근종 및 자궁근종 생성을 위한 3차원 오가노이드 배양 및 가공 기술

Summary

이 프로토콜은 근종 및 자궁근종 조직에서 줄기세포의 3D 오가노이드 배양을 삽입하여 콜라겐 함유 하이드로겔을 수동으로 생성하는 기술을 설명합니다.

Abstract

자궁근종은 여성 자궁에서 가장 흔한 양성 단클론성 부인과 종양입니다. 이러한 병리학 연구에 사용되는 방법과 관련된 공통된 장애물을 극복하기 위해, 우리는 콜라겐 함유 하이드로겔을 임베딩 스캐폴드로 사용하여 근종과 자궁근종 줄기세포의 3차원 오가노이드 모델을 생성하는 전략을 고안하고자 했습니다. 구체적으로, 저부착형 V-하단 96웰 플레이트에서 콜라겐 함유 하이드로겔을 활용하였습니다. 이 방법은 정상 줄기세포와 자궁 근종 포함 근종에서 두 가지 줄기세포 유형의 3D 오가노이드를 콜라겐 함유 하이드로겔에 삽입하고 적절한 줄기세포 증식 배지에 오가노이드를 형성함으로써 개발할 수 있게 했습니다. 오르가노이드는 성공적으로 분화, 증식, 스스로 복잡한 구조로 조직되어 지속 가능한 시스템을 발전시켰습니다. 이 모델의 중요성은 병태생리와 병인기전을 이해하는 데 있으며, 자궁근종을 예방하거나 치료하기 위한 신약 시험에 있습니다.

Introduction

자궁근종, 또는 평조근종은 자궁에서 가장 흔한 양성 종양입니다. 이들은 생식기 여성의 상당수 영향을 미치며, 연구에 따르면 약 77%의 여성이 어느 시점에서 이를 경험한다고 합니다. 많은 여성이 증상 없이 근종을 가지고 있지만, 상당수의 25%는 비정상적인 자궁 출혈, 골반 통증, 불임과 같은 증상을 경험합니다^. 근종의 발달과 성장은 성호르몬, 성장 인자, 유전적 변화 및 기타 생물학적 기전 등 다양한 요인에 의해 영향을^{받습니다.}

병인기전을 연구하고 약물 효능을 검증하기 위해 시험관 내 및 동물 모델이 개발되었습니다. 2D 배양 세포는 평평한 표면에서 자라도록 강제되어 형태가 왜곡되고 3D 조직 환경에서의 행동과 비교해 행동이 달라집니다. 2D 배양의 주요 단점은 3D 배양에 비해 조직 내 자연 세포 환경을 제대로 표현하지 못해 살아있는 유기체에서 발생하는 복잡한 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 정확히 모방하지 못해 세포 행동과 자극 반응 연구 시 부정확한 결과를 초래할 수 있다는 점입니다^. 또....

Protocol

이 프로토콜은 시카고 대학교 민족 위원회에서 승인되었으며, 승인 번호는 IRB#20-1414였습니다. 시카고 대학교 조직은행에 따르면, 조직을 채취한 모든 대상자로부터 사전 동의가 이루어졌습니다.

1. 3D 오르가노이드 배양

1. ^앞서 설명한 것처럼 분리 및 정제된 근단세포 및 UF 줄기세포(SC)를 배양 및 유지합니다.
2. 액체 질소에서 SC를 얻어 해동시키세요. 배양 과정의 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다.
3. 부착 인자 단백질 5mL를 추가하여 미리 코팅된 플라스크를 준비합니다. 37°C에서 최소 4시간 배양하세요. 그 다음 과잉 부착 인자인 단백질을 버리세요.
4. Precoed 75 cm² 플라스크에서 10mL의 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)와 F12를 12% 태아 소 혈청(FBS)으로 배양합니다. 플라스크를 37°C 저산소 인큐베이터에서 산소 농도 2%로 배양하여 90% 합류점에 도달할 때까지 보관하세요. 이는 그림 2....

