Method Article

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

DOI:

10.3791/67600

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Abstract

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중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생하고 여러 세포 계통으로 분화할 수 있는 줄기세포 집단입니다. 그 중 골수에서 발견되는 MSC는 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)로 알려져 있으며, 골형성, 조혈 지원, 귀환/이동, 면역 억제에 중요한 역할을 합니다. BMSC는 세포 치료 전략에 대한 잠재력과 쉬운 가용성, 유전적 안정성 및 낮은 면역원성으로 인해 세포 생물학 및 조직 공학 연구에 널리 사용됩니다. 조혈모세포(HSC)와 BMSC는 골수에 공존하지만 뚜렷한 전구세포를 가지고 있습니다. 골수에서 세포를 추출할 때 일반적으로 여러 세포 유형을 얻을 수 있으며, 이는 세포 집단의 이질성을 유발하여 잠재적으로 편향을 유발하고 높은 실험 표준을 충족하지 못할 수 있습니다. 따라서 in vitro에서 BMSC의 균질성과 수율을 개선하기 위한 효과적인 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 이 연구는 BALB/c 마우스에서 얻은 BMSC의 정제, 확장 및 유세포 분석 기반 표현형에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 제3 계대 BMSC의 균질성 및 줄기세포 표현형을 유세포 분석을 사용하여 특성화하여 CD29, CD44 및 Sca-1에 대한 양성, CD45 및 CD31에 대한 음성성을 입증하고 골형성 및 지방형성 분화 능력을 확인했습니다. 이 비용 효율적인 프로토콜은 증식 및 분화 가능성이 높은 균질한 BMSC를 충분히 얻을 수 있는 쉽고 효율적인 방법을 제공하며, 이는 마우스 모델 및 광범위한 전임상 연구의 연구를 진전시키는 데 필수적입니다.

Introduction

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골수 중간엽 줄기세포(BMSC)는 다능 특성으로 알려져 있으며 자가 재생, 분화 및 면역 조절 특성으로 인해 다양한 질병 치료에 널리 사용됩니다 1,2. BMSC는 쉽게 구할 수 있고, 광범위한 증식이 가능하며, 면역억제 특성을 나타내고, 즉각적인 면역 반응을 유발하지 않기 때문에3 조직 공학 응용 분야 및 세포 치료를 위한 효과적인 운반체에 매력적입니다.

골수에서는 두 개의 주요 줄기세포 집단과 그 자손인 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)와 BMSC가 주요 거주자입니다4. 전통적으로 BMSC는 표적 골수 흡인을 통해 얻어지며 in vitro에서 플라스틱 부착 세포로 식별됩니다. 그러나 이 방법은 BMSC를 내피 세포, 주피 세포, 백혈구 및 조혈 줄기 세포를 포함한 다른 골수 하위 집단과 구별하기에는 충분하지 않습니다5. 따라서 BMSC의 분리를 위한 쉽고 효과적인 프로토콜이 필요합니다.

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Protocol

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동물 취급은 상하이 중국 전통 의학 대학의 실험실 동물 윤리 지침(윤리 승인 번호: PZSHUTCM2211070009)에 따라 승인되었습니다. 이 연구에는 8주 된 암컷 BALB/c 마우스(SPF 등급, 체중 20± 1g)가 사용되었습니다. 이 프로토콜은 정제, 계대측정, 유세포 분석 기반 표현형, 마우스 유래 BMSC의 골형성 및 지방형성 분화를 간략하게 설명합니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 취급

  1. 특정 병원체가 없는(SPF) 조건의 마우스를 개별적으로 환기가 되는 케이지에 수용하며, 케이지당 5마리의 마우스가 있습니다. SPF 등급의 사료와 멸균수를 제공합니다. 12시간의 라이트/다크 주기를 유지합니다.
    참고: 이 방법은 테스트를 거쳐 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 균주 모두에서 실현 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 이 논문에서는 주로 BALB/c를 예로 사용합니다.

2. 쥐 뒷다리에서 대퇴골과 경골 채취

  1. CO2 질식 후....

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Results

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마우스 유래 BMSC를 분리하고 약 2주 동안 배양하여 제3 계대(P3) BMSC를 생성했습니다(그림 3). 그림 3A에서 볼 수 있듯이, 골수에서 갓 추출한 세포는 눈에 보이는 지방 방울이 있는 단핵 상태로 남아 있었습니다. 배양 접시에 방추형 세포가 나타나 5일 배양일에 60%-80% 농도에 도달했습니다(그림 3B, C). P1-P3(그림 3D-F)에서 BMSC는 긴 방추체 또는 방추형 모양을 나타내며 단층으로 성장하고 세포 식민지 네트워크를 형성했습니다. 세포는 일반적으로 세포질이 맑고 세포사멸의 눈에 띄는 징후가 없는 적절한 간격을 유지했으며 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

줄기세포 치료는 재생 의학에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 전임상 연구는 줄기세포, 특히 BMSC의 임상적 적용을 뒷받침하는 상당한 증거를 제공했다13. 그러나 낮은 세포 수율, 오염 및 느린 성장과 같은 문제로 인해 임상 적용이 방해를 받고 있습니다. 따라서 세포 수율과 기능을 향상시켜 임상적 사용을 확대하기 위해 BMSC 제제 공정의 표준화에 초점을 맞춘 연구가 시급히 필요합니다2.

