방법 논문

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

DOI:

10.3791/67584

⸱

2025년 6월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

멀티플렉스 면역형광(mIF)은 단일 섹션 내에서 여러 단백질 바이오마커를 시각화하여 조직 샘플을 상세하고 공간적으로 분해된 분석이 가능한 고급 기술입니다. 그러나 대부분의 mIF 기술은 멀티플렉싱 시 감도와 처리량 간에 상당한 절충에 직면해 있으며, 이는 여러 조직 절편에 걸쳐 저농도 바이오마커를 강력하게 검출하는 데 중요한 한계를 제시합니다. mIF에 대한 새로운 접근법은 항체에 연결된 고유한 DNA 바코드를 사용하며, 이는 병렬 단일 분자 증폭 메커니즘을 통해 증폭됩니다. 이 방법은 높은 multiplexing 기능과 고처리량 전체 슬라이드 이미징을 제공하면서 임상 등급 면역조직화학(IHC)과 매우 유사한 염색 품질을 달성합니다. 이 분석은 조직에서 DNA 바코드 항체 칵테일을 증폭한 다음 순차적인 검출 단계를 거쳐 주기당 4개의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 시각화하는 것을 포함합니다. 따라서 이 프로세스를 통해 조직 샘플당 8개 이상의 바이오마커를 검출할 수 있습니다. 이 방법의 주요 단계에는 자동화된 조직 준비, DNA 바코드와 결합된 1차 항체 적용, 신호 증폭 및 검출, 이미징 및 신호 제거의 반복 주기가 포함됩니다. 이미지 획득 후에는 AI 강화 공간 이미지 데이터 사이언스 플랫폼을 사용한 이미지 등록 및 단일 세포 분석이 이어집니다. 이 연구를 위해 이 프로토콜은 편도선, 흑색종, 결장 및 림프절 코어를 포함한 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 다중 조직 미세 어레이(TMA)에 삼중으로 적용되었습니다. 고급 mIF 기술은 종양 반응, 종양 미세환경 및 면역 환경에 대한 더 많은 통찰력을 제공합니다. 민감도, 다중화 기능 및 이미징 처리량 간의 내재적 상충 관계를 극복함으로써 연구자들은 이제 치료 반응의 까다로운 분자 서명과 바이오마커의 이질성을 이해하는 것을 목표로 할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고도의 다중화 면역형광(mIF)은 단일 조직 섹션 내에서 여러 단백질 바이오마커를 동시에 시각화할 수 있도록 하여 조직 분석 분야에 혁명을 일으키고 있는 고급 기술입니다 1,2. 이 기능은 타의 추종을 불허하는 수준의 세부 정보와 공간 해상도를 제공하며, 이는 여러 공간 규모에 걸쳐 조직 미세환경 내에서 복잡한 형태를 가진 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 종종 중요합니다3. 이 기술은 종양 바이오마커, 단백질 약물 표적, 국소 면역 및 체크포인트 상태, 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용, 심지어 조직 내 약물 대사와 관련된 세포 내 공동 국소화 패턴을 공동 국소화하는 데 사용할 수 있는 종양학 연구에서 특히 가치가 있습니다 4,5,6.

잠재력에도 불구하고 대부분의 mIF 기술은 특히 다중화 기능과 감도 및 처리량의 균형을 맞추는 데 있어 여전히 중요한 문제에 직면해 있습니다. 이러한 제한은 HER2 및 PD-L1과 같이 매우 낮은 발현을 보일 수 있는 임상 바이오마커의 검출에 특히 중요합니다 7,8,9. 그 이유를 확인하려면 mIF의 다른 방식을 이해하는 것이 중요합니다. 이러한 전통적인 방법은 보다 정교한 mIF 플랫폼을 위한 길을 열었지만 고유한 장점과 한계가 있습니다.

직접 면역형광(DIF)은 형광단 또는 형광단을 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 직접 접합된 항체를 사용합니다10. 이 방법은 멀티플렉스에 간단하지만 감도가 낮고 조직 배경 또는 염색 아티팩트의 신호를 분해하는 데 어려움이 있습니다.

간접 면역형광(IIF)은 1차 항체에 결합하는 2차 항체를 사용합니다. 이는 1차 기반 DIF에 비해 신호가 증가했습니다. 개선된 플로우 셀(flow cell) 설계와 결합하면 순차 IIF는 한 번의 분석에서 최대 40개의 바이오마커를 검출할 수 있습니다 2,11. 그러나 이러한 기술은 면역조직화학(IHC) 기술에서 볼 수 있는 것과 같은 신호 증폭을 위한 효소 기반 전략에 비해 민감도가 상대적으로 부족합니다.

효소 촉매 기반 면역형광은 발색(DAB) 또는 형광 염료 증착(예: 티라미드 신호 증폭(TSA))을 위해 양고추냉이 과산화효소(HRP)를 사용하는 IHC 방법에서 가장 자주 볼 수 있습니다. 이러한 분석은 동일한 촉매 효소를 기반으로 하기 때문에 검출 감도가 유사하여 다중 스펙트럼 TSA 기반 mIF 분석이 임상 응용 분야에 적합합니다 2,12. DNA 기반 신호 증폭의 장점은 우수한 신호 증폭 및 모듈성을 유지하면서 높은 수준의 다중화가 가능하다는 것입니다. 반면, HRP 기반 방법은 모듈화가 덜 되고 최적화가 어렵기 때문에 추가 패널 개발 및 테스트 주기가 필요합니다.