Results

파종 첫날부터 SCs는 스스로 집결하여 오가노이드를 형성하기 시작했습니다. 최적의 파종 밀도는 10,000 SC로, 정의된 배양 시스템에서 배양 시 일관되게 오가노이드를 형성하는 것으로 결정했습니다. 이 시스템은 콜라겐 함유 하이드로겔을 ECM 스태클로 사용하여 삽입된 줄기세포와 줄기세포 증식 배지를 7일간 초저 부착 96웰 플레이트(그림 2C-G)에서 사용했습니다. 이 환경에서 세포는 첫날부터 스스로 조직되어 오가노이드 구조로 진화합니다. 7일 동안 이 구조물들은 기하급수적으로 성장 했습니다(그림 2H). 추가로 α-SMA(녹색 상단)와 Sox-2(빨간색 ^하단)에 대해 면역염색이 시행되었습니다

Discussion

오가노이드는 축소된 기관과 유사한 3차원 구조로, 줄기세포나 조직 샘플에서 유래한 자가 조직화된 세포로 구성되어 있습니다^. 환자들의 조직 유래 줄기세포 오가노이드는 UF의 생리학과 질병을 정확히 재현하는 놀라운 능력 덕분에 생의학 연구와 임상 응용에 혁신을 가져올 잠재력을 지니고 있습니다^. 본 연구는 정상 및 UF 환자 모두에서 인간 세포에서 유래한 오가노이드 배양 시스템을 도입하여 이 간극을 메우려 합니다.

콜라겐 함유 하이드로겔을 다룰 때 핵심은 항상 얼음(4°C)에 보관하여 매질과 혼합될 때까지 보관하는 것입니다. 상온에서는 빠르게 젤로 굳어 세포 배양에 사용할 수 없게 되며; 이 단계는 콜라겐 함유 하이드로겔과 관련된 모든 프로토콜에서 가장 중요한 단계로 간주됩니다.

이 팀은.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-광자 공초점   현미경	라이카, 미국
아가로즈 1세	VWR 코퍼레이션, 미국	97062-248
아쿠라 96 구형 마이크로플레이트	인스페로	CS-09-004-03	낮은 부착 V-바닥판
Alexa Fluor 488 염소 안티마우스 IgG	라이프 테크놀로지스, 캘리포니아, 미국	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 염소 반토끼 IgG	라이프 테크놀로지스, 캘리포니아, 미국	(A11037)	(1:1000)
안티-아르 [RPT]	GeneTex, 대만	(GTX227700a)	(1:1000)
항알파 평활근 액틴 항체	미국 매사추세츠주 앱캠	(AB7817)	1 & 마이크로; g/mL
항콜라겐 III 항체	미국 매사추세츠주 앱캠	(AB7778)	(1:500)
항소산화소슘 항체(anti-SOX1)	미국 매사추세츠주 앱캠	AB242125	(1:500)
부착 인자	깁코, 미국	S-006-100
블로킹 버퍼	다코	X0909	5%  말 혈청 + 0.5%  트리톤 X-100  1X 에서; PBS
크라이오스탯	피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠	마이크옴 HM 550
DAPI (4′, 6-디아미디노-2-페닐린돌)	독일 서모 사이언티픽	62248	1 mg/mL
DNase I	열과학, 리투아니아	EN0521
둘벡코 수정된 독수리' s의 중간 DMEM 및/nbsp; F12	깁코, 미국	21041-025
태아 소 혈청	오메가 사이언티픽   월섬, 매사추세츠	NC0471611
마트리젤(콜라겐 함유 하이드로겔)	코닝, 코닝, 뉴욕	356237
MesenCult-ACF Plus 배지 (혈청 없는 증식 줄기세포 배지  )	스템셀 테크놀로지스, 밴쿠버, 캐나다	5446
OCT 컴파운드 (최적 절단 온도 컴파운드)	사쿠라, 미국	4583
올림푸스 BX41 현미경	올림푸스 아메리카, 센터 밸리, 펜실베이니아
난염액 프로테아제 억제제 용액	워딩턴 바이오케미컬 코퍼레이션, 미국	LK003182
파팽	워딩턴 바이오케미컬 코퍼레이션, 미국	LK003176	활성화 용액 (1.1 mM EDTA, 0.067 mM 머캅토에탄올, 5.5 mM L-시스테인 HCl)
PBS(인산염 완충 식염수)	깁코, 미국	70011	pH 7.4
PFA(파라포름알데히드) 4%	인비트로젠, 미국	FB002
쿠파트	뱅크헤드, P. 외   QuPath: 디지털 병리학 영상 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어.  과학 보고서   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	바이오이미징 분석을 위한 소프트웨어
타임랩스 현미경
조직 배양 플라스크	피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠	FB012937
트립신	깁코, 미국	A12859-01	칼슘 또는 마그네슘 없이 HBSS에서 0.25% 트립신과 0.1% EDTA를 섭취했으며;
벡타쉴드 안티페이드 마운팅 매체에 DAPI 보완	벡터 연구소, 캘리포니아, 미국	#  UX-93952-24	1  ng/mL