방법 논문

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

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DOI:

10.3791/67606

⸱

2025년 1월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

쥐 생체 내 모델은 허혈성 뇌졸중의 병리학적 메커니즘과 치료 표적을 조사하는 데 필수적인 도구입니다. 이 연구는 쥐의 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 후 경색된 뇌 절편에서 면역형광 염색을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 대부분의 뇌졸중 사례는 허혈성이며 중대뇌동맥(MCA)의 폐색으로 인해 발생합니다. 허혈성 뇌졸중 치료를 위한 현재의 약리학적 접근법은 제한적이다. 따라서 뇌졸중 후 허혈성 손상에 대한 효과적인 신경 보호를 제공하는 새로운 치료법이 시급히 필요합니다. 허혈성 뇌졸중 후 뇌 조직에서 허혈성 반그늘 부위는 회복할 수 있지만 돌이킬 수 없는 손상으로 진행될 위험이 있습니다. 경색된 코어를 둘러싼 반그늘 영역은 신경 보호의 개념적 표적입니다. 반그늘 부위에서는 혈류가 부분적으로 유지되기 때문에 이 부위의 신경 세포와 비신경 세포는 뇌졸중 후에도 일시적으로 생존하며, 아직 생존 가능한 이 세포는 적절한 의학적 개입에 의해 구제될 수 있습니다. 허혈성 반그늘에서 활성화된 세포 사멸 경로가 RUNX1 및 카텝신과 같은 치료 표적을 나타낼 수 있기 때문에 반그림자의 병태생리학을 이해하는 것은 신경 보호 요법의 개발에 중요합니다. 프로그래밍된 세포 사멸의 매개체로 기능하는 이러한 단백질 표적은 중개 연구에서 추가로 활용될 수 있습니다. 적당한 크기와 인간 뇌와 유사한 MCA 폐색(MCA occlusion)의 생체 내 쥐 모델은 인간의 허혈성 뇌졸중을 모방하고 반추 병리학을 조사하고, 세포 사멸 신호를 검사하고, MCAO의 맥락에서 잠재적 표적의 영향을 평가할 수 있는 적용 가능한 도구를 제공합니다. 여기에서는 쥐에서 MCAO를 유도하는 방법과 MCAO 후 쥐의 뇌에서 세포 사멸 신호를 감지하기 위해 면역형광 염색을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

서론

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다1. 뇌졸중으로 인한 높은 사망률과 이환율은 엄청난 공공 보건 부담과 심각한 사회 경제적 결과를 초래합니다. 뇌졸중 발병률과 사망률은 안정적으로 유지되고 있지만, 뇌졸중 환자와 뇌졸중 관련 사망자 수는 수십 년에 걸쳐 증가하고 있다 2,3. 뇌졸중은 허혈성 또는 출혈성으로 분류할 수 있습니다. 뇌졸중 사례의 대다수는 주대뇌동맥의 폐색으로 인한 허혈성 뇌졸중이다4. 현재까지 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)는 허혈성 뇌졸중에 대해 FDA가 승인한 유일한 약물이지만, 좁은 치료 범위, 합병증 및 금기 사항으로 인해 적용이 크게 제한되어 있습니다 5,6,7. 따라서 뇌졸중의 영향을 완화하기 위해 치료 창을 넓힌 새로운 치료 옵션을 개발하는 것이 시급합니다.

실험적 동물 모델은 허혈성 뇌졸중의 병태생리학을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 대부분의 인간 환자에서 허혈성 뇌졸중은 중대뇌동맥(MCA)이 막혀 발생합니다8. 따라서 중대뇌동맥 폐색(MCAO)의 설치류 모델은 인간의 뇌경색과 유사하게 개발되었습니다. 소동물 연구에서 사용되는 몇 가지 MCAO 접근법이 있지만, 가장 널리 사용되는 방법은 외부 또는 내부 경동맥에서 중대뇌동맥으로 나일론 필라멘트를 삽입하여 혈류의 일시적 또는 영구적 폐색을 초래하는 내강내 봉합사 모델입니다 4,9. 이 모델은 많은 양의 뇌경색으로 이어지며 면역형광 기술로 경색된 뇌 조직의 세포 사멸 신호를 검사할 수 있습니다.