DNA 바코드 항체 면역형광
여기에서 시연된 mIF 분석은 DNA 중합효소를 사용하여 DNA 바코드 항체를 동시에 증폭한 다음, 이미징 라운드당 4개의 형광 올리고뉴클레오티드를 사용하여 리포터 프로브 염색 및 탈색 주기를 수행합니다(그림 1).

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그림 1: 멀티플렉스 면역형광 분석 프로토콜의 그래픽 그림. 바코드 접합 항체는 한 단계로 추가되며 바코드는 동시에 증폭됩니다. 각 사이클에 4개의 형광 프로브 그룹이 추가되어 4개의 마커를 한 번에 시각화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 single-round 항체 추가 및 single-step 증폭은 분석 프로토콜을 크게 단순화합니다. 이 공정은 자동화된 고처리량 염색 및 스캐닝 시스템을 통해 촉진되며, 이는 임상 연구에 활용된 많은 수의 샘플에 걸쳐 슬라이드 간 및 배치 간 모두에서 재현 가능한 결과를 보장합니다13.

이 기술의 주요 장점 중 하나는 광범위한 다중화를 허용하면서 높은 감도를 유지할 수 있다는 것입니다2. 또한 워크플로우는 이미징 처리량이 높게 유지되도록 보장하여 임상 연구를 위한 고도로 멀티플렉싱된 mIF 기술(예: > 8개의 바이오마커)의 주요 한계 중 하나를 해결합니다. 이는 환자 전반에 걸쳐 저농도 약물 표적(예: 낮은 HER2)의 미묘한 차이가 치료 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있는 임상 연구에서 특히 중요합니다.

이러한 주요 속성 외에도 이 분석은 패널 구성 가능성, 고처리량 전체 슬라이드 이미징 기능, 대식세포 및 수지상 세포와 관련된 세포 돌출부뿐만 아니라 세포 내 프로세스 및 구획을 조사하는 데 필요한 광학 해상도를 제공합니다. 여러 공간 규모에 걸쳐 복잡한 세포 표현형을 조사할 수 있는 능력은 질량 세포 분석(IMC) 기반 분석법과 광학 이미징의 중요한 이점입니다2.

이 작업에서는 오토스테인너와 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 8-plex mIF 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에는 CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 및 pan-Cytokeratin14의 8가지 1차 항체 패널이 포함됩니다. 이 마커 패널을 통해 종양 조직의 면역 프로파일링과 종양 또는 기질 환경에서 발견되는 세포를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 염색 및 프로브 교환 라운드에 자동 슬라이드 염색기를 사용하며 염색 및 이미징은 2일 이내에 완료할 수 있습니다. mIF 분석을 검증하고 결과 이미지를 분석하는 방법도 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험은 기관 인간 연구 윤리 위원회 지침을 따라야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 조직 절편은 외부 조직 제공자로부터 얻었습니다.

1. 조직 샘플 준비

  1. mIF 분석을 사용하여 염색할 FFPE 조직 블록을 선택합니다. FFPE 조직 슬라이드를 사용하는 경우 샘플의 두께가 3-5μm이고 양전하를 띤 유리 슬라이드에 장착되며 최종 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 주름이나 기타 찢어짐이 없는지 확인하십시오.
    참고: 최상의 결과를 얻으려면 2개월 이상 전에 절편화된 조직 샘플을 염색하지 마십시오. 또한 10년 이상 보관되었거나 시각적으로 건조해 보이는 블록은 피하십시오.
  2. FFPE 조직 블록으로 작업하는 경우 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 필요한 수의 조직 슬라이드를 절단하고 양전하를 띤 유리 슬라이드에 슬라이드를 장착합니다. 가장 일관된 결과를 얻으려면 모든 슬라이드를 동일한 방향으로 장착하십시오. 조직에 주름과 찢어짐이 없는지 확인하십시오.
  3. 샘플을 즉시 염색하지 않으려면 질소가 함유된 슬라이드 상자에 최대 2개월 동안 보관하십시오.

