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방법 논문

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

2.1K 조회수

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DOI:

10.3791/67600

⸱

2025년 7월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

초록

중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생하고 여러 세포 계통으로 분화할 수 있는 줄기세포 집단입니다. 그 중 골수에서 발견되는 MSC는 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)로 알려져 있으며, 골형성, 조혈 지원, 귀환/이동, 면역 억제에 중요한 역할을 합니다. BMSC는 세포 치료 전략에 대한 잠재력과 쉬운 가용성, 유전적 안정성 및 낮은 면역원성으로 인해 세포 생물학 및 조직 공학 연구에 널리 사용됩니다. 조혈모세포(HSC)와 BMSC는 골수에 공존하지만 뚜렷한 전구세포를 가지고 있습니다. 골수에서 세포를 추출할 때 일반적으로 여러 세포 유형을 얻을 수 있으며, 이는 세포 집단의 이질성을 유발하여 잠재적으로 편향을 유발하고 높은 실험 표준을 충족하지 못할 수 있습니다. 따라서 in vitro에서 BMSC의 균질성과 수율을 개선하기 위한 효과적인 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 이 연구는 BALB/c 마우스에서 얻은 BMSC의 정제, 확장 및 유세포 분석 기반 표현형에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 제3 계대 BMSC의 균질성 및 줄기세포 표현형을 유세포 분석을 사용하여 특성화하여 CD29, CD44 및 Sca-1에 대한 양성, CD45 및 CD31에 대한 음성성을 입증하고 골형성 및 지방형성 분화 능력을 확인했습니다. 이 비용 효율적인 프로토콜은 증식 및 분화 가능성이 높은 균질한 BMSC를 충분히 얻을 수 있는 쉽고 효율적인 방법을 제공하며, 이는 마우스 모델 및 광범위한 전임상 연구의 연구를 진전시키는 데 필수적입니다.

서론

골수 중간엽 줄기세포(BMSC)는 다능 특성으로 알려져 있으며 자가 재생, 분화 및 면역 조절 특성으로 인해 다양한 질병 치료에 널리 사용됩니다 1,2. BMSC는 쉽게 구할 수 있고, 광범위한 증식이 가능하며, 면역억제 특성을 나타내고, 즉각적인 면역 반응을 유발하지 않기 때문에3 조직 공학 응용 분야 및 세포 치료를 위한 효과적인 운반체에 매력적입니다.

골수에서는 두 개의 주요 줄기세포 집단과 그 자손인 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)와 BMSC가 주요 거주자입니다4. 전통적으로 BMSC는 표적 골수 흡인을 통해 얻어지며 in vitro에서 플라스틱 부착 세포로 식별됩니다. 그러나 이 방법은 BMSC를 내피 세포, 주피 세포, 백혈구 및 조혈 줄기 세포를 포함한 다른 골수 하위 집단과 구별하기에는 충분하지 않습니다5. 따라서 BMSC의 분리를 위한 쉽고 효과적인 프로토콜이 필요합니다.

현재 연구는 플라스틱 세포 배양 플레이트에 대한 물리적 부착을 통한 BMSC의 분리 및 정제에 대해 자세히 설명합니다. 국제세포유전자치료학회(International Society for Cell & Gene Therapy, ISCT) 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell, MSC) 위원회6에 의해 요약된 바와 같이 표면 마커 CD29, CD44 및 Sca-1을 사용하여 제3계 계대 BMSC에 대한 유세포 분석 실험을 수행했습니다. ISCT 기준에 따르면, 생쥐 MSC는 CD29, CD44 및 줄기세포 항원 1(Sca-1)에 대해 양성, 조혈 세포 마커 CD45 및 내피 세포 마커 CD31에 대해 음성이 특징입니다. 또한, BMSC는 다능해야 하며, 조골세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte) 및 지방세포(adipocyte)로의 삼계통 분화를 입증해야 합니다. 이 실험에서는 추출된 BMSC에서 골형성을 유도했으며, 7일째에 ALP 염색을 수행하고 21일에 알리자린 레드 S 분석을 수행하여 분화를 평가했습니다. 분리 및 정제된 BMSC의 지방생성 분화도 유도되었으며, 지방 형성을 평가하기 위해 21일째에 Oil Red O 염색을 수행했습니다.

