식염수 비강 세척액은 개의 비강 면역 미세환경을 샘플링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 상대적으로 비침습적이고 코 조직을 파괴하지 않기 때문에 연속적으로 수행할 수 있습니다. 비강 세척 기법으로 채취한 세포와 단백질은 다양한 실험실 분석을 위해 처리할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
개 비강의 국소 면역 미세환경을 평가하는 것은 정상 조직 건강 및 질병 상태, 특히 국소 염증과 관련된 상태를 조사하는 데 중요할 수 있습니다. 우리는 연속 비강 세척을 통해 개의 국소 비강 면역 미세환경을 평가하는 기술을 최적화했습니다. 간단히 말해서, 개가 마취 상태에 있고 흉골 누운 상태로 배치된 상태에서 예열된 멸균 식염수를 유연하고 부드러운 고무 카테터를 사용하여 영향을 받은 콧구멍으로 씻어냅니다. 유체 역류는 원뿔형 튜브로 수집되고 이 과정이 반복됩니다. 제거된 세포와 단백질을 포함하는 액체를 모으고, 풀링된 비강 세척 샘플을 세포 여과기를 통해 여과하여 큰 파편과 점액을 제거합니다. 시료를 원심분리하고 세포 펠릿을 분리하여 분석합니다. 샘플이 처리되면 비강 세척 후에 발생할 수 있는 분석에는 유세포 분석, 벌크 또는 단일 세포 RNA 염기서열분석을 통한 세포의 전사체 분석 및/또는 세척액에 존재하는 사이토카인의 정량화가 포함됩니다.
서론
개는 일생 동안 일상적으로 염증성 코 질환을 앓습니다. 반려견의 급성 또는 만성 비염의 근본 원인은 감염성(바이러스성: 인플루엔자, 파라인플루엔자, 헤르페스 바이러스, 박테리아[예: 보르데텔라, 마이코플라스마], 진균성[예: 아스페르길루스증, 크립토코코시스], 기생충[예: 코 진드기])에서 종양성(예: 부비강 악성 종양, 가장 일반적으로 암종 또는 육종 조직형), 이물질(예: 이물질, 탈구된 치아의 비강 내 이동), 치주 질환에 이르기까지 다양합니다. 뿐만 아니라 개 특발성 염증성 비염 1,2,3,4,5,6,7.
신체 검사 외에도 비강 염증이 있는 개의 부비강 상태를 평가하기 위해 다양한 접근 방식이 사용됩니다. 영상 절차에는 방사선 사진(치과, 두개골), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 자기 공명 영상(MRI)이 포함될 수 있습니다. 비강을 촬영하는 또 다른 방법은 코내시경 검사입니다. 조직 샘플링에는 비강 면봉, 브러시 샘플 또는 조직 생검을 획득하는 작업이 포함될 수 있으며, 이를 통해 세포학적 및/또는 조직학적 평가를 수행할 수 있을 뿐만 아니라 진균 또는 박테리아 배양을 위한 샘플 제출도 수행할 수 있습니다. 이러한 샘플은 "블라인드" 샘플링에서 코 내시경 또는 고급 이미징을 통한 이미지 유도에 이르기까지 다양한 접근 방식으로 얻을 수 있으며, 비인두에서 콧구멍, 비인두, 트레피네이션, 코 절개술 또는 부비동 절개술의 외과적 접근 방식에 이르기까지 다양한 접근 방식으로 얻을 수 있습니다.
멸균 식염수를 비강에 투여하는 비강 세척은 진단 및 치료 목적으로 개의 비강을 샘플링하는 데에도 사용되었습니다. 비강 종양에 사용된 비강 세척 기법의 대안적 버전은 비강 수압 작용(forceful nasal flushing)이라고 불리며, 이는 진단 평가를 위해 큰 종양 샘플을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 비강암과 관련된 임상 징후의 개선을 위한 치료 완화를 제공할 수 있습니다8.
우리는 여기에서 비강 면역 미세환경의 세포와 단백질을 수집하고 분석하기 위한 의도된 목적을 위한 또 다른 버전의 비강 세척 기술을 제시합니다. 부드럽고 상대적으로 비침습적인 접근 방식을 통해 이 비강 세척 기술을 연속 비강 면역 미세환경 샘플링에 최적화했습니다. 염증이 없는 비강, 활동성 헤르페스 바이러스 감염 및 부비강 종양이 있는 개를 대상으로 한 시험에서 우리는 다운스트림 응용 프로그램을 위한 샘플 수집 및 처리를 위한 비강 세척의 유용성을 입증했습니다 9,10.
이 원고에서는 개의 비강 면역 미세환경의 연속 샘플링을 위한 식염수 비강 세척 기술에 대해 설명합니다. 당사는 조직의 파괴를 최소화하면서 비강 세척 샘플을 효과적으로 획득하고 다양한 분석을 위해 샘플을 처리하기 위한 프로토콜 세부 정보를 제공합니다.