2. 초기 설정을 위한 보조 시약 및 1차 항체 등록

  1. autostainer 소프트웨어 내에서 화면 상단의 Reagent Set Up 탭으로 이동합니다. 추가를 클릭하여 새 시약을 추가합니다.
  2. 염색 및 교환 분석은 표 1에 있는 정보에 따라 9개의 시약 용기를 사용합니다. 예를 들어, 약어 이름 ISPWsh1과 함께 Wash Buffer라는 첫 번째 시약의 경우 다음 단계를 따르십시오. 유형을 Ancillary로 선택하고 *BWash 및 DI가 모두 Compatible Bulks(호환 가능한 벌크) 아래에 나열되어 있는지 확인합니다. 저장하기 전에 선호 상자를 선택합니다.
  3. 표 1에 있는 이름과 약어를 사용하여 나머지 보조 시약에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
    1. 증폭 용액 시약(ULTAmp1)은 본드 워시와 호환되지 않습니다. 이를 위한 시약 설정 창에서 *BWash 를 선택하고 << 버튼을 클릭하여 이 시약을 호환 가능한 시약 목록에서 사용 가능한 시약 섹션으로 이동하십시오. 증폭 용액 시약과 호환되는 시약인 Bond Wash를 제거하지 않으면 분석의 염색 성능이 크게 저하될 수 있습니다.
  4. 모든 시약 용기가 등록되면 초기 실행을 시작하기 전에 Research Detection Kit를 생성합니다. 검출 키트에는 30mL 적정 용기 1개가 필요합니다.
  5. 검출 키트에 30mL 적정 용기를 추가합니다. 두 개가 분리되는 것을 방지하려면 적정 용기를 막대에 테이프로 붙입니다.
  6. 감지 키트의 왼쪽에 있는 바코드를 스캔합니다. 다음 팝업 창에서 감지 키트의 이름을 지정합니다(예: InSituPlex Kit). 만료 날짜를 등록일로부터 10년으로 설정합니다.
    참고: 여기에 설정된 만료 날짜는 시약에 표시된 날짜가 아니라 적정 용기에 있는 시약의 만료 날짜입니다. 만료 날짜를 훨씬 더 늦게 설정하면 키트가 불필요하게 만료되지 않습니다.
  7. 키트의 첫 번째 시약 위치의 경우 드롭다운 메뉴에서 Wash Buffer 를 시약으로 선택합니다.
  8. 이 시약 위치에 대한 바코드 필드를 클릭하고 테이프로 감긴 30mL 적정 용기의 바코드를 스캔하여 이 용기를 세척 버퍼로 등록하고 시약 용기를 검출 막대에 연결합니다.
  9. 적정 용기가 키트에 연결되면 추가 버튼을 클릭하여 저장하고 팝업 창을 닫습니다.
  10. 적정 용기에 30mL의 1x Bond Wash를 채우고 염색 실행 사이에 4°C의 냉장 보관합니다.

표 1: 설정을 위한 보조 시약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 초기 프로토콜 설정

  1. 모든 시약 용기가 성공적으로 등록되면 autostainer 소프트웨어 화면 상단의 Protocol Set up 탭으로 이동합니다.
  2. 화면 오른쪽 상단에 있는 로고 를 클릭하여 현재 실행 중인 소프트웨어 버전을 확인합니다. 결과 팝업은 소프트웨어 정보 제목 아래에 현재 설치된 소프트웨어 버전을 표시합니다.
  3. 소프트웨어가 버전 7.0 이상인 경우 염색 프로토콜의 템플릿이 사전 설치되어 있습니다. 화면 아래쪽에서 Preferred Status selection(기본 설정 상태) 선택이 All(모두)로 설정되어 있는지 확인합니다. 템플릿 프로토콜의 이름을 *ISP Staining Assay로 지정합니다. 이전 버전의 소프트웨어의 경우 프로토콜은 표 2에서 찾을 수 있습니다.
  4. *ISP Staining Assay를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 프로토콜을 복사합니다. 결과 팝업 창에서 프로토콜 Staining Assay 1의 이름을 약어(ISP_IHC1)로 바꿉니다.
  5. 선호하는 Detection system(탐지 시스템)에서 2.6단계의 초기 시약 설정 중에 생성된 시스템을 선택합니다.

표 2: 다중 면역형광 염색 프로토콜에 대한 프로토콜. *MARKER는 항체 용액에 해당하고 Wash Buffer는 BOND Wash 용액에 해당합니다. 다른 모든 보조 시약에는 해당 이름의 키트 구성 요소가 있습니다. 이 프로토콜은 소프트웨어 버전 7.0 이상, BXD 39 이상과 호환됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

4. 시약 설정

  1. 항체 콘주게이트, 증폭 효소, 교환 개시액 및 교환 중화제를 제외한 모든 키트 시약을 실온에서 해동합니다. 나머지 키트 구성 요소는 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  2. 아직 수행하지 않은 경우 2.3단계에서 정의된 각 시약에 대해 새 적정 용기를 등록합니다. 각각에 새로운 적정 인서트를 놓습니다.
  3. 2.6단계에서 등록한 Research Detection System을 사용하여 관련 세척 버퍼 용기에 1x Bond 세척 용액이 30mL로 채워졌는지 확인합니다. 각 시약에 대한 적정 용기를 시스템에 배치합니다.
  4. 해당 용기에 Ab 희석제를 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (150 μL x 슬라이드 수)이며 제공된 항체 희석제로 구성됩니다. 해동 후 혼합할 버퍼를 소용돌이.
  5. 항체 염색액 1 용기에 항체 염색액을 준비한다. 제공된 항체 희석제에 1:100 희석으로 모든 항체를 추가합니다. 필요한 부피는 350 + (150 μL x 슬라이드 수)입니다. 항체 스톡 또는 완전한 항체 염색 용액을 와류로 사용하지 말고 피펫팅으로만 혼합하십시오.
  6. 사전 증폭 혼합물 용기에서 사전 증폭 혼합물을 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (150 μL x 슬라이드 수)이며 제공된 바와 같이 사전 증폭 혼합물로 구성됩니다. 해동 후이 용액을 소용돌이.
  7. 증폭 용액 용기에 증폭 용액을 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (150 μL x 슬라이드 수)이며, 증폭 완충액에 1:10으로 희석된 증폭 효소로 구성되어 있습니다. 증폭 효소 또는 완성된 증폭 용액을 와류로 가열하지 말고 피펫팅으로만 혼합하십시오.
  8. 핵 대조염색 용기에 핵 대조염색을 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (300 μL x 슬라이드 수)이며 제공된 핵 카운터 스테인 용액을 초순수에 1:100으로 희석하여 구성됩니다. 소용돌이에 의하여 섞으십시오.
  9. 형광 프로브 용기에서 첫 번째 이미징 라운드에 해당하는 형광 프로브 혼합물을 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (450 μL x 슬라이드 수)이며, 프로브 버퍼 내에서 1:20으로 희석 된 형광 프로브 1 용액으로 구성됩니다. 해동 후 구성 요소와 최종 완전한 혼합물을 와류로 가열합니다.
  10. 모든 시약이 준비되고 해당 용기에 배치되면 전체 시약 봉을 소프트웨어에 배치하여 시약량을 측정할 수 있도록 합니다.

