이 프로토콜은 자당 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 림프구에서 소핵을 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 소핵의 구성과 기능을 조사하기 위한 실험적 기초를 제공합니다.
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방법 논문
이 프로토콜은 자당 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 림프구에서 소핵을 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 소핵의 구성과 기능을 조사하기 위한 실험적 기초를 제공합니다.
소핵(MN)은 해결되지 않은 DNA 손상 또는 유사분열 오류로 인해 방사선과 같은 외부 손상에 노출될 때 세포, 특히 골수 또는 혈액 세포에서 형성되는 비정상적인 핵 구조입니다. 일단 형성되면 MN은 염증 신호 전달 및 염색체 유전자 재배열을 포함한 다양한 발암 과정에 적극적으로 기여할 수 있습니다. MN은 핵 DNA, 히스톤, 핵단백질 단편 및 기타 활성 단백질을 포함하고 있으며, 이는 그 기능과 밀접한 관련이 있습니다. MN의 형성과 구성 요소를 연구하는 것은 발암 과정을 주도하는 MN의 역할을 이해하는 데 중요합니다. MN의 추출 및 정제는 이러한 연구 목표를 달성하는 데 필수적입니다. 그러나 MN 핵막의 불안정성과 파열에 대한 민감성으로 인해 이러한 과정은 기술적으로 어렵습니다. 현재 MN 분리를 위한 밀도 구배 원심분리의 사용을 보고한 연구는 소수에 불과합니다. 이 연구는 MN 분리 및 정제 과정을 요약하고 단순화합니다. 방사선에 노출된 인간 말초 혈액 림프구를 분리하고, MN을 분리하여 2단계 공정에서 서로 다른 농도의 자당 완충액을 사용하여 정제했습니다. MN의 무결성과 순도가 검증되어 MN의 원인과 기능을 조사하는 연구자에게 실험 절차에 대한 명확하고 실용적인 시연을 제공했습니다.
소핵(MN)은 핵 DNA, 히스톤 및 핵단백질 조각을 포함하는 세포질의 세포 내 구조로, 막 구조 1,2로 둘러싸여 있습니다. MN은 주핵과 완전히 분리되어 있으며 일반적으로 주핵 직경의 1/16에서 1/3 사이의 크기를 가진 타원형 또는 원형 모양으로 그 근처에 나타납니다. MN의 형성은 주로 비심성 염색체 단편, 염색체 불일치, 이심성 염색체 파손, 염색체 불안정성 및 이중 분(DB)3의 응집과 관련이 있습니다. MN은 건강한 세포에서 드물게 발생하며 주로 외인성 제노톡신에 노출되어 발생하며, 이는 DNA 손상 또는 유사분열 오류를 유발합니다 4,5. 방사선 손상은 MN 형성에 중요한 기여를 하며, 임상 및 기술 응용 분야의 발전으로 전리 방사선(IR)에 대한 인체 노출이 증가했습니다 6,7. IR 노출은 세포 DNA에서 단일 가닥 절단(SSB) 및 이중 가닥 절단(DSB)을....
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인간 말초 혈액 샘플과 관련된 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 중국 원자력 산업 416병원 윤리위원회(2020 Review [No. 48])의 승인을 받았으며, 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었다. 제외 기준에는 종양, 통풍 또는 혈액 질환과 같은 주요 만성 질환이 있는 개인과 직업에서 방사성 또는 유전 독성 물질에 노출된 개인이 포함되었습니다. 이 연구를 위해 건강한 28세 남성의 말초 혈액 10mL를 항응고제로 헤파린 나트륨이 들어 있는 채혈 튜브에 채취했습니다. 샘플은 감마 공기 운동 에너지 치료 수준 표준 장치를 사용하여 37°C에서 60Co γ선을 시험관 내에서 조사했습니다. 방사선 조사량은 4.0 Gy로 설정되었으며 선량률은 0.6350 Gy/min입니다. 방사선 조사 후, 샘플을 37°C에서 2시간 동안 배양하고, RPMI-1640 배지에 접종하고, 37°C에서 60시간 동안 배양했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.
