근종 및 자궁근종 생성을 위한 3차원 오가노이드 배양 및 가공 기술

Summary

이 프로토콜은 근종 및 자궁근종 조직에서 줄기세포의 3D 오가노이드 배양을 삽입하여 콜라겐 함유 하이드로겔을 수동으로 생성하는 기술을 설명합니다.

Abstract

자궁근종은 여성 자궁에서 가장 흔한 양성 단클론성 부인과 종양입니다. 이러한 병리학 연구에 사용되는 방법과 관련된 공통된 장애물을 극복하기 위해, 우리는 콜라겐 함유 하이드로겔을 임베딩 스캐폴드로 사용하여 근종과 자궁근종 줄기세포의 3차원 오가노이드 모델을 생성하는 전략을 고안하고자 했습니다. 구체적으로, 저부착형 V-하단 96웰 플레이트에서 콜라겐 함유 하이드로겔을 활용하였습니다. 이 방법은 정상 줄기세포와 자궁 근종 포함 근종에서 두 가지 줄기세포 유형의 3D 오가노이드를 콜라겐 함유 하이드로겔에 삽입하고 적절한 줄기세포 증식 배지에 오가노이드를 형성함으로써 개발할 수 있게 했습니다. 오르가노이드는 성공적으로 분화, 증식, 스스로 복잡한 구조로 조직되어 지속 가능한 시스템을 발전시켰습니다. 이 모델의 중요성은 병태생리와 병인기전을 이해하는 데 있으며, 자궁근종을 예방하거나 치료하기 위한 신약 시험에 있습니다.

Introduction

자궁근종, 또는 평조근종은 자궁에서 가장 흔한 양성 종양입니다. 이들은 생식기 여성의 상당수 영향을 미치며, 연구에 따르면 약 77%의 여성이 어느 시점에서 이를 경험한다고 합니다. 많은 여성이 증상 없이 근종을 가지고 있지만, 상당수의 25%는 비정상적인 자궁 출혈, 골반 통증, 불임과 같은 증상을 경험합니다^. 근종의 발달과 성장은 성호르몬, 성장 인자, 유전적 변화 및 기타 생물학적 기전 등 다양한 요인에 의해 영향을^{받습니다.}

병인기전을 연구하고 약물 효능을 검증하기 위해 시험관 내 및 동물 모델이 개발되었습니다. 2D 배양 세포는 평평한 표면에서 자라도록 강제되어 형태가 왜곡되고 3D 조직 환경에서의 행동과 비교해 행동이 달라집니다. 2D 배양의 주요 단점은 3D 배양에 비해 조직 내 자연 세포 환경을 제대로 표현하지 못해 살아있는 유기체에서 발생하는 복잡한 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 정확히 모방하지 못해 세포 행동과 자극 반응 연구 시 부정확한 결과를 초래할 수 있다는 점입니다^. 또한, UF와 근단세포는 2D 배양에서 호르몬 반응성을 빠르게 잃습니다^. 전반적으로 다양한 동물 모델들은 UF 병태생리에 관한 관련 정보를 제공^{했습니다.} 동물 모델과 비교할 때, 3D 오가노이드는 실험을 단순화하고, 실시간 영상과 호환되며,^{동물 모델에서는} 잘 표현되지 않는 인간 특이적 발달 및 질병 측면 연구를 가능하게 한다는 여러 장점을 제공합니다. 반면, 영장류와 같은 더 정교한 동물을 대상으로 한 실험은 윤리적으로 정당화하기 매우 어렵고, 비용도 높^다. 3D 오가노이드 모델은 일반적으로 2D 세포 배양보다 생 체 내 조직 구조를 더 가깝게 모방하며, 동물 모델보다 더 통제되고 효율적이며 비용 효율적입니다. 따라서 자연 세포 성장과 병든 조직의 복잡성을 정확히 재현하는 보다 효과적인 대체 모델을 개발하는 것이 필수적입니다.

우리는 콜라겐 함유 하이드로겔을 이용해 근종 및 자궁근종의 3D 배양 오가노이드를 수동 시술로 수행하는 절차를 설정하는 것을 목표로 했으며, 주요 장점과 한계를 강조했습니다.

Protocol

이 프로토콜은 시카고 대학교 민족 위원회에서 승인되었으며, 승인 번호는 IRB#20-1414였습니다. 시카고 대학교 조직은행에 따르면, 조직을 채취한 모든 대상자로부터 사전 동의가 이루어졌습니다.