5. 설정 실행

  1. 모든 시약이 준비되면 소프트웨어 상단의 슬라이드 설정 탭으로 이동하여 새 연구 버튼을 선택합니다. 원하는 대로 스터디 ID, 스터디 이름 및 스터디 코멘트를 추가합니다. 그림 2 를 예로 참조하십시오.
  2. dispense volume(분주 부피)에서 150 μL 및 *Dewax 4 steps(디왁스 4 단계 )를 준비 프로토콜로 선택합니다. 드롭다운 메뉴에 *Dewax 4 단계가 나타나지 않으면 Protocol Setup(프로토콜 설정) 메뉴에서 이 프로토콜을 찾아 Preferred(선호) 상자를 선택합니다. 확인을 누릅니다.
  3. 스터디가 생성되면 슬라이드 설정 화면의 오른쪽에 있는 슬라이드 추가 버튼을 선택합니다. 슬라이드 주석에서 슬라이드의 이름을 고유하게 지정합니다.
  4. 이 화면의 추가 필드에 대해 Tissue Type(조직 유형)을 Test Tissue(테스트 조직)로 설정하고 분주 부피를 150μL로 설정하고 염색 모드는 왼쪽 드롭다운에서 Single(단일)로, 오른쪽 드롭다운에서는 Routine(루틴)으로 설정합니다. process에서 IHC를 선택하고 마커는 Antibody Staining Solution입니다.
  5. Add slide window의 protocol 섹션에서 staining을 위한 Staining Assay 1 을 선택하고, 준비로 * Dewax 4 steps 를 선택하고, HIER로 *HIER 20 min with ER2 를 선택합니다. 효소 프로토콜은 그대로 유지됩니다 *----. 이 작업이 완료되면 슬라이드 추가를 클릭합니다. 그림 2 를 예로 참조하십시오.
  6. 연구에서 실행할 슬라이드 수에 대해 필요에 따라 이 프로세스를 반복하여 추가된 각 슬라이드에 대해 [슬라이드 주석] 필드가 업데이트되어 나중에 고유하게 식별할 수 있도록 합니다. 모든 슬라이드를 추가한 후 Add Slide(슬라이드 추가) 창을 닫고 모든 레이블을 인쇄하여 해당 조직 섹션에 부착합니다.
  7. 트레이를 소프트웨어에 로드하기 전에 각 슬라이드를 트레이에 로드하고 각 섹션 위에 커버 타일을 놓습니다. 시약과 슬라이드가 추가되면 소프트웨어 오른쪽에 있는 해당 자동 염색기를 선택합니다. 이 옵션을 선택하면 벌크 시약 및 시약 준비 중에 추가된 시약을 포함하여 소프트웨어의 모든 시약에 대한 세 개의 슬라이드 트레이와 정보를 모두 볼 수 있습니다.
  8. 벌크 시약 용기가 채워졌는지, 폐기물 용기에 실행을 완료하기에 충분한 양이 남아 있는지 확인한 다음 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다.
  9. 각 실행을 완료하는 데 약 5시간 15분이 소요됩니다. 중지 시간을 기록하고 프로토콜이 완료되면 즉시 자동 염색기에서 슬라이드를 제거하도록 합니다.

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그림 2: 소프트웨어에 대한 프롬프트. (A) 멀티플렉스 면역형광(mIF) 염색 프로토콜에 대한 올바른 설정을 보여주는 Autostainer 소프트웨어의 새로운 연구 프롬프트. (B) 소프트웨어에 슬라이드 프롬프트를 추가하여 mIF 염색 프로토콜에 대한 올바른 설정을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 이미징

  1. 염색 프로토콜이 완료되면 장착 매체에서 염색된 슬라이드와 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립이 제자리에 단단히 고정될 때까지(일반적으로 1시간 이상, 일시 중지 지점) 장착 매체가 어둠 속에서 경화되도록 합니다.
  2. 형광 현미경 또는 전체 슬라이드 스캐너에서 분석에 적합한 필터가 있는 이미지 슬라이드. 이 분석에 사용되는 염료는 일반적으로 DAPI, FITC, TRITC, Cy5 및 Cy7용 필터와 호환됩니다.
  3. 이미지는 그림 3A와 비슷하게 나타납니다. 조직의 모든 영역에 초점이 적절하게 맞춰져 있고 신호가 적절한 강도 수준(과/과소 노출이 아님)으로 나타나는지 시각적으로 확인합니다. 필요한 경우 다른 노출 설정으로 슬라이드를 다시 이미지화합니다.
  4. 이미징 후 추가 이미징이 필요한 경우 커버슬립이 저절로 떨어질 때까지 슬라이드를 1x PBS에 담그십시오. (일시정지 지점)