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프로토콜

동물 취급은 상하이 중국 전통 의학 대학의 실험실 동물 윤리 지침(윤리 승인 번호: PZSHUTCM2211070009)에 따라 승인되었습니다. 이 연구에는 8주 된 암컷 BALB/c 마우스(SPF 등급, 체중 20± 1g)가 사용되었습니다. 이 프로토콜은 정제, 계대측정, 유세포 분석 기반 표현형, 마우스 유래 BMSC의 골형성 및 지방형성 분화를 간략하게 설명합니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 취급

  1. 특정 병원체가 없는(SPF) 조건의 마우스를 개별적으로 환기가 되는 케이지에 수용하며, 케이지당 5마리의 마우스가 있습니다. SPF 등급의 사료와 멸균수를 제공합니다. 12시간의 라이트/다크 주기를 유지합니다.
    참고: 이 방법은 테스트를 거쳐 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 균주 모두에서 실현 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 이 논문에서는 주로 BALB/c를 예로 사용합니다.

2. 쥐 뒷다리에서 대퇴골과 경골 채취

  1. CO2 질식 후 자궁 경부 탈구7을 통해 동물을 안락사시킵니다.
  2. 마우스를 75% 에탄올에 5분 동안 담급니다(그림 1A).
    참고: 안락사 후 30분 2초 이내에 줄기세포를 채취했으며, 골수 세척, 여과 및 배양 플레이트에 파종을 포함한 전 과정을 2시간 이내에 완료하여 최적의 세포 생존력을 확보했습니다.
    참고: 최적의 BMSC 수율을 위해 성체 마우스(≥8주령)를 사용하십시오. 8-12주 된 마우스가 이상적입니다8.
  3. 멸균 해부 가위로 아킬레스건 뒷다리를 약 1cm 정도 절개합니다(그림 1B).
  4. 멸균 가위로 아킬레스 건의 뒷다리 주위를 원형으로 절개하여 원위 경골을 노출시킵니다(그림 1C).
  5. 절개 부위에서 엉덩이 쪽으로 피부를 벗겨 양쪽 뒷다리에서 제거합니다(그림 1D).
  6. 장골골을 따라 절단하여 대퇴골두와 엉덩이 뼈를 분리합니다(그림 2A).
    참고: 골수 손실을 방지하기 위해 절제 중 대퇴골의 양측 관절이 손상되지 않도록 하십시오.
  7. 수집된 대퇴골과 경골을 2% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 멸균 사전 저온 PBS가 들어 있는 60mm 접시에 넣습니다(그림 2B).
  8. 나중에 세척할 수 있도록 멸균 메스를 사용하여 경골과 비골에서 가능한 한 많은 힘줄과 근육을 잘라냅니다(그림 2C).
  9. 처리된 뼈를 2% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 PBS로 되돌려 놓고 후속 분리 단계를 위해 멸균 후드로 옮깁니다.

3. 마우스 BMSC의 정제 및 배양

  1. αMEM에 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 BMSC 배양을 위한 완전한 MEM 알파 변형(αMEM) 배지를 준비합니다.
    참고: 상대적으로 낮은 농도인 1000mg/L의 포도당을 함유하고 있으므로 αMEM 배지를 선택하십시오. 이는 고혈당 환경에서 발생할 수 있는 세포 증식 억제를 방지하는 데 도움이 됩니다9
  2. 50mL 주사기를 가지고 주사기와 함께 제공된 바늘을 부착합니다.
  3. 50mL 주사기에 20mL의 αMEM 배지를 주입한 다음 바늘을 1mL 주사기와 함께 제공된 바늘로 교체합니다.
    참고: 뼈 크기를 수용하고 세포 손상을 최소화하기 위해 1mL 주사기 바늘을 사용하십시오. 50mL 주사기를 사용하면 골수를 효율적으로 세척할 수 있으며 반복적인 삽입으로 인한 세포 오염 위험을 줄일 수 있습니다.
  4. 가위를 사용하여 멸균 후드에서 분리된 대퇴골 또는 경골의 양쪽 끝을 잘라냅니다.
  5. 절단된 가장자리를 따라 뼈에 바늘을 삽입하고 완전한 αMEM 배지가 들어 있는 100mm 배양 접시에 골수를 플러시합니다(그림 2D).
  6. 대부분의 골수가 추출되었는지 확인하기 위해 뼈 조각이 창백해 보일 때까지 골강을 반복적으로 세척합니다(그림 2E).
  7. 피펫 팁으로 40회 위아래로 부드럽게 피펫을 사용하여 응집된 세포를 최대한 분산시킵니다.
  8. 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 여과하여 파편, 조직 조각 및 분산되지 않은 덩어리를 제거합니다.
  9. 여과된 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시로 옮기고 접시당 15mL의 최종 부피에 완전한 αMEM 배지를 추가합니다.
    참고: 세포 성장을 촉진하기 위해 각 마우스의 대퇴골과 경골에서 수집한 모든 골수 세포를 하나의 100mm 배양 접시에 배양합니다. 이전 실험을 기반으로 8주 된 마우스(2개의 대퇴골과 2개의 경골)에서 약 1 × 107 BMC를 분리할 수 있습니다. 이 세포는 1차 배양을 위해 1.8 × 105 cells/cm2의 밀도로 100mm 배양 접시에 파종됩니다.
  10. 양손으로 접시를 잡고 8자 모양으로 부드럽게 휘젓는 동작을 15회 반복하여 접시 전체에 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
  11. 배양 접시를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에 놓고 5일 동안 배양합니다(그림 3A).
    참고: 균일한 세포 성장을 보장하기 위해 이 기간 동안 배양 접시를 움직이지 마십시오.