1. 3D 오르가노이드 배양

1. ^앞서 설명한 것처럼 분리 및 정제된 근단세포 및 UF 줄기세포(SC)를 배양 및 유지합니다.
2. 액체 질소에서 SC를 얻어 해동시키세요. 배양 과정의 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다.
3. 부착 인자 단백질 5mL를 추가하여 미리 코팅된 플라스크를 준비합니다. 37°C에서 최소 4시간 배양하세요. 그 다음 과잉 부착 인자인 단백질을 버리세요.
4. Precoed 75 cm² 플라스크에서 10mL의 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)와 F12를 12% 태아 소 혈청(FBS)으로 배양합니다. 플라스크를 37°C 저산소 인큐베이터에서 산소 농도 2%로 배양하여 90% 합류점에 도달할 때까지 보관하세요. 이는 그림 2A에 나타난 것입니다.
   참고: 저산소증은 줄기세포 증식과 생존을 촉진하여 줄기세포 성장에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
5. 수합점에 도달하면 칼슘이나 마그네슘 없이 25% 트립신-0.1% EDTA 용액을 HBSS에서 분리합니다.
   1. 이를 위해 세포 배양지를 제거하세요. 세포를 1배 PBS로 세척하세요. 25 cm² 크기의 한 세포에 1mL의 트립신을 추가하고 2-3분간 배양합니다.
   2. 세포가 분리되기 시작하면 혈청이 섞인 배지를 넣어 트립신 반응을 멈추게 하세요. 세포 용액을 15mL 튜브에 흡입한 후 실온에서 500 x g 에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
   3. 조심스럽게 상정액을 버리고 펠릿은 그대로 두세요.
6. 이후 세포 펠릿을 1mL의 혈청 무첨가 줄기세포 증식 배지에 재현탁합니다. 부드럽게 피펫팅으로 뭉치는 것을 깨뜨리세요.
7. 혈액세포계를 이용해 세포 정량화를 수행하세요.
   1. 세포 현탁액 100 μL과 0.4% Trypan Blue 용액 10 μL을 혼합합니다.
   2. 혼합물을 잠시 보르고, 챔버 홈과 유리 커버슬립 사이의 혈구계 챔버에 10 μL 트라이판 블루셀 현탁액을 피펫으로 주입합니다( 그림 2B).
   3. 박스 1-4의 셀 수를 세고, 다음 방정식을 사용해 셀 수를 계산하세요:
      세포/mL = (총 세포 수/총 상자 수) x 희석 계수 x 10,000
      샘플 내 총 세포 = 세포/mL x 전체 샘플 부피
8. 약 10,000개의 세포에 2 μL 콜라겐 함유 하이드로겔과 98 μL 혈청 없는 줄기세포 증식 배지를 혼합하면, V 바텀 96웰 플레이트의 최종 부피가⁵번 웰당 100 μL입니다.
9. 세포 혼합물 100 μL을 저부착 V-bottom 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫 투여합니다. 실온에서 100 x g에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
10. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 5%_CO2 가 섞인 인큐베이터에 30분간 넣으세요.
11. 각 웰에 콜라겐 함유 하이드로겔이 없는 혈청 무첨가 줄기세포 증식 배지 100 μL 추가 부피를 추가하여 장기 성장에 필요한 영양분을 제공합니다.
12. 과도한 증발이 발생할 경우, 드물게 증발할 경우 각 웰에 10-20 μL의 혈청 무증식 줄기세포 배지를 첨가하여 배지 증발을 보상합니다.
13. 세포를 7일간 배양하여 오가노이드의 완전한 성장을 시킨다(그림 2C-H). 혈청 없는 줄기세포의 증식 배지를 주 2회 교체하는데(기존 배지를 부드럽게 흡인한 후 새 배지를 추가하여 SCs 유래 오가노이드 배양을 최대 21일까지 연장할 수 있도록 합니다).

