Method Article

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

DOI:

10.3791/67565

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐 이식은 특발성 폐 섬유증과 같은 말기 폐 질환 환자에게 중요한 치료법이지만, 기증자 부족 및 이식 후 합병증과 같은 문제는 여전히 남아 있습니다. 환자 특이적 세포를 탈세포화된 동물 골격에 통합하는 생명공학적 폐는 유망한 대안을 제시합니다. 동물 모델에서 생명공학적 폐를 사용하는 데 진전이 있었음에도 불구하고 기능과 구조는 여전히 미성숙합니다. 이 프로토콜은 장기 생명 공학의 중요한 장벽, 즉 비용 효율적인 실험 플랫폼의 필요성을 해결합니다. 쥐나 돼지와 같은 큰 동물 대신 마우스 모델을 사용함으로써 연구원들은 각 실험에 필요한 리소스를 크게 줄여 연구 진행을 가속화할 수 있습니다.

이 프로토콜은 마우스 심장-폐 차단과 인간 일차 세포를 사용한 폐 생명공학에 대한 자세한 절차를 설명하며, 마우스 심장-폐 차단에 대한 분리 전략, 탈세포화, 생물반응기 설정, 관류 기반 장기 배양 및 생명공학 폐의 이정소 이식에 중점을 둡니다. 이 마우스 스케일 플랫폼은 실험 비용을 절감할 뿐만 아니라 재세포화를 위한 세포 유형 및 수를 최적화하고, 조직학적 및 분자적 방법을 사용하여 다양한 세포 유형을 테스트하고, 이식 후 혈류를 보장하기 위한 실행 가능한 프레임워크를 제공합니다. 이 방법은 3차원 배양 조건에서의 세포 상호 작용 연구, 세포-매트릭스 상호 작용 및 생체 외 암 모델링을 포함하여 광범위한 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있어 장기 생명 공학 분야를 발전시킬 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐 이식은 특발성 폐 섬유증과 같은 말기 폐 질환1을 앓고 있는 환자에게 결정적인 치료법이 되어 왔는데, 약물 치료는 호흡 기능의 저하를 막는 데 효과가 없습니다. 매년 더 많은 적격 환자가 대기자 명단에 추가됩니다. 그러나 사망한 기증자의 장기 기증 건수는 대기 환자 수의 증가에 뒤처지고 있다 2,3. 폐 이식을 받은 후에도 원발성 장기 기능 장애, 반응성 동종 증후군, 감염 등 이식된 폐의 기능을 저하시키는 몇 가지 문제가 발생하여 폐 이식 수혜자의 5년 생존율이 현저히 저하된다4.

장기 이식의 현재 문제점에 대처하기 위해 한계 기증자의 활용5, 체외 폐 관류 시스템6에서 기증자의 폐를 회복하는 것, 유전자편집 돼지를 이용한 이종 이식7 등 여러 가지 옵션이 있습니다. 이러한 대안은 기증자 장기 풀을 확장할 수 있습니다. 그러나 어느 것도 기증자 장....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험은 도호쿠 대학이 발행한 도호쿠 대학의 동물 실험 및 관련 활동에 관한 규정(15판)을 따랐습니다. 이 연구는 도호쿠 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#2020AcA-041-01)의 승인을 받았습니다.

1. 탈세포화를 위한 재료 준비

  1. 탈세포화 용액 준비(1L 오토클레이브 유리병에 담긴 1,000mL 형식)
    1. 멸균 탈이온수(DI): 1L 오토클레이브 유리병에 증류수 또는 DI수 1,000mL를 첨가합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
    2. Triton X-100: 1L 형식의 오토클레이브 유리병에 1,000mL의 멸균 DI 워터에 Triton X-100 1mL를 추가합니다. (선택 사항) 페니실린 10mL와 스트렙토마이신 용액(최종 농도, 페니실린 500단위/mL 및 스트렙토마이신 500μg/mL)을 추가합니다.
      참고: 오토클레이브하지 마십시오.
    3. 소듐데옥시콜레이트: 20L 형식의 오토클레이브 유리병에 1,000mL의 멸균 DI 물에 데옥시콜산나트륨 분말 1g을 첨가합니다. 뚜껑을 닫고....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