4. BMSC 배양을 위한 αMEM 배지 교체

  1. 현미경으로 세포를 관찰하여 80% 농도에 도달했는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 5일 째에 매체 교체를 진행하십시오.
  2. 멸균 파스퇴르 피펫으로 PBS 3mL를 추출하고 배양 접시 위 1cm 높이에서 다른 위치에서 분배합니다.
    알림: 접시의 한쪽 면으로 액체를 분배하면 과도한 충격력으로 인해 부착 세포가 제거되고 원치 않는 세포가 효과적으로 제거되는 것을 방지할 수 있으므로 피하십시오.
  3. PBS 3mL를 첨가한 후 배양 접시를 부드럽게 흔들어 세포를 철저히 씻어내고 피펫으로 접시에서 PBS를 제거합니다. 세포가 철저히 세척되었는지 확인하기 위해 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.
  4. 멸균 파스퇴르 피펫으로 완전한 αMEM 배지 15mL를 추출하고 배양 접시 위 1cm에서 다른 위치에서 분주합니다.
  5. 배양 접시를 인큐베이터로 되돌리고 세포가 외대배양 전에 80% 포화도에 도달할 때까지 모니터링합니다(그림 3B).

5. BMSC의 통과

  1. PBS로 합류 세포의 80%를 두 번 세척합니다(그림 3C).
    참고: 소화 전에 PBS로 세포를 세척하면 잔류 배지 및 세포 분비물을 제거하고 배양 접시에 대한 MSC 접착을 줄이는 데 도움이 됩니다.
  2. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2-3분 동안 배양하여 1mL의 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 분해합니다.
  3. 세포 현탁액에 완전한 αMEM 배지 4mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
  4. 1mL 피펫 팁을 사용하여 배양 접시에서 세포 현탁액을 흡인하고 접시 바닥을 부드럽게 씻어내어 부착된 모든 세포를 분리합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 300×g으로 원심분리합니다.
  6. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 세포 펠릿을 완전한 αMEM 배지 2mL에 재현탁합니다.
    참고: subculturing의 경우 약 4 × 104 cells/cm2의 파종 밀도가 지속적인 성장과 증식에 최적화된 것으로 밝혀졌습니다.
  7. 세포를 1:1–1:2 비율로 새로운 100mm 세포 배양 접시로 분할합니다(1차 계대 P1 구성)(그림 3D).
  8. 약 3일마다 80% 포화도에 도달하면 세포를 1:1.5 비율로 분할하여 BMSC의 두 번째 계대(P2)(그림 3E)와 세 번째 계대(P3)(그림 3F)를 생성합니다.