2. 냉동 절면

1. 96웰 플레이트에서 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 채취합니다.
2. 냉동절부 시에는 인산염 완충 식염수(PBS; 1회)로 오가노이드를 2번 세척하세요. 오가노이드에 500 μL의 PBS를 첨가한 후 원심분리기로 상원액을 버립니다.
3. 오르가노이드를 4°C에서 4% 파라포름알데히드 500 μL 60분간 고정한 후 다시 1x PBS로 세척합니다.
4. 오가노이드를 2% 메틸렌 블루 100 μL에 재현탁하여 20분간 염색합니다. PBS 1배로 세척하고, 30% 자당 500μL 용액에 크라이오프로텍트를 하룻밤 동안 현탁해 세척하세요.
5. 다음 날, 원심분리로 자당 용액을 제거하세요. 오가노이드를 최적 절단 온도 화합물(OCT)에 박고 −80 °C에서 급속 냉동합니다.
6. OCT에 내장된 오르가노이드를 극저온 측정기를 사용해 절단하며, 최적의 절면 깊이는 10 μm이며, 즉시 슬라이드에 각 슬라이드당 한 조각씩 배치합니다.
7. 다음 방법에 따라 면역형광 염색이 완료될 때까지 슬라이드를 4°C에서 보존합니다.
8. 슬라이드를 100 μL 1x PBS로 3번 세척하세요. 그 다음 0.1% 트리톤 100 μL을 PBS에 1회 넣어 실온에서 15분간 첨가합니다.
9. 오가노이드를 5% BSA로 1x PBS에 60분간 차단하고, 희석(1:500)과 α-평활근 액틴(α-SMA)을 최종 농도인 1 μg/mL로 하룻밤 배양합니다.
10. 오가노이드를 100 μL 1x PBS 3회로 세척한 후, Alexa Fluor 표지된 형광 염료 2차 항체(1:1000)와 함께 어두운 곳에서 1시간 배양합니다.
11. 100 μL 1x PBS 2x로 세척한 후, DAPI(1 ng/mL)를 보충한 안티페이드 마운팅 배지에 마운트합니다.
12. 20배 배율의 형광 현미경으로 이미지를 획득하세요. 그림 3A 를 참고하여 이미지를 소프트웨어로 분석하여 생물영상 분석을 하세요.

3. 전체 장착 오가노이드 면역형광 염색

1. 배지에서 오가노이드를 제거(1.11단계) 마이크로 원심분리관에 넣고, 500 μL 1x PBS로 2회 세척합니다.
2. 4% PFA 500 μL로 실온에서 60분간 오가노이드를 고정합니다. 그 후 PFA를 버리고 500 μL PBS로 3회 세척합니다.
3. 고정된 오가노이드를 4°C에서 0.5mL의 블로킹 버퍼로 하룻밤 동안 투과시킵니다.
4. 다음 날, 차단 완충제를 제거하고, 희석된 콜라겐 III(COL3A1) 1차 항체(1:500)와 희석된 AHR(1:1000)을 추가하고, 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
5. 오가노이드를 500 μL 1x PBS로 3번 세척한 후, 2차 항체(염소 항-토끼 IgG 594, 염소-생쥐 항 IgG 488)와 함께 어두운 곳에서 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
6. 오가노이드를 500 μL 1x PBS로 3번 세척한 후, 5 μg/mL의 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)과 1x PBS(샘플당 300-500 μL)를 실온에서 20분간 배양합니다.
7. 오가노이드를 500 μL 1x PBS로 세 번 세척한 후 공초점 현미경으로 촬영합니다(그림 3B).

4. 오르가노이드 해리

1. 100mg의 파팽을 필터 멸균 활성화액에 250 U/mL 스톡 농도로 재구성하고, 37 °C에서 30분간 배양하여 효소를 활성화시킵니다
   참고: 최대 2주간 2 - 8 °C에서 보관할 수 있습니다.
2. 사용 직전, 30 U/mL 파팽과 125 U/mL DNase I를 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)에 넣어 해리 용액을 준비합니다.
3. 오가노이드(1.11단계)를 24웰 플레이트로 옮기고 500 μL의 해리 용액을 추가합니다.
4. 샘플을 37°C에서 30-60분간 궤도 셰이커에서 90rpm으로 설정하여 배양합니다.
5. 1mL 피펫터를 사용해 실온에서 간헐적으로 5-6배 분열하여 주로 단일 세포로 구성된 현탁액을 얻습니다.
6. 세포 현탁액을 프로테아제 억제제 용액이 든 15mL 원심분리관(10 mg/mL 1mL)에 넣고 300 x g 에서 5분간 원심분리하여 세포를 먹이고 상원액을 버립니다.
7. 셀을 적절한 버퍼에 재현탁하면, 결과적으로 단일 셀 현탁액이 그림 2I에 나타난다.