7. Exchange 프로토콜 초기 설정

  1. 소프트웨어가 버전 7.0 이상인 경우 autostainer 프로토콜의 템플릿이 사전 설치되어 있습니다. 화면 아래쪽에서 Preferred Status(기본 설정 상태) 선택이 All(모두)로 설정되어 있는지 확인합니다. 템플리트 프로토콜의 이름은 *ISP Signal Exchg입니다. 이전 버전의 소프트웨어의 경우 프로토콜은 표 3에서 찾을 수 있습니다.
  2. *ISP Signal Exchg를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 프로토콜을 복사합니다. 결과 팝업 창에서 프로토콜 Exchange Protocol 1의 이름을 약식 이름 ISPEXCH1로 바꿉니다. 계속하기 전에 Preferred(선호) 상자가 선택되어 있는지 확인하고 2.6단계에서 설정한 것과 동일한 키트 이름을 할당합니다.

표 3: 다중 면역형광 신호 교환 프로토콜에 대한 프로토콜. Wash Buffer는 BOND Wash solution에 해당합니다. 다른 모든 보조 시약에는 해당 이름의 키트 구성 요소가 있습니다. 이 프로토콜은 소프트웨어 버전 7.0 이상, BXD 39 이상과 호환됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

8. Exchange 프로토콜 설정 및 실행

  1. 교환 버퍼를 실온에서 해동합니다. 교환 중화제와 교환 개시제는 사용할 때까지 -20°C로 유지하십시오. 교환 프로토콜을 수행하기 위해 두 개의 시약 적정 용기와 검출 키트가 필요합니다.
  2. 해당 컨테이너에서 교환 솔루션을 준비합니다. 필요한 부피는 350 + (450 μL x 슬라이드 수)이며, 교환 버퍼에 1:500으로 희석된 교환 개시자로 구성됩니다. 교환 효소 또는 완성된 교환 용액을 와류로 사용하지 말고 피펫팅으로만 혼합하십시오.
  3. 두 번째 형광탐침자 혼합물을 형광탐침자 2 용기에 준비한다. 필요한 부피는 350 + (450 μL x 슬라이드 수)이며 1:20으로 희석된 형광 프로브 2 용액과 프로브 버퍼 2 내에서 1:40으로 희석된 교환 중화제로 구성됩니다. 형광 프로브 혼합물과 프로브 버퍼는 와류(vortexed)일 수 있지만, 교환 중화제와 최종 결합 용액은 피펫만 혼합해야 합니다.
  4. 모든 시약이 준비되면 전체 막대를 자동 염색기에 놓고 시약을 기계에서 딥 테스트하도록 합니다.
  5. 5단계에 따라 모든 슬라이드를 추가합니다. 슬라이드를 추가하는 동안 표식기를 *음수로 변경합니다. Preparation, HIER 및 Enzyme의 경우 교환 프로토콜에 왁스 또는 항원 검색이 필요하지 않으므로 *---- 옵션을 선택합니다. 이 작업이 완료되면 슬라이드 추가를 클릭합니다.
  6. 연구에서 실행할 슬라이드 수에 대해 필요에 따라 이 프로세스를 반복하여 추가된 각 슬라이드에 대해 [슬라이드 주석] 필드가 업데이트되어 나중에 고유하게 식별할 수 있도록 합니다.
  7. 모든 슬라이드를 추가한 후 Add Slide(슬라이드 추가) 창을 닫고 모든 레이블을 인쇄하여 해당 조직 섹션에 부착합니다.
  8. 트레이를 소프트웨어에 로드하기 전에 각 슬라이드를 트레이에 로드하고 각 섹션 위에 커버 타일을 놓습니다.
  9. 모든 시약과 슬라이드가 추가되면 소프트웨어에서 해당 Autostainer 를 선택합니다. 이것은 오른쪽에 있습니다. 이 옵션을 선택하면 벌크 시약 및 시약 준비 중에 추가된 시약을 포함하여 소프트웨어의 모든 시약에 대한 세 개의 슬라이드 트레이와 정보를 모두 볼 수 있습니다.
  10. 벌크 시약 용기가 채워져 있고 폐기물 용기에 실행을 완료할 수 있는 충분한 양이 남아 있는지 확인합니다.
  11. 이것이 확인되면 재생 버튼을 눌러 실행을 시작하십시오. 프로토콜을 완료하는 데 약 90분이 걸립니다. 중지 시간을 기록하고 실행이 완료되면 슬라이드가 즉시 제거되었는지 확인하십시오.

9. 이미징

  1. 5단계에서와 같이 새로운 프로브 라운드에 대해 이미징을 반복합니다. 이미지는 그림 3B와 같이 나타납니다.