6. 표현형 동정 및 골형성 분화를 위한 P3 BMSC 준비

  1. 세포 배양 배지를 폐기합니다.
  2. P3 BMSC를 PBS 3mL로 두 번 세척합니다.
  3. P3 BMSC가 80% 포화도에 도달하면 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2-3분 동안 배양하여 0.25% 트립신-EDTA 1mL로 분해합니다.
  4. 세포 현탁액에 완전한 αMEM 배지 4mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 300×g으로 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
    참고: 여기에서 준비된 P3 BMSC 펠릿은 유세포 분석을 통한 표현형 식별 및 골형성 또는 지방형성 분화를 평가하는 데 사용됩니다.

7. 유세포 분석기에 의한 BMSC의 표현형 식별

  1. P3 BMSC의 세포 펠릿을 2% FBS가 함유된 PBS 용액 1.5mL로 재현탁하고 농도를 5 × 106 cells/mL로 조정합니다.
  2. 11개의 튜브 각각에 100μL의 세포 현탁액을 분취하여 튜브당 5개 × 10개 5개의 세포를 달성합니다. 라벨 블랭크, CD29 이성질분석, CD29, CD44 이성질분석, CD44, Sca-1 이성질분석, Sca-1, CD31 이성질분석, CD31, CD45 이성질분석, 및 CD45 이성질분석분석.
    참고 : 본 연구에서는 CD29-FITC, CD29 isotype-FITC, CD44-APC, CD44 isotype-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotype-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotype-PerCPcy5.5, CD31-PE 및 CD31 isotype-PE (재료 표 참조). 이러한 형광 색소는 다양한 유세포 분석기의 구성에 따라 수정할 수 있습니다.
  3. 각 그룹에 대해 다음 시약을 추가합니다: 라벨 블랭크 그룹에 PBS 2μL, CD29 동형에 2μL의 CD29 동형(1:50 희석), CD29 그룹에 2μL의 CD29(1:50 희석), CD44 동형 대조군에 0.5μL의 CD44 동형(1:200 희석), CD44 그룹에 0.5μL의 CD44(1:200 희석), Sca-1 동형을 Sca-1 동형 대조군에 0.5 μL(1:200 희석), Sca-1 대조군에 Sca-1 0.5 μL(1:200 희석), CD31 동형을 CD31 동형에 2 μL(1:50 희석), CD31 대조군에 2 μL의 CD31(1:50 희석), CD45 동형을 CD45 동형에 2 μL(1:50 희석), 및 CD45 그룹에 2μL의 CD45를 투여합니다(1:50 희석).
    참고: 항체는 유세포 분석에 대한 제조업체의 최적화된 권장 사항에 따라 사용되었습니다. 예비 실험을 통해 표적 세포에 대한 최적의 염색 및 특이성을 확인했습니다. 제조업체의 투여량 지침을 참조하고 필요에 따라 역가 사전 테스트를 수행합니다.
  4. 부드럽게 혼합하고 팜 원심분리기를 사용하여 원심분리기를 사용하고 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 각 튜브에 900μL의 PBS를 첨가하고 반전하여 혼합한 다음 300×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리합니다. 과잉 항체를 제거하기 위해 상등액을 폐기하십시오.
  6. 각 튜브의 세포 펠릿을 300μL의 PBS로 재현탁하고 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다.
    참고: 유세포 분석기 분석이 1-2시간 이내에 완료될 수 있는 경우 2.5% 중성 포름알데히드로 세포를 고정할 필요가 없습니다. 1-2시간 이내에 분석을 수행할 수 없는 경우, 2.5% 중성 완충 포르말린(10% 중성 완충 포르말린과 PBS를 1:3 비율로 혼합하여 준비)로 세포를 고정하고 나중에 유세포 분석기 분석을 위해 4°C의 어두운 곳에서 밤새 보관합니다.
  7. label blank 그룹을 사용하여 유세포 분석기 전압을 조정하여 세포 자가형광이 좌표 축의 약 1/4–1/3 이내가 되도록 합니다. CD29 isotype, CD29, CD44 isotype, CD44, Sca-1 isotype, Sca-1, CD31 isotype, CD31, CD45 isotype 및 CD45 그룹에서 셀을 순차적으로 로드합니다. P1 게이트(FSC/SSC 플롯에 정의된 대로)를 설정하여 중간 속도로 실행되는 10,000개의 셀을 캡처합니다.
    참고: 유세포 분석기에 실험에서 일반적으로 사용되는 채널(FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 및 APC)과 같은 적절한 채널 또는 항체 결합 플루오레세인에 해당하는 기타 채널이 장착되어 있는지 확인하십시오.