반그늘(penumbra)이라고 하는 경색된 코어를 둘러싼 영역은 잠재적인 뇌졸중 치료의 대상입니다10,11. 반그림자의 혈류가 부분적으로 유지되기 때문에 이 부위의 손상된 뉴런과 비뉴런 세포는 세포 사멸 신호의 활성화를 억제함으로써 구제될 수 있습니다. 세포 사멸 경로를 표적으로 하는 것은 뇌졸중 후 신경 보호를 위한 유망한 전략이 될 수 있다12. 따라서 세포 사멸 신호를 평가하는 것은 뇌졸중 실험 연구에서 매우 중요합니다. 최근에는 리소좀 프로테아제(lysosomal protease)인 카텝신-B(cathepsin-B)가 뇌졸중 후 프로그래밍된 세포 사멸을 매개하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 신경학 분야에서 상당한 주목을 받고 있다13. 카텝신-B는 추가 연구가 필요한 신경 보호의 잠재적 표적입니다.

이 기사는 쥐에서 내강 내 봉합사 접근법을 사용하여 MCAO를 유도하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5-트리페닐테트라잘륨 클로라이드(TTC) 염색을 수행하여 경색 크기를 측정하고 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP TUNEL(nick-end labeling) 염색을 사용하여 세포사멸 세포를 검출하는 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

이 프로토콜과 여기에 보고된 실험은 쓰촨 대학 의료 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물의 보살핌과 사용은 지역 및 국제 윤리 기준을 준수했습니다.

참고: 이 연구에는 체중이 250-280g인 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 사용되었습니다. 쥐는 표준 환경 조건(20-22°C 온도, 12시간 명/암 주기)에서 사육되었으며 표준 쥐 분유 식단과 고순도 물을 먹였습니다. 수술 절차는 멸균 상태에서 수행되었습니다.

1. MCAO의 쥐 모델

  1. 1L/분에서 산소와 함께 4% 이소플루란을 사용하여 초기 마취를 유도합니다. 발 꼬집음으로 마취 깊이를 모니터링합니다. 마취가 이루어지는 동안 건조를 방지하기 위해 안구 연고를 투여합니다. 쥐에게 식염수 1mL를 피하주사로 주입하고 수술 전 진통제를 위해 5mg/kg 카프로펜과 0.1mg/kg 부프레노르핀을 주사합니다. 처음에는 이소플루란을 3.5%로 줄인 다음 수술 내내 점차적으로 2%로 줄입니다.