10. 스태킹(>4-plex 단백질 이미징용)

  1. 이제 동일한 슬라이드에 대해 여러 이미지가 존재합니다. 이미지 공동 정합 소프트웨어의 이미지를 결합하여 스택형 8-plex 이미지를 생성합니다.
  2. 각 라운드의 이미지를 다음과 같이 공동 등록합니다.
    1. 각 라운드 이미지의 이름은 다음과 같이 지정됩니다. 여기서 _여기서 는 슬라이드(바코드)의 고유 이름이고 는 알파벳 순으로 정렬할 때 라운드 1 이미지가 먼저 배치되고 라운드 2 이미지가 두 번째로 배치되는 문자열입니다. 예를 들어, = 1234ABC의 경우, 파일의 이름은 1234ABC_Round1 및 1234ABC_Round2로 지정될 수 있으며, 모든 파일은 스캐너의 적절한 확장자(예: .czi)를 갖습니다. 모든 둥근 이미지를 예를 들어 Source Images라는 단일 폴더에 넣습니다.
    2. 공동 등록 소프트웨어 내에서 사용자 인터페이스의 소스 이미지 디렉토리 섹션에 있는 설정 버튼을 클릭하고 메시지가 표시되면 위에서 생성한 폴더를 선택합니다.
    3. 소스 이미지 섹션의 파일 형식을 소스 이미지의 확장자(예: .czi, .qptif 등)로 설정합니다. 이제 소프트웨어는 슬라이드 1234ABC에 2개의 원형 이미지가 있음을 보여주는 표에 두 개의 원형 이미지를 함께 표시합니다.
    4. 원하는 경우 사용자 인터페이스의 누적 이미지 디렉토리 섹션에 있는 설정 버튼을 사용하여 출력 스택 이미지의 위치를 소스 이미지 폴더와 다른 디렉토리로 설정하고 메시지가 표시되면 원하는 출력 폴더를 선택합니다. 그렇지 않으면 원본 이미지 폴더가 기본적으로 사용됩니다.
    5. 기본적으로 스택의 .afi 파일 표현만 만들어집니다. 인터페이스의 처리 옵션 섹션에서 전체 스택의 OME.tif 파일을 저장하는 옵션을 선택합니다.
    6. 전체 샘플에 대한 공동 등록 정확도를 검증하려면 인터페이스의 출력 섹션에서 Validation 옵션을 확인하십시오.
    7. START 버튼을 눌러 이미지 공동 정합을 시작합니다.

11. 이미지 분석

  1. 슬라이드를 이미지화한 후 Ultivue의 STARVUE 이미지 처리 제품군 또는 QuPath15와 같은 원하는 분석 방법을 사용하여 슬라이드를 시각화하고 분석합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 프로토콜에 따라 FFPE 조직은 여러 표적으로 염색되고 4개 그룹의 모든 마커에 대한 고품질 이미지가 얻어졌습니다(그림 3A, B). 이미지 공동 정합 소프트웨어를 사용하면 그림 3C에서 볼 수 있듯이 동일한 슬라이드의 이미지를 결합하고 공동 정합할 수 있습니다. 그림 4 에는 결장직장암(CRC) 조직 슬라이드에 대한 유사한 결과가 나와 있습니다.

프로토콜의 성공 여부는 예상되는 염색 패턴을 평가하여 결정해야 합니다. 도시된 CRC 예시에서, 염색된 각 표적은 예상되는 세포 내 구획(subcellular compartment)에서 발현됩니다(예: 핵 FoxP3, 막질 CD3, 세포질 CD68)(그림 4B-D). PD1 및 CD3 또는 PDL-1 및 CD68의 공동 국소화 예에서 알 수 있듯이 각 기능 표적은 적절한 세포 유형에 따라 발현되며, 이는 각각 소진된 T 세포와 면역 억제 대식세포를 보여줍니다. 양호한 신호 대 배경 비율의 평가는 일반적으로 병리학자 또는 이미지 분석 전문가가 정성적으로 수행하여 염색 품질을 확인하여 성공적인 이미지 분석을 가능하게 합니다. 염색 품질 및 성능을 추가로 확인하기 위해 연속 절편에 대한 골드 스탠다드 IHC(발색 DAB)와의 비교를 추가할 수 있으며(그림 5의 예 참조) 대부분의 면역 표적에 대해 염색 실행의 성공을 확인하는 데 유용할 수 있는 인간 편도선과 같은 양성 대조군 조직 샘플을 추가할 수 있습니다. 암은 인간 편도선보다 표적의 발현이 낮을 수 있다는 점에 유의하라16.

결과를 정성적으로 확인한 후 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 이 연구에서는 주로 특정 표적을 발현하는 다양한 표현형(세포 수/mm2)의 세포 밀도를 계산하고 광범위한 발현 범위를 보여줄 수 있는 기능적 표적의 평균 강도 수준을 계산하는 것으로 구성됩니다. mIF 분석의 정밀도를 평가할 때 동일한 마커로 염색된 연속 절편은 그림 6에서 정성적으로 볼 수 있듯이 슬라이드 간에 유사한 신호를 표시해야 합니다. 다양한 조직 유형에서 단일 마커 밀도의 정량적 결과의 예가 그림 7에 나와 있습니다. 이러한 이미지에 대한 이미지 분석을 통해 양성 세포를 식별할 수 있으며, 각 마커에 대해 해당 양성 세포 밀도와 양성 세포당 평균 신호 강도를 계산할 수 있습니다. 이를 통해 각 마커에 대해 변동성 계수(CV)를 계산하여 다중화 분석의 정밀도를 평가할 수 있습니다(표 4).