8. BMSC의 골형성 분화

  1. P3 BMSC 펠릿을 완전한 αMEM 배지에 재현탁하고 농도를 1 × 105 cells/mL로 조정합니다.
  2. 각 웰에 1 × 105 개의 세포를 포함하는 완전한 αMEM 배지 1mL를 추가하여 P3 BMSC를 24웰 세포 배양 플레이트에 시딩합니다.
  3. P3 BMSC를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 90% 포화도 이상에 도달할 때까지 3-5일 동안 배양합니다. 2일마다 전체 αMEM 배지를 새 배지로 교체하십시오.
  4. 서로 다른 웰을 두 그룹으로 균등하게 나눕니다: 음성 대조군(골형성 분화 유도 없음)과 골형성 분화 그룹(osteogenic differentiation group)
  5. 완전한 αMEM 배지에 10mmol/L β-글리세로포스페이트, 50mg/L L-아스코르브산 및 10-8 mol/L 덱사메타손을 보충하여 골형성 분화 유도 배지를 준비합니다.
  6. 세포 배양 배지를 버리고 P3 BMSC를 PBS 1mL로 세척합니다.
  7. 골형성 분화 유도를 위해 골형성 분화 그룹의 웰에 골형성 분화 유도 배지를 추가합니다(1mL/웰).
  8. 전체 αMEM 배지를 대조군의 웰에 추가합니다(1mL/웰).
  9. P3 BMSC를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 7일 또는 21일 동안 배양하고, 골형성 분화 유도 배지 또는 완전한 αMEM 배지를 3일마다 동일한 신선한 배지로 교체합니다.
    참고: 7일 유도 세포는 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 염색에 사용됩니다. 21일 유도 세포는 alizarin red S 분석에 사용됩니다.

9. ALP staining을 이용한 분화된 골형성 세포의 동정

  1. 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 PBS 1mL로 한 번 세척합니다.
  2. 0.5mL의 10% 완충 포르말린 용액을 첨가하고 20분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
  3. 각 웰의 세포를 PBS 1mL로 한 번 다시 세척합니다.
  4. 각 웰에 0.5mL의 알칼리성 포스파타제 염색 시약 1-Step NBT/BCIP를 첨가하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일 랩핑으로 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 용액을 버리고 증류수 1mL로 각 웰의 세포를 한 번 씻고 플레이트를 건조시킵니다.
  6. 카메라를 사용하여 염색된 군집의 이미지를 관찰하고 획득하여 흑자색 침전물이 있는 ALP 양성 세포를 식별합니다.
    참고: 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 염색 시약 1-Step NBT/BCIP는 ALP와 반응할 때 강하고 불용성인 흑자색 침전물을 생성하며, 이는 쉽게 시각화할 수 있습니다.

10. alizarin red S assay에 의한 분화된 골형성 세포의 동정

  1. 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 PBS 1mL로 한 번 세척합니다.
  2. 0.5mL의 10% 완충 포르말린 용액을 첨가하고 20분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
  3. 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 PBS 1mL로 한 번 세척합니다.
  4. 0.1 mol / L Tris-HCl (pH 8.1)에 0.5 mL의 alizarin red S를 각 웰에 첨가하고 37 ° C에서 30-60 분 동안 배양합니다.
  5. 용액을 버리고 증류수 1mL로 각 웰의 세포를 한 번 씻고 플레이트를 건조시킵니다.
  6. 알리자린 적색 S 양성 세포를 식별하기 위해 카메라를 사용하여 염색된 군체의 이미지를 관찰하고 획득합니다.
    참고: MSC가 성숙한 광물화된 뼈 세포로 분화하기 위한 알리자린 레드 S 분석은 알리자린 레드 S-칼슘 복합체를 형성하여 육안으로 관찰할 수 있는 밝은 빨간색 염색을 생성합니다.

11. BMSC를 위한 지방생성 유도 분화 매체 A의 제조

참고: BMSC의 지방 세포 분화를 위해 지침에 따라 Mouse Bone Marrow mesenchymal Stem Cells Adipogenic Differentiation Kit( 재료 표 참조)가 자주 사용됩니다.