탈세포화 프로토콜에 따라 생쥐의 폐는 눈에 띄게 흰색이고 반투명합니다(그림 6A). 세포 성분은 완전히 제거되어야 하지만, 조직학적 관찰에서 폐포 구조는 그대로 유지됩니다(그림 6B,C). 2일 관류 기반 생물반응기 배양과 함께 3 × 107 HUVEC를 사용한 재세포화된 마우스 폐는 HUVEC의 균일한 분포를 보여줍니다(그림 7A). HUVEC은 말초 폐포 영역으로 이동하여 모세혈관 네트워크를 형성합니다(그림 7B). 생명공학 폐의 정소성 이식 및 재관류 후, 적혈구를 포함하는 혈류가 생명공학적 폐에서 균일하게 관찰됩니다(그림 8A, B).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

장기 생명 공학은 까다로운 사업입니다. 비용이 많이 드는 심사 과정은 이 분야의 연구 개발 주기를 방해하고 있습니다. 마우스를 실험 플랫폼으로 사용함으로써 이전에 사용된 랫드 플랫폼에 비해 공간, 세포 및 배지가 크게 줄었습니다. 가스 교환, 혈관 저항 또는 폐 순응도와 같은 상세한 물리적 매개변수를 측정하는 것은 아직 이루어지지 않았지만, 마우스 폐 모델을 사용하면 실험 프로토콜의 신속한 반복과 세포 생존력, 통합 및 골격 상호 작용의 테스트를 가능하게 하므로 연구 일정을 단축할 수 있습니다. 마우스는 빠르게 번식하고 수많은 유전자 변형 균주에서 사용할 수 있어 생체 내에서 다양한 유전 및 세포 변형을 연구할 수 있는 유연성을 제공합니다. 가설을 신속하게 테스트하고 프로토콜을 최적화하는 이러한 능력은 성공적인 폐 생명 공학에 필요한 최적의 세포 환경 및 배양 기술에 대한 이해를 높이는 데 도움이 됩니다. 연구자들은 생쥐 모델의 기술을 개선함으로써 확장 가능한 방법과 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 원고와 관련하여 어떠한 이해 상충도 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 과학연구를 위한 보조금 / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, TS #22KK0132 공동국제연구촉진기금(B)), 대만 JSPS KAKENHI 보조금 번호 21K08877, FT를 위한 Leave a Nest Grant Ikeda-Rika 상, FT를 위한 JSPS 펠로우를 위한 Grant-in-Aid #21J21515의 재정 지원을 받았다. 도호쿠 대학 대학원 의과대학 의생명 연구 핵심의 기술 직원인 우에다 마이코 씨의 조직학적 관찰에 대한 집중적인 연구에 감사드립니다. 또한 도호쿠 대학 IDAC의 연구 기기 센터의 Yoshida Yumi 씨와 Koji Kaji 씨의 화상 처리 지원에 대한 기술 조언에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
탈세포화
27G x 1/2인치 BD PrecisionGlide 바늘BD305109또는 동급 27G 주사 바늘
BD Insyte IV 카테터 20 GA X 1.8 8INBD381237또는 동급 20G IV 카테터
블레이드 실크 봉합사 (4-0)NescoGA04SB또는 동급 CaCl
2Sigma-AldrichC5670
쥐 경정맥용 카테터, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301체중이 30g 이하인 마우스에게 권장됩니다.
쥐 경정맥용 카테터, PU 3Fr 10cmInstechC30PU-RJV1307체중이 30g 이상인 쥐에게 권장됩니다.
DNase I시그마-알드리치DN25
MgSO4시그마-알드리치M7506
NaCl시그마-알드리치S3014
핀포트 인젝터InstechPNP3M
핀포트, 22GInstechPNP3F22-50C30PU-RJV1307
핀포트, 25GInstechPNP3F25-50C20PU-MJV1301에 적합
데옥시콜레이트 나트륨Sigma-AldrichD6750
멸균 주사기, 5mL일반
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
CELL CULTURE
EGM-2 내피 세포 성장 배지-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – 인간 제대 정맥 내피 세포LonzaC2519A
관류 기반 생물 반응기 20G
바늘일반
3방향 마개 일반
르크 천공기일반보링 크기, 6-10mm
EasyLoad III 펌프 헤드Cole-Parmer243934