  2. 쥐를 누운 자세로 놓고 직장 온도 모니터 프로브가 있는 조절된 열 매트에서 체온을 36.5 ± 0.1 °C로 유지합니다. 요오드 소독액으로 목 피부를 면도하고 소독합니다.
  3. 목을 2cm 정도 정중하게 절개하고 연조직을 집어넣어 경동맥 혈관을 드러냅니다. 겸자를 사용하여 우측 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 분리합니다.
  4. 봉합사를 사용하여 근위 우측 CCA를 접합하고 원점에 마이크로 클립으로 오른쪽 ICA 및 ECA를 고정합니다.
  5. 둥근 실리콘 팁으로 코팅된 나일론 모노필라멘트를 작은 절개를 통해 CCA의 내강에 삽입하고 CCA에 매듭을 묶어 나일론 모노필라멘트의 출혈 및 탈락을 방지합니다.
  6. 오른쪽 ICA 마이크로 클립을 열고 실리콘 팁이 MCA의 원점(~18-20mm)을 가릴 때까지 ICA 그루터기를 통해 오른쪽 중대뇌동맥(MCA)에 나일론 모노필라멘트를 삽입합니다.
  7. 나일론 모노필라멘트의 노출된 부분을 잘라내고 목 정중선 절개 부위를 봉합합니다.
  8. MCA를 2시간 폐색한 후 목 절개 부위를 열고 CCA의 매듭을 풉니다. 그런 다음 나일론 모노필라멘트를 빼내어 MCA를 다시 관류합니다. 우측 원위 CCA를 결찰하고 연속 또는 중단된 봉합사로 목 절개 부위를 봉합합니다.
  9. 수술 후, 0.03 mg/kg의 용량으로 8시간마다 피하 주사로 부프레노르핀을 투여합니다. 마취에서 회복하는 동안 온도 조절 가열 매트가 있는 가열된 케이지에서 쥐를 관찰합니다. 먹도록 장려하려면 케이지에 으깬 차우를 곁들인 페트리 접시를 놓습니다. 수술 후 케이지당 한 마리의 쥐를 수용합니다.
  10. 가짜 쥐에게 모노필라멘트 삽입 없이 동일한 절차를 적용합니다.
    참고: 각 그룹에서 총 9마리의 동물이 경색 크기 측정(n = 3), 면역형광 분석(n = 3) 및 세포사멸 검출(n = 3)에 사용됩니다.
  11. 0-5점 척도와 함께 Zea-Longa 행동 평가 척도를 사용하여 MCAO 후 2시간 및 재관류 후 22시간에 신경학적 기능을 평가합니다14. 점수가 0 또는 4인 요율을 제외합니다.