  1. 소 태아 혈청(키트의 구성 요소, 세럼이라고 함)을 완전히 해동하기 전에 최소 4°C 냉장고에 6시간 동안 넣습니다.
  2. 보충제 A-I(키트의 구성 요소)를 준비하기 최소 30분 전에 4°C 냉장고에 넣습니다. 보충제 A-II(키트의 구성 요소)를 완전히 해동될 때까지 실온에 놓습니다.
  3. 시약 튜브를 뒤집거나 부드럽게 두드려 내용물을 섞습니다.
  4. Supplement A-II 시약 튜브를 실온에서 300× g으로 30초 동안 원심분리하여 시약이 바닥에 모여 쉽게 회수할 수 있도록 합니다.
  5. 모든 구성 요소의 외부 포장을 75% 의료용 알코올로 철저히 청소하고 생물 안전 캐비닛에서 엽니다.
  6. 배지에 혈청을 추가하고, A-I를 보충하고, A-II를 보충합니다.
    알림: 적절한 용해를 위해 기초 배지(키트의 구성 요소)를 37°C로 예열하거나 추위 노출로 인해 보충제 A-II가 침전될 수 있습니다.
  7. 소량의 Basal Medium을 사용하여 각 병과 튜브를 헹구고 모든 구성 요소가 Basal Medium에 전달되도록 합니다.
  8. Basal Medium 병의 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 완전히 섞습니다.
  9. 파라핀 필름으로 병을 밀봉하고 알루미늄 호일로 싸서 이름, 준비 날짜 및 기타 세부 사항을 표시하십시오.

12. BMSC를 위한 지방생성 유도 분화 매체 B의 제조

  1. 소 태아 혈청을 4°C 냉장고에 최소 6시간 동안 넣은 후 완전히 해동합니다.
  2. 보충제 B(키트의 구성 요소)를 4°C 냉장고에 넣고 준비하기 전에 최소 30분 동안 완전히 해동될 때까지 둡니다.
  3. 시약 튜브를 뒤집거나 부드럽게 두드려 내용물을 섞습니다.
  4. Supplement B 튜브를 원심분리하여 시약을 바닥에 집중시켜 쉽게 수집할 수 있습니다.
  5. 모든 구성 요소의 외부 포장을 75% 의료용 알코올로 철저히 청소하고 생물 안전 캐비닛에서 엽니다.
  6. 세럼과 보충제 B를 기초 배지에 첨가합니다.
  7. Basal Medium의 작은 부분을 사용하여 각 병과 튜브를 세척하고 모든 구성 요소가 배지로 완전히 옮겨졌는지 확인합니다.
  8. Basal Medium 병의 뚜껑을 닫고 부드럽게 흔들어 완전히 섞습니다.
  9. 파라필름으로 병을 밀봉하고 알루미늄 호일로 싸서 이름, 준비 날짜 및 기타 세부 사항을 표시하십시오.

13. BMSC의 지방세포 분화

  1. 0.1% 젤라틴 1mL를 6웰 플레이트에 넣고 흔들어 각 웰의 바닥을 고르게 코팅합니다.
  2. 0.1% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트를 멸균 후드 또는 CO2 인큐베이터에 최소 30분 동안 놓습니다.
  3. 젤라틴을 흡인하면 플레이트가 세포 파종을 할 준비가 되거나 30분 후에 파종하기 전에 웰이 마를 때까지 기다립니다.
  4. 6웰 플레이트의 각 웰에 4 ×10 4 cells/cm2의 밀도로 P3 BMSC를 파종하고 각 웰에 2mL의 완전한 배지를 추가합니다.
  5. 37°C에서 5% CO2 및 포화 습도의 CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
  6. 배지를 조심스럽게 흡인하고 세포가 100% 합류점에 도달하면 각 웰에 2mL의 아디포겐 분화 유도 배지 A를 추가합니다.
  7. 유도 3일 후 웰에서 배지 A를 흡입하고 2mL의 아디포겐 분화 배지 B를 추가합니다.
  8. 1일 후에 중간 B를 흡인하고 추가 유도를 위해 중간 A로 다시 전환합니다.
  9. 배지 A와 B를 번갈아 가며 매일 세포를 관찰합니다. 배지 A로 유도하는 동안 세포의 수축 또는 사멸이 발생하면 즉시 배지 B로 전환하십시오.
  10. 적절한 크기의 충분한 수의 지질 방울이 나타날 때까지 유도 및 유지 관리 과정을 반복한 다음 염색을 준비합니다.