Results

파종 첫날부터 SCs는 스스로 집결하여 오가노이드를 형성하기 시작했습니다. 최적의 파종 밀도는 10,000 SC로, 정의된 배양 시스템에서 배양 시 일관되게 오가노이드를 형성하는 것으로 결정했습니다. 이 시스템은 콜라겐 함유 하이드로겔을 ECM 스태클로 사용하여 삽입된 줄기세포와 줄기세포 증식 배지를 7일간 초저 부착 96웰 플레이트(그림 2C-G)에서 사용했습니다. 이 환경에서 세포는 첫날부터 스스로 조직되어 오가노이드 구조로 진화합니다. 7일 동안 이 구조물들은 기하급수적으로 성장 했습니다(그림 2H). 추가로 α-SMA(녹색 상단)와 Sox-2(빨간색 ^하단)에 대해 면역염색이 시행되었습니다

Discussion

오가노이드는 축소된 기관과 유사한 3차원 구조로, 줄기세포나 조직 샘플에서 유래한 자가 조직화된 세포로 구성되어 있습니다^. 환자들의 조직 유래 줄기세포 오가노이드는 UF의 생리학과 질병을 정확히 재현하는 놀라운 능력 덕분에 생의학 연구와 임상 응용에 혁신을 가져올 잠재력을 지니고 있습니다^. 본 연구는 정상 및 UF 환자 모두에서 인간 세포에서 유래한 오가노이드 배양 시스템을 도입하여 이 간극을 메우려 합니다.

콜라겐 함유 하이드로겔을 다룰 때 핵심은 항상 얼음(4°C)에 보관하여 매질과 혼합될 때까지 보관하는 것입니다. 상온에서는 빠르게 젤로 굳어 세포 배양에 사용할 수 없게 되며; 이 단계는 콜라겐 함유 하이드로겔과 관련된 모든 프로토콜에서 가장 중요한 단계로 간주됩니다.

이 팀은...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-광자 공초점   현미경	라이카, 미국
아가로즈 1세	VWR 코퍼레이션, 미국	97062-248
아쿠라 96 구형 마이크로플레이트	인스페로	CS-09-004-03	낮은 부착 V-바닥판
Alexa Fluor 488 염소 안티마우스 IgG	라이프 테크놀로지스, 캘리포니아, 미국	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 염소 반토끼 IgG	라이프 테크놀로지스, 캘리포니아, 미국	(A11037)	(1:1000)
안티-아르 [RPT]	GeneTex, 대만	(GTX227700a)	(1:1000)
항알파 평활근 액틴 항체	미국 매사추세츠주 앱캠	(AB7817)	1 & 마이크로; g/mL
항콜라겐 III 항체	미국 매사추세츠주 앱캠	(AB7778)	(1:500)
항소산화소슘 항체(anti-SOX1)	미국 매사추세츠주 앱캠	AB242125	(1:500)
부착 인자	깁코, 미국	S-006-100
블로킹 버퍼	다코	X0909	5%  말 혈청 + 0.5%  트리톤 X-100  1X 에서; PBS
크라이오스탯	피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠	마이크옴 HM 550
DAPI (4′, 6-디아미디노-2-페닐린돌)	독일 서모 사이언티픽	62248	1 mg/mL
DNase I	열과학, 리투아니아	EN0521
둘벡코 수정된 독수리' s의 중간 DMEM 및/nbsp; F12	깁코, 미국	21041-025
태아 소 혈청	오메가 사이언티픽   월섬, 매사추세츠	NC0471611
마트리젤(콜라겐 함유 하이드로겔)	코닝, 코닝, 뉴욕	356237
MesenCult-ACF Plus 배지 (혈청 없는 증식 줄기세포 배지  )	스템셀 테크놀로지스, 밴쿠버, 캐나다	5446
OCT 컴파운드 (최적 절단 온도 컴파운드)	사쿠라, 미국	4583
올림푸스 BX41 현미경	올림푸스 아메리카, 센터 밸리, 펜실베이니아
난염액 프로테아제 억제제 용액	워딩턴 바이오케미컬 코퍼레이션, 미국	LK003182
파팽	워딩턴 바이오케미컬 코퍼레이션, 미국	LK003176	활성화 용액 (1.1 mM EDTA, 0.067 mM 머캅토에탄올, 5.5 mM L-시스테인 HCl)
PBS(인산염 완충 식염수)	깁코, 미국	70011	pH 7.4
PFA(파라포름알데히드) 4%	인비트로젠, 미국	FB002
쿠파트	뱅크헤드, P. 외   QuPath: 디지털 병리학 영상 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어.  과학 보고서   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	바이오이미징 분석을 위한 소프트웨어
타임랩스 현미경
조직 배양 플라스크	피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠	FB012937
트립신	깁코, 미국	A12859-01	칼슘 또는 마그네슘 없이 HBSS에서 0.25% 트립신과 0.1% EDTA를 섭취했으며;
벡타쉴드 안티페이드 마운팅 매체에 DAPI 보완	벡터 연구소, 캘리포니아, 미국	#  UX-93952-24	1  ng/mL