2. 경색 크기 측정(그림 1)

  1. 단두대에 의해 깊은 마취(4% 이소플루란)로 쥐를 제물로 바치고 두개골에서 뇌 전체를 조심스럽게 분리하십시오.
  2. 뇌를 -20°C에서 20분 동안 동결하고 동결된 뇌를 슬라이스 사이에 2mm 거리를 두고 6개의 코로나 슬라이스로 자릅니다. 어두운 곳에서 37°C에서 15분 동안 2% TTC로 뇌 절편을 염색합니다.
  3. 실온(RT)에서 4시간 동안 4% 파라포름알데히드로 뇌 절편을 24시간 동안 고정합니다. 디지털 카메라로 염색된 조각을 촬영하고 클로즈업 물체에 대한 자동 모드 설정을 사용합니다.
  4. 사진을 컴퓨터로 전송하고 ImageJ를 사용하여 경색 크기를 측정합니다. 경색 크기를 6개의 조각에 있는 경색 영역의 합과 동일한 조각에 있는 전체 뇌 영역의 합에 대한 비율로 제시합니다. 데이터를 평균 ± SEM(Standard Error of the Mean)으로 표현합니다.

3. 뇌 동결절제술에 대한 면역형광 분석(그림 2)

  1. 4% 이소플루란과 1L/min 산소로 마취를 유도합니다. 피부와 피하 조직을 절개하여 심장을 노출시킵니다.
  2. 심낭을 제거하고 오른쪽 심방을 작게 자릅니다. 좌심실을 통해 식염수 200mL를 관류한 다음 4% 파라포름알데히드 200mL를 관류합니다.
  3. 두개골을 열고 손상되지 않은 뇌를 제거합니다.
  4. RT에서 24시간 이상 4% 파라포름알데히드로 뇌를 고정합니다. 그런 다음 조직이 가라앉을 때까지 10%, 15% 및 30% 농도의 일련의 자당 용액 구배로 탈수합니다(각 농도에 대해 약 6-8시간).
  5. 뇌를 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 내장하고 기포가 있는 경우 제거합니다. 그런 다음 뇌를 액체 질소에 스냅 얼려 -80°C 냉동고에 보관합니다.
  6. 5μm 두께의 저온 유지 장치를 사용하여 뇌를 절편합니다. 단면 작업 전반에 걸쳐 캐비닛 온도가 -18 °C에서 -20 °C 사이로 유지되는지 확인하십시오. 모델 현장과 실험 조건에 따라 단면 위치에 레이블을 지정합니다. 섹션을 냉동실에 보관하십시오.
  7. 동결된 절편이 RT에서 ~30분 동안 평형을 이루어 면역형광 염색을 수행하도록 합니다. 그런 다음 멸균 PBS로 섹션을 3회 각각 5분 동안 담급니다.
  8. 면역조직화학 펜으로 조직의 윤곽을 그립니다. 20 μg/mL Proteinase K(RNase-free) 및 0.3% Triton X-100을 RT에서 10분 동안 배양합니다.
  9. 멸균 PBS로 절편을 각각 5분 동안 3회 담그십시오. 윤곽이 그려진 조직에 3% BSA를 바르고 차단을 위해 1시간 동안 RT에서 배양합니다.
  10. 차단 후 용액을 제거하고 적절한 1차 항체(Rabbit recombinant monoclonal cathepsin-B antibody, 1:200)를 추가한 다음 4°C의 어두운 곳에서 밤새 절편을 배양합니다.
  11. 1차 항체를 제거하고 0.1% Tween-20 3x를 함유한 멸균 PBS로 각 5분 동안 절편을 세척합니다.
  12. 필요한 형광단과 함께 적절한 2차 항체(Goat Anti-Rat IgG [H+L] [FITC conjugated], 1:200)를 추가하고 RT의 가습 챔버에서 1시간 동안 절편을 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
  13. 2차 항체 배양 후 0.1% Tween-20 3x를 함유한 멸균 PBS로 각 5분 동안 절편을 세척합니다. DAPI가 포함된 장착 매체로 섹션을 더럽히고 커버슬립으로 덮습니다.
  14. 여기 파장 488nm, 방출 파장 520nm, 노출 시간 500ms 설정으로 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 장기 보존을 위해 단면을 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.

4. TUNEL 염색에 의한 세포사멸 검출(그림 3)

참고: TUNEL 염색에는 상업용 TUNEL 분석 키트가 사용됩니다. 이 TUNEL 키트에는 DNase I Buffer 작업 용액, Deoxynucleotidyl transferase(TdT) 평형 완충액, 라벨링 작업 솔루션 및 DAPI 작업 솔루션이 포함되어 있습니다.