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프로토콜
이 비강 세척 절차는 Colorado State University Institutional Animal Care and Use Committee 및 Clinical Review Board(IACUC #2425)의 승인을 받았습니다. 비강 세척 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 비강 세척 준비
- 비강 세척 시술 전날, 20mL 주사기 5개에 멸균 생리식염수(0.9% 염화나트륨 용액)를 채우고 뚜껑으로 닫습니다. 주사기를 37 °C로설정된 인큐베이터에 넣어 밤새 데울 수 있도록 합니다.
2. 코 세척을 위해 개 배치
- 시술을 위해 개를 마취한 다음(예: IV 카테터를 통해 덱스메데토미딘(1-4 μg/kg) 및 부토르파놀(0.2-0.5 mg/kg)을 정맥 주사한 다음 삽관 효과를 위해 적정된 프로포폴 IV(2-5 mg/kg)를 투여합니다. 효과를 보려면 1-2% 흡입제 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.) 마취 깊이를 확인하려면 손바닥 반응과 턱 긴장도를 확인합니다.
- 시술 중 건조를 방지하기 위해 눈을 윤활하십시오.
- 절차 전반에 걸쳐 심장 원격 측정, 혈압, 카프노그래피 및 맥박 산소 측정 값을 모니터링합니다.
- 마취된 개를 흉골 누운 상태로 놓습니다. 최적의 비강 세척 샘플 수집을 위해 개의 머리가 치료 테이블 가장자리에서 아래쪽 각도로 자연스럽고 편안하게 각도가 잡히도록 개의 머리를 놓습니다.
- 기도가 단단히 밀봉되도록 기관내관의 커프를 팽창시킵니다.
3. 비강 세척 시행
- 따뜻한 식염수가 들어 있는 미리 채워진 20mL 주사기 중 하나에 꼭 맞도록 바닥에서 8 FR 멸균 빨간색 고무 카테터를 자릅니다. 멸균된 빨간색 고무 카테터를 측정하여 카테터의 원위 끝이 콧구멍을 통해 삽입될 때 비강 중간쯤까지 확장되도록 합니다. 코 종양을 샘플링하는 경우, 영상 또는 코 투시경 유도를 사용하여 코종양의 상부 측면의 위치를 추정하고 빨간색 고무 카테터의 길이를 측정하여 팁이 종양의 상부 측면까지 확장되도록 합니다.
- 그런 다음 정의된 비강 내 카테터 길이에 맞게 팁의 카테터를 절단하여 팁이 비강에 삽입될 때 적절한 위치에 안착하도록 합니다. 그러나 콧구멍 바깥쪽으로 뻗어 있는 카테터 기저부에 추가 길이를 허용하십시오(주사기 고정 지점에서 콧구멍 입구까지의 카테터 길이, 약 3-5cm). 콧구멍 입구에 해당하는 시작점을 나타내기 위해 카테터의 기저부 끝에 영구 마커가 있는 표시를 적용합니다. 미리 결정된 카테터 길이는 비강 내까지 확장되며 카테터 팁은 비강 내 원하는 위치에 배치됩니다.
- 비강 세척 절차를 수행하려면 두 명의 참여가 필요합니다. 한 사람(사람 A)은 카테터를 비강에 공급하고 세척을 투여하고, 다른 사람(사람 B)은 코에서 나오는 샘플을 채취하도록 합니다.
- 사람 A가 개의 머리 앞과 아래에 위치하도록 합니다. 장갑을 낀 손으로 사람 A가 빨간색 고무 카테터의 끝을 비강의 내측으로 부드럽게 안내하고 카테터의 표시가 콧구멍의 바깥쪽과 일직선이 될 때까지 전진시킵니다. 이 과정에서 카테터가 가열된 멸균 식염수가 들어 있는 주사기에 연결되어 있는지 확인합니다. 사람 B가 카테터를 삽입한 상태에서 콧구멍 아래에 50mL 원뿔형 튜브를 잡도록 합니다.
- 사람 A는 반대쪽 콧구멍을 부드럽게 막고 느리고 일정한 압력 또는 펄스 주입으로 식염수를 비강에 주입하기 시작합니다. 개의 머리가 아래쪽 각도로 위치하면 사람 B는 중력을 통해 비강에서 배출되는 액체를 50mL 원뿔형 튜브로 모읍니다.
- 총 5개의 20mL 식염수 세척에 대해 이 비강 세척 기술을 반복하고 필요에 따라 원뿔형 튜브를 교체하여 풀링된 샘플을 수집합니다. 절차 완료 후 주입된 식염수의 양과 관련하여 수집된 비강 세척액의 총량을 기록합니다.
- 완료되면 덱스메데토미딘으로 마취한 경우 덱스메데토미딘에 사용된 것과 동일한 양의 아티파메졸을 근육 주사로 투여하고 개가 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 조심해야 하며, 개를 흉골 누운 상태로 유지하고 머리를 아래로 향하게 하여 코 세척에서 잔류 식염수를 추가로 배출할 수 있도록 합니다.