14. 오일 레드 O(ORO) 염색

알림: 지질 방울이 분리되지 않도록 모든 절차를 가능한 한 부드럽게 수행하십시오.

  1. 지방생성 유도 분화가 완료된 후 6-well 플레이트에서 adipogenic induction differentiation medium을 흡인하고 1×PBS로 2-3회 부드럽게 세척합니다.
  2. 웰당 10% 중성 완충 포르말린 2mL를 첨가하고 실온에서 20분 동안 고정합니다.
  3. Oil Red O 스톡과 증류수를 3:2 비율로 혼합하여 Oil Red O 작업 용액을 준비합니다. 혼합 후 250 ×g에서 4 분 동안 원 심분리한 후 상층액을 사용합니다.
  4. 정착제를 흡입하고 PBS로 2-3회 부드럽게 씻어내며 정착액을 철저히 제거합니다.
  5. 각 웰에 0.8mL의 적색 O 염색 용액을 넣고 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
  6. 얼룩 용액을 흡인하고 1mL 75% 에탄올로 두 번 세척합니다.
  7. 각 웰에 헤마톡실린 카운터스테인 1mL를 2분 동안 첨가한 다음 흡인합니다.
  8. 각 웰에 PBS 2mL를 추가하고 현미경으로 addipogenic 염색 결과를 관찰합니다.
  9. 스테인드 된 6 웰 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    참고: 1주일 이상 보관하지 마십시오. 지질 방울이 융합되어 염색 상태를 잃을 수 있습니다.

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결과

마우스 유래 BMSC를 분리하고 약 2주 동안 배양하여 제3 계대(P3) BMSC를 생성했습니다(그림 3). 그림 3A에서 볼 수 있듯이, 골수에서 갓 추출한 세포는 눈에 보이는 지방 방울이 있는 단핵 상태로 남아 있었습니다. 배양 접시에 방추형 세포가 나타나 5일 배양일에 60%-80% 농도에 도달했습니다(그림 3B, C). P1-P3(그림 3D-F)에서 BMSC는 긴 방추체 또는 방추형 모양을 나타내며 단층으로 성장하고 세포 식민지 네트워크를 형성했습니다. 세포는 일반적으로 세포질이 맑고 세포사멸의 눈에 띄는 징후가 없는 적절한 간격을 유지했으며 ...

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토론

줄기세포 치료는 재생 의학에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 전임상 연구는 줄기세포, 특히 BMSC의 임상적 적용을 뒷받침하는 상당한 증거를 제공했다13. 그러나 낮은 세포 수율, 오염 및 느린 성장과 같은 문제로 인해 임상 적용이 방해를 받고 있습니다. 따라서 세포 수율과 기능을 향상시켜 임상적 사용을 확대하기 위해 BMSC 제제 공정의 표준화에 초점을 맞춘 연구가 시급히 필요합니다2.

이 방법은 BMSC의 분리 및 배양에 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 첫째, 어떠한 조작도 없이 5일 동안 연속 배양을 유지함으로써 갓 분리된 골수 세포의 교란을 최소화하여 조혈 세포가 BMSC의 영양 및 유지를 지원할 수 있도록 했습니다. 또한 BMSC를 정제하기 위해 매체 변화 및 연속 파시징과 같은 기술을...