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그림 3: 8-plex 면역형광 프로토콜에서 연속적인 염색 라운드에서 얻은 TMA(Tissue Microarray) 코어의 이미지. (A) 마커 CD8, PD1, PD-L1 및 CD68을 특징으로 하는 첫 번째 이미징에서 얻은 이미지. 교환 프로토콜 후, (B)는 마커 CD3, CD4, FoxP3 및 CK/SOX10의 두 번째 라운드에 대한 동일한 슬라이드에 대한 두 번째 이미징을 보여주고, (C)는 이미지 (A) 및 (B)를 결합한 공동 등록 이미지를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 8-plex 면역형광 염색을 통한 대장암(CRC) 조직의 대표적인 염색. 이 그림은 동일한 세포에서 여러 표적을 공동 국소화하여 식별할 수 있는 세포 표현형을 보여줍니다. (맨 위) CRC 조직의 전체 슬라이드 이미지. (아래) (A) T-reg 세포(CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) 종양 및 기질 내 PD-1 및 PD-L1 발현 세포, (C) 소진된 세포독성 T 세포(CD3+/CD8+/PD-1), (D) 면역 회피 종양 세포(PD-L1+/CK+) 및 면역 억제 대식세포(CD68+/PDL1+). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 면역조직화학(IHC)과 면역형광(IF) 염색의 정성적 비교. 단일 마커 면역조직화학 염색(DAB, 맨 윗줄), 단일 마커 면역형광(ISP monoplex) 및 다중 면역형광의 단일 채널 보기(ISP multiplex)로 염색된 연속 절편은 다양한 염색 방법 간의 정성적 일치를 보여줍니다. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 연속 단면 염색. (A) 다조직 TMA의 레이아웃을 보여주는 다이어그램. (B) TMA에서 각 조직 유형의 조직 코어의 대표 8-plex 이미지. (C) 한 번의 실행으로 염색된 6개의 연속 TMA 절편에 걸친 편도선의 CD8 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: TMA에 포함된 조직 유형별 단일 마커 밀도 정량화. 조직당 밀도는 TMA 슬라이드에서 각 조직 유형의 3개 대표 코어에 걸친 평균 밀도입니다. y축은 x축의 다양한 조직 유형에서 단일 마커 밀도를 양성 세포/mm2 단위로 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 8: 이 프로토콜에 설명된 증폭된 ISP mIF와 간접 IF를 비교하는 상대 형광 신호의 관심 영역(ROI) 분석. (A) 5개의 ROI가 표시된 CK(왼쪽) 또는 PD-L1(오른쪽)에 대해 염색된 대표 슬라이드. (B) CK(위)와 PD-L1(아래)의 대표적인 ROI 이미지. 각각 100μm x 100μm를 측정하고 약 200개의 셀을 포함하는 5개의 ROI에서 (C) CK 및 (D) PD-L1에 대해 증폭된 mIF(보라색) 및 간접 IF(파란색)로 달성한 평균 신호 강도. Y축 값은 임의의 형광 단위를 나타내고 오차 막대는 표준 편차(n=3)를 나타냅니다. (E) 증폭된 ISP mIF(보라색) 및 간접 IF(파란색)로 달성된 상대 신호 강도는 모든 ROI에서 평균 간접 IF 신호에 대한 평균 증폭된 mIF 신호의 비율을 취하여 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 계산된 분산 계수(CV). 편도선 이미지에 대한 positive cell density와 mean signal intensity의 CV는 그림 6에 나와 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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이 보고서는 오토스테인러(autostainer)를 사용하여 고처리량, 고감도 멀티플렉스 면역형광 염색 실행을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 수행할 때 시약 준비 단계는 매우 중요하며 주의를 기울일 가치가 있습니다. 시약이 적절하게 혼합되고 올바르게 측정되어 동일한 실행의 다른 슬라이드 간 또는 동일한 구성 요소를 사용하는 다른 실행 간의 염색 변동성을 최소화해야 합니다.

이 프로토콜을 수행할 때 발생하는 일반적인 문제에는 로딩 전에 시약을 적절하게 혼합하지 않는 것과 부적절한 커버슬립 제거 절차로 인한 조직 손실 가능성이 포함됩니다. 이 염색 프로토콜은 암 유형을 포함한 모든 FFPE 조직 유형에 적용할 수 있지만 일부 조직 유형은 보다 신중한 취급이 필요할 수 있습니다(예: 고지방 함량 조직). 조직 손실을 방지하려면 커버 슬립 슬라이드가 충분히 오랫동안 담가두어 커버 슬립이 저절로 분리되도록 하십시오. 커버슬립을 강제로 빼내거나 유리를 들어 올리지 마십시오.

면역 종양학에서 가장 일반적으로 사용되는 많은 표적이 검증되어 바로 사용할 수 있지만 일부 표적은 멀티플렉스 패널에 포함되기 전에 분석 개발이 필요할 수 있다는 한계가 있습니다. 이 프로세스는 비교적 빠르지만 사용자 지정 멀티플렉스 패널을 사용하려면 몇 주가 더 필요할 수 있습니다.

이 분석법과 다른 다중 면역형광 기술 사이에는 몇 가지 차이점이 있습니다. 직접 및 간접 면역형광 기반 기술과 비교했을 때, 여기에서 입증된 분석은 증폭 수준이 훨씬 높기 때문에 특히 FITC 채널과 같이 조직 자가형광을 나타내는 경향이 있는 채널에서 신호 대 잡음비를 크게 개선할 수 있습니다. 그 결과 전체 슬라이드 강도 분석 및 수동 ROI 기반 분석을 사용하여 정량화한 바와 같이 직접 면역형광보다 ~30배 더 강한 신호와 간접 면역형광보다 ~10배 더 강한 신호가 생성됩니다(그림 8). 이 방법을 사용하면 상당히 짧은 노출 시간에서 훨씬 더 민감한 표적 단백질을 검출할 수 있으며 저강도 신호를 제거할 위험이 있는 배경 제거를 포함한 이미지 조작의 필요성을 없앨 수 있습니다.

