와 포르말린으로 팽창된 포자로 처리된 폐 사이의 포자에서 세기관지 상피까지의 거리(mm) 비교. 치료 그룹당 3마리의 마우스에서 폐를 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia를 접종한 후 1.5시간 동안 수확, 가공 및 이미지화했습니다. 좌엽의 뒤쪽 표면에서 0.8mm, 1.2mm, 1.6mm 및 2.0mm에서 마우스당 4개의 절편을 샘플링하고 염색하고 다중 채널 형광 현미경에서 이미지화했습니다. 각 그룹의 모든 포자는 QuPath에서 검출되고 공간적으로 분석되어 (A) 가장 가까운 EpCAM+ 원주 세기관지 상피까지의 거리와 (B) 중앙값 및 95% 신뢰 구간이 마이크로미터 단위로 표시됩니다. 공기 팽창 포자, n = 11,673. 액체 인플레이션 포자, n = 9,837. Mann-Whitney t-검정은 정규성 부족으로 인해 수행되었으며 p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

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우리는 포자 흡입 및 흡입된 포자의 공간적 침착 분석을 위한 파이프라인을 구축했습니다. 이 파이프라인은 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia의 흡입에 의해 영향을 받는 폐의 관련 기질 영역을 결정하는 데 유용한 정보를 제공합니다. 우리는 콕시디오이데스(Coccidioides), 포자 및 유사한 크기의 불활성 입자(데이터는 표시되지 않음)가 폐포 기도 내강 전체에 완전히 분산되지 않고 원위 세기관지 영역과 기관지-폐포 접합부에 축적되는 것을 관찰했습니다. 이 모델은 자연스러운 폐 형태를 유지하면서 기도 내용물의 생리학적 무결성을 유지하는 면역형광(또는 면역조직화학[IHC]과 같은 기타 다운스트림 파이프라인)을 위한 극저온 절편을 생성하기 위해 상대적으로 낮은 수준의 장비와 기술이 필요합니다. 공기 팽창이 없으면 폐포의 붕괴는 세기관지를 둘러싼 폐 실질의 자연 구조를 왜곡합니다13,15. 조직학적 처리 중 폐의 공기량 손실은 미국 흉부학회(American Thoracic Society)와 유럽호흡기학회(European Respiratory Society)의 공동 공식 연구 정책 성명서에서 폐 구조의 정량적 평가 기준을 정의하면서 "심각한 문제"로 지적되었다16. 또한, 기관내 고정제 주입은 뮤신, 계면활성제, 기도 섬모와 같은 근위 기도 분자 및 세포 구성 요소의 특성과 위치를 방해할 수 있습니다 17,18,19. 여기에 설명된 방법은 흡입된 곰팡이 포자와 상호 작용하는 기도를 따라 분자 및 세포 구성 요소와 함께 폐의 공기량을 충분히 보존합니다.

면역형광 현미경 검사는 폐 구성 요소의 공간 역학을 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공하며, 이에 대한 검토가 잘 이루어졌습니다20,21. 포르말린 고정에 민감한 에피토프를 가진 항체가 표적에 만족스럽게 결합하지 못할 수 있다는 점을 제외하고는 이러한 섹션의 면역형광을 통해 염색할 수 있는 표적에 대한 제한은 없습니다. 새로운 항체를 사용할 때는 항체가 배경 위에서 신호를 생성하는지 여부를 확인하기 위해 FMO(Fluorescence Minus One) 대조군을 준비하는 것이 가장 좋습니다. 2차 항체를 사용하는 경우, 1차 항체가 없는 치료군을 사용하여 2차 항체의 off-target 결합을 조절합니다. 1차 접합 단클론 항체는 매우 특이적이므로 더 짧은 시간(30분) 동안 더 높은 온도(37°C)에서 염색하는 것이 일반적이며 일반적으로 표적에 특이적으로 결합합니다. 반면에, 비접합 다클론 항체는 항원 검출에 더 민감하지만 특이성이 낮기 때문에 더 낮은 온도(4°C)에서 더 긴 배양(~16시간)은 신호 대 잡음비를 최적화합니다. 모든 항체는 경험적 최적화가 필요합니다.

포자 국소화를 위해 이 연구에서 사용된 공간 분석 모델은 개별 포자가 가장 가까운 세기관지 상피까지의 거리를 측정합니다. 이를 위해서는 높은 EpCAM 신호를 사용하여 세기관지 상피를 적절하게 식별하고 원주형 상피 라이닝 튜브와 같은 구조로 형태학적으로 뚜렷한 모양을 필요로 합니다. EpCAM은 폐포 상피에 의해 더 낮은 수준에서도 발현될 수 있으므로 정의된 주석을 형태학적으로 확인된 세기관지 영역으로 제한하기 위해 QuPath에서 EpCAM 신호를 임계값으로 설정하는 것이 중요합니다. 세기관지는 해부학적 최소 크기를 가지므로 11.3단계에서 설명한 대로 이러한 영역의 QuPath 정의를 최소 면적인 100mm2로 제한할 수 있습니다. 이렇게 하면 폐포 II형 상피 세포와 같은 폐포 공간 전체에 걸쳐 고립된 높은 EpCAM 발현 세포 또는 아티팩트가 QuPath 주석에서 제외됩니다. 이러한 단계를 통해 배타적으로 세기관지 상피를 QuPath 주석으로 정의하고 이 정의된 세기관지 상피에 대한 포자의 근접성을 결정할 수 있습니다.