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공개 사항

저자는 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600)과 중국 국가자연과학재단(82174408 및 82374477)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 주사기(22G 주사기 바늘)친절한 그룹(KDL)60017031
1단계 NBT/BCIP 피어스 바이오테크놀로지, Inc.34042알칼리성 포스파타제 염색
10% 중성 완충 포르말린웩시스5200250세포 고정
6-웰 플레이트랩셀렉트11110세포 배양
24웰 플레이트랩셀렉트11310세포 배양
40 & 무; m 셀 스트레이너코르니그352340응집물을 제거하기 위한 여과
50mL 주사기친절한 그룹(KDL)60017040
75% 에탄올 상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사31009001쥐의 피부 소독
알리자린 레드 S시그마-알드리치 A5533칼슘 침전물 및 석회화된 결절 검출
APC CD44 단클론 항체 (클론:IM7)e바이오사이언스17-0441-82유세포 분석 
APC 쥐 IgG2b 카파 아이소타입 대조군(클론:eB149/10H5)e바이오사이언스17-4031-82유세포 분석 
오토 클레이 브일본 히야마 주식회사HVE-50멸균 수술 기구
CO2 인큐베이터써모 피셔 테크놀로지(중국)Co., Ltd.300583057세포 배양
Cytoflex 유량 측정베크만 쿨터 A00-1-1102유세포 분석 
덱사메타손시그마-알드리치 디4902BMSC 골형성 분화
접시(100 mm)코 닝430167세포 배양
접시(60 mm)코 닝430166이식 중 샘플 배치 
소독 화장상하이 홍룡 산업 Co., Ltd.20230627쥐의 피부 소독
일회용 멸균 장갑상하이 홍룡 산업 유한 회사YT21131멸균 작동
더블 라이언 방사선 조사 설치류 다이어트쑤저우 Shuangshi 실험 동물 사료 기술 Co., Ltd.GB 14924.3동물 사료
태아 소 혈청 상하이 바이오선 과학 및 테크(주)BS-0002-500세포 배양
FITC 햄스터 항쥐 CD29 (클론: Ha2/5)BD 바이오사이언스555003유세포 분석 
FITC 햄스터 IgM, & 1 이소형 대조군(클론:G235-1)BD 바이오사이언스553960유세포 분석 
젤라틴 (0.1%)오리셀GLT-11301세포의 접착 능력 향상
IVC 마우스 케이지쑤저우 원숭이 왕 동물 실험 장비 기술 유한 회사HH-MMB-2동물 장벽
L-아스코르브산시그마-알드리치 A8960BMSC 골형성 분화
마크 펜얼룩말 무역(심천) Co., Ltd. YYST5페트리 접시에 셀룰러 정보를 표시하십시오.
MEM 알파 수정 (1X)상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사SH30265세포 배양
마우스 골수 중간엽 줄기 세포 지방 생성 분화 키트CyagenMUXMX-90031BMSC 지방 생성 분화 
Nikon Eclipse Ti2 도립 현미경 Synstem일본 니콘 코포라틴Ti2-U세포를 관찰하고 사진을 찍는다
안과용 가위 상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사Y00030 JZ피부를 자르다
안과용 핀셋상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사BS-ZER-S-100 바이오샤프마우스 뼈 조직을 얻습니다.
파스퇴르 피펫상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사BS-XG-03M배양 배지를 흡인합니다.
PE 쥐 항 마우스 CD31 (클론 : Ha2 / 5)BD 바이오사이언스553373유세포 분석 
PE 쥐 IgG2a, &카파; 아이소타입 컨트롤(클론:R35-95)BD 바이오사이언스553930유세포 분석 
PE-Cyanine7 Ly-6A/E(Sca-1) 단클론 항체(클론:D7)e바이오사이언스25-5981-82유세포 분석 
PE-Cyanine7 쥐 IgG2a 카파 동형대조군(클론:eBR2a)e바이오사이언스25-4321-82유세포 분석 
페니실린-스트렙토마이신상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사2585636세포 배양
PerCP-Cy5.5 쥐 항마우스 CD45 (클론: Ha2/5)BD 바이오사이언스561869유세포 분석 
PerCP-Cy5.5 쥐 IgG2b, &카파; 아이소타입 컨트롤(클론:A95-1)BD 바이오사이언스550764유세포 분석 
메스상하이 의료기기 수술 기구 공장? 그룹?(주) J11010-10# JZ쥐의 등 팔다리와 몸통을 분리하고 뼈에서 외부 조직을 제거합니다.
멸균 후드써모 피셔 테크놀로지(중국)Co., Ltd.에코0.9수술 수술대
멸균 수술용 드레이프허난 Huayu 의료 장비 Co., Ltd.20160900멸균 수술 영역 제공
튜브(50mL)상하이 Baisai, 생명 공학 유한 회사 BLD-BL2002500여과된 세포 용액 보관
트립신-EDTA(0.25%)깁코25200056부착 세포 소화
&베타;-글리세로인산염시그마-알드리치 지5422BMSC 골형성 분화

참고문헌

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  4. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. J Vis Exp. (131), e56750(2018).
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  15. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  16. Abdallah, B. M., et al. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).
  17. Liu, S., et al. Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture. J Transl Med. 17 (1), 23(2019).

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