  1. 위와 동일한 절차를 사용하여 뇌를 관류 및 분리합니다(단계 3.2-3.3). 고정을 위해 4-4시간 동안 뇌를 4% 파라포름알데히드에 담그십시오.
  2. 뇌를 주부 끝에서 꼬리 끝까지 약 2mm 두께의 관상 조각으로 자르고 4% 파라포름알데히드에 추가로 12시간 동안 담급니다. 고정 후 뇌 조각을 흐르는 물에 1시간 동안 씻습니다.
  3. 탈수를 위해 뇌 조각을 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 농도의 에탄올 용액에 각각 35-50분 동안 순차적으로 담그십시오.
  4. 조직이 완전히 투명해질 때까지 35-50분 동안 TO-type 투명 생물학적 제제 I으로 뇌 절편을 처리한 다음 35-50분 동안 투명화제 II를 처리합니다.
  5. 뇌 절편을 임베딩 배지 I에 60분 동안, 임베딩 배지 II에 60분, 임베딩 배지 III에 60분, 임베딩 배지 IV에 60분 동안 순차적으로 담그십시오.
  6. 뇌 조각을 임베딩 카세트에 넣습니다. 카세트를 밀봉하고 명확하게 라벨을 붙인 다음 응고를 위해 냉장실에 보관하십시오.
  7. 마이크로톰을 초기 두께인 10μm로 설정하여 조직 블록을 다듬습니다. 그런 다음 슬라이싱을 위해 두께를 5μm로 조정합니다.
  8. 수조를 45°C로 가열하고 조직 부분을 물 표면에 띄운 다음 슬라이드에 올려 놓습니다. 약 30초 후 슬라이드를 제거하고 RT에서 건조시킨 다음 건조 상자에 보관하십시오.
  9. 저장된 뇌 부분을 각각 10분씩 2주기 동안 투명화제에 담궈 파라핀화합니다.
  10. 섹션을 다시 수화하려면 무수 에탄올에 5분 동안 담그고 3회 반복합니다. 단면을 90% 에탄올로 3분 동안 옮깁니다. 또한 섹션을 80% 에탄올에 3분 동안 담가둡니다. 마지막으로 단면을 70% 에탄올에 3분 동안 담급니다.
  11. 샘플을 PBS에서 각각 5분 동안 3회 헹굽니다. 여과지를 사용하여 과도한 수분을 부드럽게 제거합니다.
  12. 각 샘플에 100μL의 1x proteinase K 작업 용액을 투여하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 투과화 후 샘플을 PBS에서 각각 5분 동안 3회 헹굽니다.
  13. 양성 대조군을 위한 샘플을 준비합니다.
    1. 투과화된 샘플에 100μL의 1x DNase I Buffer 작업 용액(TUNEL 분석 키트)을 추가하고 5분 동안 RT에서 평형을 이룹니다. 흡수성 종이를 사용하여 샘플에서 과도한 액체를 조심스럽게 제거합니다.
    2. 시료에 100μL의 희석된 DNase I 작업 용액(200U/mL)을 추가하고 37°C에서 10-30분 동안 배양합니다. 샘플을 PBS에서 각각 5분 동안 3회 헹굽니다.
  14. 음성 대조를 위한 샘플을 준비합니다.
    1. 투과화된 샘플에 100μL의 1x DNase I Buffer 작업 용액을 적용하고 RT에서 5분 동안 평형을 이룹니다. 음성 대조군 샘플을 37°C에서 10-30분 동안 DNase I Buffer로 배양하여 DNase I 효소가 첨가되지 않도록 합니다. 샘플을 PBS에서 각각 5분 동안 3회 헹굽니다.
  15. 각 샘플에 100μL의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 평형 완충액(TUNEL 분석 키트)을 적용하고 37°C의 가습 챔버에서 10-30분 동안 배양합니다. 그런 다음 흡수지로 TdT 평형 버퍼를 제거합니다.
  16. 각 샘플에 50μL의 라벨링 작업 용액(TUNEL 분석 키트)을 추가한 다음 37°C의 가습되고 어두운 챔버에서 60분 동안 배양합니다. 신호 강도가 낮으면 DNA 라벨링 반응 시간을 연장하는 것이 좋습니다. 그런 다음 PBS에서 샘플을 각각 5분 동안 3회 헹굽니다.
  17. 과도한 수분을 블로트링한 후 DAPI 작업 용액(TUNEL 분석 키트)을 바르고 암흑 속에서 RT에서 5분 동안 배양하여 핵을 상쇄합니다. 그런 다음 PBS에서 샘플을 각각 5분 동안 4x 헹굽니다. 흡수지로 여분의 액체를 제거하고 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다.
  18. Vectra Polaris 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 염색된 슬라이드를 스캔하고 시스템 소프트웨어로 데이터를 분석합니다.

5. 통계 분석

  1. 실험 결과를 SEM± 수단으로 제시하고 GraphPad Prism 10 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 두 그룹 비교를 위해 학생의 t-테스트로 데이터를 분석합니다.
  2. 0.05보다 작은 p-값을 통계적 차이로 설정합니다.