여기에 설명된 감염 모델은 이소플루란 마취를 사용하여 진균 포자의 흡인을 위해 마우스에서 구강 헐떡임 반응을 유도합니다. 이소플루란 오픈 드롭(isoflurane open drop) 방법은 마우스에서 단기 마취를 유도하기 위한 빠르고 자원이 적은 기술로 개발되었습니다 9,22,23. 이 방법을 일관되게 수행하려면 몇 가지 연습이 필요합니다. 마취 시간은 인두 내용물을 흡인하기 위해 마우스를 충분히 마취시킬 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 마우스가 충분히 마취되지 않으면 접종물을 흡인하는 대신 삼킬 수 있습니다. 충분한 마취의 징후는 마우스가 약 50-60 헐떡임/분의 속도로 증가하는 활력의 규칙적인 구강 헐떡임을 생성할 때 도달합니다. 누운 쥐의 머리는 헐떡일 때마다 앞으로 움직여야 합니다. 불충분한 마취는 헐떡거림이 없거나 수염, 혀 또는 팔다리의 움직임이 없는지 확인할 수 있습니다. 삼키는 것을 방지하기 위해 접종물을 투여하는 동안 피펫 끝으로 혀를 누르는 것이 가장 좋습니다. 이소플루란의 과다 복용은 마우스의 죽음을 초래할 수 있으므로 예방해야 합니다. 이를 방지하기 위한 좋은 경험 법칙은 마우스가 오른쪽 반사를 잃을 때까지 동일한 시간이 걸린 후에 이소플루란에서 마우스를 제거하는 것입니다. 예를 들어ample, 마우스가 오른쪽 반사를 잃는 데 10초가 걸리면 추가로 10초 후에 마우스를 제거합니다. 이소플루란 가스가 여러 마우스 치료 과정에서 빠져나가기 때문에 이 기간이 늘어날 수 있습니다. 우리 손에서는 더 많은 이소플루란을 첨가하지 않고 6-8마리의 쥐를 치료할 수 있습니다.

이 프로토콜의 구성 요소에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 접종 절차는 25μL의 유체 PBS 배지에 현탁된 포자를 사용하며, 이는 포자의 에어로졸 접종보다 생리학적으로 덜 낮습니다. 흡인액의 사용이 공기 중 포자 흡입과 같은 다른 접종 방법과 비교하여 포자/입자의 국소화를 변경하는지 여부에 대한 미해결 질문이 남아 있습니다. 그러나 에어로졸 흡입에는 광범위한 자원 투자가 필요하며 연구 및 실험실 환경의 특성에 따라 최적이 아닐 수 있는 다른 제한 사항(제한된 접종 크기, 다양한 노출, 직업적 위험)이 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 동결 절제 중에 조직 취약성이 발생할 수 있다는 것인데, 이는 조직 전체에 공기가 존재하거나 기관 내 고정에 비해 혈관 고정의 효과가 감소하기 때문일 수 있습니다. 이 동결 절편 취약성은 60-100μm의 두꺼운 절편을 절단하고 컨포칼 현미경을 사용하여 조직 내의 2차원(2D) 평면을 이미지화함으로써 극복할 수 있습니다.

우리는 이 방법의 단순성과 적응성을 통해 다른 그룹이 선택한 흡입 병원체 및 관심 있는 숙주 반응으로 유용성을 찾을 수 있을 것이라고 믿습니다.

Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

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자금 및 지원은 NIH 보조금 K22 AI153678-01 및 Rutgers School of Graduate Studies를 통해 획득되었습니다. 면역형광 이미지를 획득하는 데 기여한 Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core의 Fawad Yousufzai와 Luke Fritzky에게 감사드립니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 G, 1 1/2 바늘 (305185)피셔305185
1 L  스크류탑 항아리  (날진)Fisher Scientific11-823-33
Air-Tite 벌크 비멸균 주사기 10 mL 루어 락Fisher14-817-175
AnaSed 주사(자일라진 멸균 용액)Akorn59399-110-20
동물 무함유 차단제 및 희석제, R.T.U.VectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard 날개 달린 차폐 IV 카테터, BD Vialon 카테터 재료 18 G x 1.88 inBD381547
Pharmingen 정제 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD Fc 블록 및 거래;)BD553142
CellTracker 오렌지 CMRA 염료피셔 과학NC0873640
CFSELabviva75003
콕시디오이데스 포사다시 cts2/ard1/cts3&델타;  BEI ResourcesNR-166
Corning 70 미크론 스트레이너VWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 단클론 항체Biolegend118211
Exel International HYpodermic 바늘 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand 일회용 멸균 주사기 (1mL, Leur Slip)Fisher14-955-462
포도당 일수화물Azer Scientific ES17530-500G
고진공 그리스VWR59344-055
Hoechst 33342 솔루션 20 mM (5 mL)ThermoFischer62249
Isoflurane USPCovetrus29405
케타민 염산염Dechra1000001250
KIMWIPES 섬세한 작업 와이퍼 (4.4'' x 8.4")VWR21905-026
Lexer Baby ScissorsFST14078-10
Micro-Adson ForcepsFST11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Nunc EasYFlask 조직 배양 플라스크, T75, 필터 캡VWR15708-134
PBSVWR45000-446
Peel-A-Way 임베딩 몰드SigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 소프트웨어오픈 소스https://qupath.github.io/
실크 봉합사 실 크기 3/0FST18020-30
슬라이드마이크로 슬라이드 Superfrost Plus VWR48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)ThermoFischerS36917
SucroseSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605. AP
Vector Laboratories ImmEDGE 소수성 배리어 펜 2개 세트Fisher ScientificNC9545623
VWR 마이크로 커버 안경, 직사각형 (24 mm x 40 mm #1.5)VWR48393-230
흰색 플라스틱 와이어 메시MAPORCH789862904922
효모 추출물FisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html다채널 형광 현미경
ZEN 3.7 소프트웨어Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html현미경 소프트웨어

References

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