이 방법은 BMSC의 분리 및 배양에 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 첫째, 어떠한 조작도 없이 5일 동안 연속 배양을 유지함으로써 갓 분리된 골수 세포의 교란을 최소화하여 조혈 세포가 BMSC의 영양 및 유지를 지원할 수 있도록 했습니다. 또한 BMSC를 정제하기 위해 매체 변화 및 연속 파시징과 같은 기술을.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600)과 중국 국가자연과학재단(82174408 및 82374477)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1mL 주사기(22G 주사기 바늘)친절한 그룹(KDL)60017031
1단계 NBT/BCIP 피어스 바이오테크놀로지, Inc.34042알칼리성 포스파타제 염색
10% 중성 완충 포르말린웩시스5200250세포 고정
6-웰 플레이트랩셀렉트11110세포 배양
24웰 플레이트랩셀렉트11310세포 배양
40 & 무; m 셀 스트레이너코르니그352340응집물을 제거하기 위한 여과
50mL 주사기친절한 그룹(KDL)60017040
75% 에탄올 상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사31009001쥐의 피부 소독
알리자린 레드 S시그마-알드리치 A5533칼슘 침전물 및 석회화된 결절 검출
APC CD44 단클론 항체 (클론:IM7)e바이오사이언스17-0441-82유세포 분석 
APC 쥐 IgG2b 카파 아이소타입 대조군(클론:eB149/10H5)e바이오사이언스17-4031-82유세포 분석 
오토 클레이 브일본 히야마 주식회사HVE-50멸균 수술 기구
CO2 인큐베이터써모 피셔 테크놀로지(중국)Co., Ltd.300583057세포 배양
Cytoflex 유량 측정베크만 쿨터 A00-1-1102유세포 분석 
덱사메타손시그마-알드리치 디4902BMSC 골형성 분화
접시(100 mm)코 닝430167세포 배양
접시(60 mm)코 닝430166이식 중 샘플 배치 
소독 화장상하이 홍룡 산업 Co., Ltd.20230627쥐의 피부 소독
일회용 멸균 장갑상하이 홍룡 산업 유한 회사YT21131멸균 작동
더블 라이언 방사선 조사 설치류 다이어트쑤저우 Shuangshi 실험 동물 사료 기술 Co., Ltd.GB 14924.3동물 사료
태아 소 혈청 상하이 바이오선 과학 및 테크(주)BS-0002-500세포 배양
FITC 햄스터 항쥐 CD29 (클론: Ha2/5)BD 바이오사이언스555003유세포 분석 
FITC 햄스터 IgM, & 1 이소형 대조군(클론:G235-1)BD 바이오사이언스553960유세포 분석 
젤라틴 (0.1%)오리셀GLT-11301세포의 접착 능력 향상
IVC 마우스 케이지쑤저우 원숭이 왕 동물 실험 장비 기술 유한 회사HH-MMB-2동물 장벽
L-아스코르브산시그마-알드리치 A8960BMSC 골형성 분화
마크 펜얼룩말 무역(심천) Co., Ltd. YYST5페트리 접시에 셀룰러 정보를 표시하십시오.
MEM 알파 수정 (1X)상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사SH30265세포 배양
마우스 골수 중간엽 줄기 세포 지방 생성 분화 키트CyagenMUXMX-90031BMSC 지방 생성 분화 
Nikon Eclipse Ti2 도립 현미경 Synstem일본 니콘 코포라틴Ti2-U세포를 관찰하고 사진을 찍는다
안과용 가위 상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사Y00030 JZ피부를 자르다
안과용 핀셋상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사BS-ZER-S-100 바이오샤프마우스 뼈 조직을 얻습니다.
파스퇴르 피펫상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사BS-XG-03M배양 배지를 흡인합니다.
PE 쥐 항 마우스 CD31 (클론 : Ha2 / 5)BD 바이오사이언스553373유세포 분석 
PE 쥐 IgG2a, &카파; 아이소타입 컨트롤(클론:R35-95)BD 바이오사이언스553930유세포 분석 
PE-Cyanine7 Ly-6A/E(Sca-1) 단클론 항체(클론:D7)e바이오사이언스25-5981-82유세포 분석 
PE-Cyanine7 쥐 IgG2a 카파 동형대조군(클론:eBR2a)e바이오사이언스25-4321-82유세포 분석 
페니실린-스트렙토마이신상하이 NianYue 생명 공학 유한 회사2585636세포 배양
PerCP-Cy5.5 쥐 항마우스 CD45 (클론: Ha2/5)BD 바이오사이언스561869유세포 분석 
PerCP-Cy5.5 쥐 IgG2b, &카파; 아이소타입 컨트롤(클론:A95-1)BD 바이오사이언스550764유세포 분석 
메스상하이 의료기기 수술 기구 공장? 그룹?(주) J11010-10# JZ쥐의 등 팔다리와 몸통을 분리하고 뼈에서 외부 조직을 제거합니다.
멸균 후드써모 피셔 테크놀로지(중국)Co., Ltd.에코0.9수술 수술대
멸균 수술용 드레이프허난 Huayu 의료 장비 Co., Ltd.20160900멸균 수술 영역 제공
튜브(50mL)상하이 Baisai, 생명 공학 유한 회사 BLD-BL2002500여과된 세포 용액 보관
트립신-EDTA(0.25%)깁코25200056부착 세포 소화
&베타;-글리세로인산염시그마-알드리치 지5422BMSC 골형성 분화

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  2. Huang, S., et al.

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Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsMesenchymal Stem CellsFlow CytometryCell PurificationCell ExpansionMouse Bone MarrowCell PhenotypingCD29 MarkerCD44 MarkerSca 1 Marker

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