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결과

쥐는 MCAO 동안 120분 허혈 후 22시간 재관류를 받습니다. MCAO 수술 중 사망률은 미미했으며 재관류 기간 동안 약 25%였습니다. MCAO 그룹에서는 유의미한 뇌 손상이 관찰된 반면, 샴 그룹의 대뇌에서는 경색이 관찰되지 않았다(24.87 ± 1.21% vs. 전체 뇌 영역에 대한 경색 면적의 합 0%; MCAO [n = 3] 대 Sham [n = 3], P < 0.001; 그림 1A,B). MCAO 그룹에서 카텝신-B의 면역반응은 허혈성 핵심(카텝신-B 강도는 샴의 폴드로 나타냄: 1.53 ± 0.02 대 1.00 ± 0.11; 핵심 [n = 3] vs. 샴 [n = 3], P < 0.01; 그림 2A,C) 및 반추 피질(cathepsin-B 강도는 Sham의 폴드로 나타냄: 1.73 ...

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토론

대뇌동맥의 폐색은 산소와 영양의 결핍으로 이어지며, 이어서 활성산소종의 활성화, 세포내 칼슘 과부하, 글루타메이트 방출, 염증 반응 유발로 이어진다15. 이러한 일련의 사건은 경색된 뇌에서 세포를 사멸시키고 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래합니다. 반그림자는 적절한 치료 기간 내에서 의학적 개입을 통해 잠재적으로 구제할 수 있다16. 허혈성 뇌졸중에 대해 유일하게 승인된 치료법은 tPA17을 사용한 혈전용해술 정맥 주사입니다. 그러나 tPA 치료의 적용은 주로 치료 기간이 좁기 때문에(뇌졸중 후 최대 4.5시간) 모든 환자의 최대 5%로 제한됩니다18. 따라서 치료 창을 넓힌 효과적인 치료법을 시급히 개발할 필요가 있습니다.

동물 질병 모델은 허혈성 ...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

Simiao Wu는 쓰촨성 과학기술부(2024YFHZ0330)와 쓰촨성 서중국 병원의 지원을 받았습니다. Weihong He는 쓰촨성 과학기술부(2023YFS0297)와 쓰촨대학교의 지원을 받았습니다. 쓰촨 대학교 중국 서부 병원 연구 핵심 시설의 Yi Zhang과 Yue Li에게 TUNEL 이미징 및 분석에 대한 기술 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris 다중 스펙트럼 이미징 시스템 
무수 에탄올청두 Jinshan 화학 시약 Co.N/A
부프레노르핀서중국 병원N/A
카프로펜서부 중국 병원N/A
카텝신-B 항체AbcamAb214428
CryostatLEICA 라이카 CM 1950
디지털 카메라OLYMPUSTG-7
염소 항쥐 IgG (H + L) (FITC 접합)Elabscience  E-AB-1021
염소 혈청SolarbioSL038
GraphPad Prism 10 소프트웨어N/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
면역조직화학 펜Biosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm 소프트웨어Akoya Biosciences버전 2.6.0다중 스펙트럼 이미징 시스템용 시스템 소프트웨어 
요오도포어 소독액Huatian Technology Industry Co.N/A
이소플루란RWD 생명 과학 주식회사https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
SolarbioS2110를 함유한 마운팅 매체
https://www.rwdstco.com/
최적 절단 온도(OCT) 화합물EprediaN/A
파라포름알데히드BiosharpN/A
인산염 완충액(PBS)SolarbioN/A
프리즘그래프패드 버전 10
Proteinase KTiangenRT403-02
식염수Kelun Co.N/A
Sprague-Dawley 쥐Huafukang Co.N/A
자당BioFroxx1245GR500
수술 기구RWD 생명 과학 주식회사N/A
TO형 투명 생물학적 제제   베이징 솔라바이오 사이언스 & 테크노로지 주식회사http://www.solarbio.net/
트리페닐테트라졸륨 염화(TTC) 용액SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL 키트Elabscience  E-CK-A321
DAPI 나일론 모노필라멘트 RWD Life Science Co.

참고문헌

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