효소 촉매 증폭을 기반으로 하는 mIF 분석과 비교했을 때, 여기에서 입증된 분석은 워크플로우가 더 간단하고 일반적으로 분석 실행 시간이 짧을 뿐만 아니라 다중분석을 수행하는 능력이 크게 향상되었습니다(그림 1). 이 분석에서는 항체가 한 단계로 함께 추가되고 동시에 증폭되어 분석 프로토콜을 크게 단순화합니다. 또한, 티라미드 신호 증폭(TSA)과 같은 일부 효소 기반 기술은 우산 효과(umbrella effect) 12,17,18라고 하는 서로 다른 항체 간의 간섭을 나타낼 수 있습니다. 여기에 사용된 증폭 기술은 이러한 문제를 방지하여 그림 4에서 볼 수 있듯이 동일한 세포에서 여러 공동 국소화 및 동시 발현 마커를 검출할 수 있습니다.

인간 암의 약 90%는 상피 세포에서 발생합니다19. 이는 종종 외부 환경에 대한 1차 방어선을 형성하고 더 빨리 증식하여 잠재적으로 발암성 돌연변이가 더 빨리 축적되기 때문입니다. 여기서 염증은 종양 형성, 진행 및 전파에 중요한 역할을 합니다. 지난 10년 동안 면역관문억제제와 면역세포를 표적으로 하는 많은 치료법이 많은 종양 유형에 대한 강력한 무기로 부상했습니다 5,20,21. 그러나 상당수의 환자는 여전히 반응을 보이지 않습니다. 종양 미세환경(TME)과 국소 면역 환경이 중요한 역할을 할 가능성이 높습니다. 많은 환자에서 차등 약물 반응과 관련된 TME 분자 시그니처를 프로파일링함으로써 치료용 바이오마커를 더 잘 정의할 수 있습니다. 이 보고서는 mIF 기술을 사용하여 수백 개의 전체 샘플 슬라이드 또는 종양 마이크로어레이에 걸쳐 발현이 낮은 마커를 포함하여 여러 단백질 바이오마커를 병렬로 프로파일링할 수 있음을 보여줍니다.

공개 사항

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저자 K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. 및 A. Vasaturo는 이 작업에 사용된 다중 면역 형광 키트를 생산하는 Ultivue의 직원입니다.

감사의 글

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이 작업은 Ultivue의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-CD3Ultivue클론 BC33(BioCare). ULT50801
Anti-CD4UltivueClone SP35(Abcam)의 일부입니다. ULT50801
항-CD68Ultivue클론 KP1(BioCare)의 일부입니다. ULT50801
항-CD8Ultivue클론 C8/144B(BioCare)의 일부입니다. ULT50801
항-사이토케라틴 + 항-SOX10Ultivue클론 AE1/AE3(Bethyl Labs) 및 BC34(BioCare)의 일부입니다. 혼합물로 제공되는 ULT50801의 일부
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7(Thermo). ULT50801
항-PD1Ultivue클론 CAL20(Abcam)의 일부입니다. ULT50801
항-PDL1Ultivue클론 73-10(Abcam)의 일부입니다.
Axioscan.Z1 현미경Zeiss형광 현미경 텍스트 본
탈랍 용액라이카AR9222
본드 에피토프 회출 용액 2라이카AR9640
본드 오픈 용기, 30mL라이카OP309700
본드 연구 검출 키트라이카DS9455
본드 적정 인서트라이카OPT9049
본드 적정 키트라이카OPT9719
본드 유니버설 커버타일라이카S21.4611
본드 세척액 10x 농축액라이카AR9590
BondRX 자동 염색기카텍스트에서 "자동 염색기"라고 불립니다
BondRX 소프트웨어라이카버전 6.0 이상
커버슬립, #1.5 두께Corning2980-244
에탄올, 200 프루프VWR89370-084
FFPE 조직 블록BioIVT조직 유형은 다양합니다
. OmniVUE 8-plex 분석(CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801다른 모든 Ultivue 성분이 포함되어 있습니다.
인산염 완충 식염수(PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7.4, 2.7mM KCl 및 137mM NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144는
Amplification BufferUltivue
ULT50801 Ultivue 항체 희석제Ultivue Ultivue
Ultivue Exchange 완충액Ultivue Ultivue
Exchange InitiatorUltivueULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueULT50801
Ultivue 형광 프로브 1UltivueULT50801
Ultivue 형광 프로브UltivueULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivue Ultivue
BufferUltivueULT50801
초순수Sigma-AldrichW4502
: 의 일부ULT50801 드 라이는 . 에는 Ultivue UltiAnalyzer.AI UltiStacker.AI Ultivue Ultivue 텍스트에서 "마운팅 매체"라고 불립니다.의 일부 ULT50801 의 일부 ULT50801 의 일부 의 일부의 일부 2 의 일부 Probe의 일부 ULT50801 의 일부

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