유리 캐니스터HarioSCN-200T내경 : 80mm
가열 마그네틱 교반기일반
미끼 피팅, PVDF, 소프트 튜브Nordson Medical2-9965-01암, ID 1.5mm(L / S 14)의 튜브에 적합
끼 피팅, PVDF, 소프트 튜브 NordsonMedical2-9964-01남성, ID 1.5 mm (L / S 14)의 튜브에 적합
끼 피팅, PVDF, 소프트 튜브 용Nordson Medical2-9965-03암, ID 3mm(L/S 16)의 튜브에 적합
끼 피팅, PVDF, 소프트 튜브용Nordson Medical2-9964-03남성, ID 3mm(L/S 16)의 튜브에 적합자
기 교반 바일반
Masterflex L/S 원격 I/O 및 벤치탑 컨트롤러가 있는 디지털 정밀 모듈식 드라이브Cole-Parmer07557-00
Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S Pricision 펌프 튜빙, 백금 경화 실리콘, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 및 마이크로; m, 폴리에테르설폰, 33 mm, 감마선 멸균밀리포SLGPR33RS
파이렉스 250 mL 잔디 병, GL-45 스크류 캡Corning1395-250
GL45 오픈 탑 PBT 스크류 캡용 실리콘 격막Corning1395-455S
실리콘 라이트 스토퍼IMG07763-18상경: 87 mm, 하경: 75 mm
멸균 주사기, 10 mL, 50 mL일반
마우스 수술(심폐 차단의 분리 | 폐 이식)
10-0 나일론 타이Kono SeisakushoN/A
10-0 실크 타이Kono SeisakushoN/A
4-0 실크 타이Kono SeisakushoN/A
동맥 클램프, 45mm 곡선, 홈이 있는Natsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV 카테터 24GABD381512또는 동등한 24G i.v. 카테터
불독 혈관 겸자 45mm 곡선나츠메 세이작쇼M2
부토르파놀 타르타르산염 메이지 세이카 제약N/A
세파졸린 나트륨오츠카 제약N/A
Dumont 집게#5/45Fine Science Tools1251-35
Fine vannas style spring scissorsFine Science Tools15403-0845° 팁, 0.01 x 0.06 mm
Gemini 소작 키트Harvard ApparatusRS-300
Halsted-Mosquito 클램프 곡선 팁, 125mmBioresearch 센터16181670
Hegar 바늘 홀더, 150mmB Braun/AesculapBM065R
헤파린 용액Mochida SeiyakuN/A
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoN/A
Micro 겸자 스트레이트B Braun/AesculapBD33R
Midazolam산도스N/A
마우스 인공호흡기하버드 장치모델 687™
생리 식염수, 임상 등급Otsuka PharmaceuticalN/A
페트리 접시, 60 x 15 mmBD351007
Safelet Cath PU 20 게이지 폴리우레탄 카테터Nipro09-031
사카키 스테인리스 가위 곡선 14 cmBioresearch 센터64152034
메스 홀더Bioresearch center16101040
소동물 후퇴 시스템Fine Science Tools18200-20
예비 칼날 메스 #11Muranaka Medical Instruments567-001-03
스프링 가위, 15cmBioresearch centerPRI13-3736
실체 현미경Leica MicrosystemsM525유연한 팔 시스템을 갖춘 임상 등급 수술용 현미경이 바람직합니다.
스기타 티타늄 동맥류 클립 곡선 슬림 No.98미즈호 메디컬17-001-98
스기타 티타늄 클립 어플라이어 110mm미즈호 메디컬17-013-53
온도 조절 가능한 전기 워머제네릭
울트라 파인 면봉제네릭
혈관 및 기관지 커프
파인 사포일반
Venula 20 게이지 테프론 혈관 카테터탑1160
Venula 22 게이지 테프론 혈관 카테터탑1161
Venula 24 게이지 테프론 혈관 카테터탑1124
에 적합 코 미 미 미어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoff....

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