1. 소핵 및 핵의 제조
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방사선에 노출된 후 인간 말초 혈액을 RPMI-1640으로 60시간 동안 배양한 다음 소핵(MN) 준비를 위해 사이토칼라신 B를 첨가했습니다. 림프구는 림프구 분리 용액을 사용하여 분리한 후 특별히 구성된 세포 용해물로 용해하고 유리 균질화기에서 부드러운 균질화를 수행했습니다. 균질산염을 1.8M 자당 완충액과 1:1로 혼합하였다. 정제되지 않은 소핵은 첫 번째 슈크로스 밀도 구배 원심분리 후에 수득하고, 정제된 소핵은 두 번째 슈크로스 밀도 구배 원심분리 후에 수득했습니다(그림 1).
첫 번째 자당 밀도 구배 원심분리 후, 정제되지 않은 소핵을 세포 도말로 준비하고 항γ-H2AX 및 DAPI 형광 염색을 실시했습니다. 그 결과 정제되지 않은 소핵의 크기가 크게 변했으며 일부 더 큰 소핵이 보였다(그림 2A). 두 번째 자당 밀도 구배 원심분리 후, 정제된 소핵을 세포 도말.......
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이 방법에서는 방사선 조사된 인간 말초 혈액 림프구를 사용하여 소핵(MN)을 분리하고 정제했습니다. 이전의 많은 연구에서 MN 4,32,33,34의 세포 용해 및 1차 분리에 대한 자세한 단계를 보고했습니다. 세포 용해 용액은 일반적으로 0.1% NP-40을 포함하여 핵막에 미치는 영향을 최소화하면서 세포막을 파괴하여 핵과 MN의 무결성을 보존합니다.특히, 용해물의 다른 성분도 완충 역할을 합니다 4,32,33,34
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모든 피규어는 WPS 사무실을 통해 저자가 제작했습니다. 이 연구는 청두 의과대학 자연과학재단(CYZ19-38)과 쓰촨성 과학기술지원프로그램(2024NSFSC0592)의 지원을 받았다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 원뿔형 튜브 | Thermo | 339650 | |
| 4% 파라포름알데히드 용액 | Beyotime | P0099 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Thermo | 339652 | |
| Anti-γ-H2AX 항체 | Bioss | bsm-52163R | |
| 소 혈청 알부민 | Beyotime | ST023 | |
| 염화칼슘 | Biosharp | BS249 | |
| Cytochalasin B | Macklin | 14930-96-2 | |
| DAPI 염색 용액 | Bioss | S0001 | |
| 디티오트레이톨 ( DTT) | Coolaber | CD4941 | |
| EDTA | Biosharp | BS107 | 에틸렌 디아민 테트라아세트산 |
| 형광 현미경 | Nikon | Ti2-U | |
| Homogenizer | Ybscience | YB101103-1(20mL) | |
| 수평 제어 온도 원심분리기 | Thermo | Sorvall ST1R plus | 브레이크 속도는 "5"로 설정됩니다. |
| 인간 림프구 분리 용액 | Beyotime | C0025 | |
| 마그네슘 아세테이트 | Macklin | M833330 | |
| NP-40 | Coolaber | SL9320 | 10% 용액 |
| 인산염 완충 용액(PBS) | HyClone | SH30256.01B | |
| 프로테아제 억제제 | Coolaber | SL1086 | 칵테일 (100×) |
| 2차 항체 | Bioss | Bs-0295G | 염소 안티 토끼 IgG H& L/FITC |
| 스페르미딘 | 쿨라버 | CS10431 | |
| 스페르민 | 쿨라버 | CS10441 | |
| 자당 | 쿨라버 | CS10581 | |
| 트리스-HCl | Biosharp | BS157 | |
| 트리톤 X-100 | Beyotime | P0096 |
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