4. 비강 세척 샘플 처리
- 원뿔형 튜브 안에 들어있는 비강 세척 샘플을 부드럽게 와류 및/또는 피펫팅하여 파편과 세포 덩어리를 분해합니다. 풀링된 비강 세척 샘플을 70μm 세포 변형 필터에 통과시켜 큰 파편과 점액을 제거합니다. 샘플을 300 × g 에서 5-10분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.
- 피펫으로 흡인을 통해 상층액을 수집하고 관심 단백질을 분석하기 위해 깨끗한 튜브에 보관합니다.
- 세포 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 관심 세포 분석을 위해 선호되는 용액에 재현탁합니다.
- 샘플에서 적혈구를 제거하려면, 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해를 수행하여 비강 세척11,12에서 핵세포를 채취한다.
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결과
이 비강 세척 방법을 사용하면 수집된 샘플이 약간 흐린 것처럼 보이며 튜브를 소용돌이칠 때 세포 파편과 점액 조각이 보일 수 있습니다. 세척 절차가 실수로 출혈을 유발하고 샘플이 붉게 물들면 샘플이 말초 혈액에 오염된 것으로 간주됩니다. 주입된 식염수의 일부는 시술 중에 손실되지만, 주입된 식염수가 콧구멍에서 튜브로 역류하지 않으면 음의 세척이 고려됩니다. 잠재적인 원인은 헤드가 효과적인 역류를 허용할 만큼 충분히 아래쪽으로 기울어져 있지 않거나, 샘플이 반대쪽 콧구멍을 통해 꼬리 또는 옆으로 배출되었거나, 빨간색 고무 카테터가 주사기에 단단히 고정되지 않아 식염수가 연결 지점에서 바깥쪽으로 누출된 것 등일 수 있습니다.
비강암에 걸린 개로부터 비강 세척 샘플을 성공적으로 채취하면 1 × 10 6-200 × 106 범위의 핵 세포 수가 예상되며 75-96%의 살아있는 세포가 있습니다. 또는, 건강하고 염증이 없는 비강을 가진 개로부터 비강 ...
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토론
비강 세척 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 코 세척 절차를 받는 개와 관련하여, 개는 카테터 배치 또는 세척 투여에 반응하지 않도록 충분히 깊은 마취 평면 내에 있어야 합니다. 마취 상태에서 반응하는 경우, 이는 세척 샘플 수집의 품질과 양을 손상시킬 수 있을 뿐만 아니라 비강 내 카테터의 국소 외상 또는 세척액을 흡인하는 개로 인한 급성 비강 조직 손상의 위험을 잠재적으로 증가시킬 수 있습니다.
개의 머리를 배치하는 것도 최적의 비강 세척 샘플 수집을 위해 중요합니다. 머리의 아래쪽 각도가 주입된 식염수의 중력에 따른 역류에 충분하지 않은 경우, 비강 세척액이 꼬리로 흐를 수 있으며 샘플이 비인두를 통해 손실될 수 있습니다. 또한 비강 세척 시술 중에는 A와 B인 사이의 명확한 의사 소통이 중요합니다. 사람 A가 물을 내리는 동안 콧구멍에서 액체가 배출되기 때문에 수집 튜브 배치를 위해 사람 B가 빠른 ...
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
본 명세서에 기술된 송곳니 비강 세척 기법은 K01 OD03109, CCTSI Colorado Pilot Grant Award, CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program 및 CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program의 지원을 받는 프로젝트를 통해 최적화되었습니다. 그림 1 은 BioRender.com 를 사용하여 만든 것입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 튜브 | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 & micro; L 피펫 | VWR | 89079-974 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL 주사기 | VWR | BD302830 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | VWR | 89039-656 | |
| 70 & micro; m 세포 스트레이너 | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR 멸균 빨간색 고무 카테터 | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK 용해 완충기 | Gibco | A1049201 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter | 366816 | |
| 생리 식염수(0.9%) | Vetivex | 17033-492-01 | |
| Vortex | VWR | 10153-838 |
참고문헌
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- Mortier, J., Blackwood, L. Treatment of nasal tumours in dogs: A review. J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).
- Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases. J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).
- Windsor, R. C., Johnson, L. R. Canine chronic inflammatory rhinitis. Clin Tech Small Anim Practice. 21 (2), 76-81 (2006).
- Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. Pathogenesis and treatment of canine rhinitis. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).
- Hazuchova, K., Neiger, R., Stengel, C. Topical treatment of mycotic rhinitis-rhinosinusitis in dogs with meticulous debridement and 1% clotrimazole cream: 64 cases (2007-2014). JAVMA. 250 (3), 309-315 (2017).
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- Wheat, W., et al. Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs. BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).
- Darragh, L. B., et al. Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors. Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).
- Pinard, C. J., et al. Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients. Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).
- Choi, J. W., et al. Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function. PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).
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