방법 논문

인간의 장내 미생물총(microbiota)에서 C-배당체 대사 효소를 특성화하기 위한 구조 생물학 및 분석 화학 접근법

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DOI:

10.3791/67629

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2025년 5월 23일

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

최근 연구에서는 C-배당체의 대사에서 인간의 장내 미생물총(microbiota) 효소의 역할을 강조하고 있습니다. 여기에서는 분석 화학 기술(LC-MS/MS 및 NMR)을 구조 생물학 접근 방식과 통합하여 이러한 C-배당체 대사 효소의 구조 및 효소 반응 사슬을 체계적으로 특성화하는 포괄적인 방법론을 제시합니다.

초록

장내 미생물총(microbiota)은 숙주 건강의 핵심 조절인자로 부상했으며, 특히 식이 배당체를 대사하는 능력 때문에 더욱 그렇습니다. C-배당체는 O-배당체에 비해 우수한 화학적 안정성과 효소 절단에 대한 내성을 보여주지만, 특수 장내 세균이 이를 선택적으로 대사하여 생체 이용률을 향상시킬 수 있습니다. 미생물 C-글리코시다아제 효소의 확인 이후, 정확한 반응 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았으며 이러한 과정을 연구하기 위한 표준화된 방법론은 아직 잘 확립되지 않았습니다. 이러한 간극을 해소하기 위해 우리는 구조 생물학, 효소학 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 포함한 분석 기술을 결합한 통합 다학제적 접근 방식을 도입하여 이러한 효소 활동을 체계적으로 특성화했습니다. 이 포괄적인 접근 방식을 통해 분자, 효소 및 대사 수준에서 C-배당체 대사의 정확한 특성을 분석할 수 있습니다.

서론

최근 인간 장내 미생물총(microbiota)은 숙주 건강을 지원하는 데 중요한 역할을 한다는 점에서 상당한 주목을 받고 있습니다 1,2. 이러한 미생물 군집은 숙주 유래 화합물을 대사하여 생물학적으로 활성화된 대사 산물을 생성합니다 1,2,3. 예를 들어, 우리의 일상 식단에서 가장 풍부한 천연 화합물 중 하나인 플라보노이드는 주로 O-배당체 또는 C-배당체로 존재하며, 그 자체로는 인간의 장에 잘 흡수되지 않습니다4. 그러나 장내 미생물총(microbiota)은 이러한 배당체를 2차 배당체 또는 아글리콘과 같은 더 많은 생체 활성 유도체로 변환하여 용해도를 줄이고 흡수를 향상시켜 천연 형태에 비해 생체 활성을 향상시킬 수 있습니다 5,6.

역사적으로, O 배당체의 가수분해 기계장치는 광대하게 공부되었다 7,8. C-C 글리코시드 결합을 특징으로 하는 C-배당체는 더 큰 화학적 안정성과 분열에 대한 내성을 나타냅니다 9,10. 그럼에도 불구하고 특정 장내 세균은 C-글리코시드를 탈글리코실화하는 능력을 진화시켰습니다11,12. 1988년, 핫토리(Hattori) 등은 일부 장내 세균이 C-배당체(C-glycosides)에서 글리코실기(glycosyl group)를 제거할 수 있다는 것을 처음으로 입증했다13. 후속 연구에서는 이러한 활성을 수행할 수 있는 최초의 박테리아 균주를 분리하여 C-배당체 절단 메커니즘에 대한 추가 탐색을 가능하게 했습니다14. 그러나 현재까지 제한된 수의 장내 세균 균주와 C-배당체 대사 효소만이 확인되고 특성화되었습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. 최근 연구에 따르면 PUE 균주의 탈당화 푸에라린(daidzein-8-C-glucoside) 효소(DgpA/B/C)는 2단계 과정을 통해 푸에라린을 다이제인과 포도당으로 절단할 수 있습니다.Gfo/Idh/MocA 계열 산화환원효소인 DgpA는 푸에라린을 3''-옥소-푸에라린으로 산화한 다음 DgpB/C 복합체에 의해 매개되는 β제거 반응을 거쳐 아글리콘과 포도당 10을 생성하고, 26. 그럼에도 불구하고, C-배당체 대사 효소, 특히 DgpA/B/C 시스템의 구조적, 기능적 특성은 여전히 불완전하게 이해되고 있으며, 이 분야의 연구를 진전시키기 위해 보다 발전된 방법론, 특히 생물학 및 화학 전략의 통합이 필요하다24.

이러한 간극을 해소하기 위해 당사는 통합된 다학제적 접근법을 사용하여 인간 장내 미생물군 DgpA/B/C 촉매 C-배당체 대사 반응을 조사합니다. 이 반응에서 DgpA는 C- 배당체의 글리코 실 산화를 촉매 한 후, DgpB 및 DgpC는 산화 된 C- 배당체 생성물10 , 26 , 27 을 특이적으로 절단하는 DgpB / C 복합체를 형성합니다. 먼저 DgpA와 DgpB/C의 재조합 발현과 정제를 별도로 수행했습니다. 그런 다음 정제된 DgpA 및 DgpB/C 단백질을 결정화하고 3차원 구조를 X선 결정학에 의해 결정했습니다. 마지막으로, 결합된 LC-MS/MS 및 NMR 분광법27을 통해 수행된 포괄적인 대사 산물 분석을 통해 완전한 DgpA/B/C 효소 시스템을 사용하여 C-배당체 절단 기능을 재구성했습니다. 이러한 접근법을 바탕으로 우리는 DgpA/B/C 효소 시스템에 의해 촉매되는 C-배당체 대사를 연구했습니다.

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프로토콜

1. 단백질 생산 및 정제

  1. 표현식 벡터의 구성
    참고: 이 연구에서는 인간 장내 미생물총( PUE strain)의 DgpA, DgpB 및 DgpC 유전자가 모델 시스템 역할을 합니다. 첫 번째 단계는 발현 플라스미드를 사용하여 해당 재조합 단백질을 생산하는 것입니다.
    1. NCBI에서 DgpA/B/C 유전자 클러스터 염기서열(GenBank: LC422372.1)을 얻습니다. 그런 다음 DgpA/B/C DNA를 상업적으로 합성하고 DgpA, DgpB 및 DgpC 유전자를 변형된 pET-28a 벡터로 개별적으로 복제하여 N-말단 SUMO와 6×His 태그(His-SUMO 태그)28를 가진 표적 단백질을 생성합니다.
    2. 각 DgpA, DgpB 또는 DgpC 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 수용 세포로 변환합니다. 그 후, 37°C에서 50μg/mL 카나마이신으로 LB 배지에서 박테리아를 배양합니다.
    3. 박테리아 밀도(OD600)가 0.6에 도달하면 배지에 0.2mM IPTG를 추가합니다. 박테리아를 16 ° C에서 16 시간 동안 배양합니다.
    4. 4,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 박테리아 배양을 발현하는 DgpA, DgpB 및 DgpC 각각을 원심분리기합니다. 박테리아 배양 1L당 20mL의 버퍼 A(표 1)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
  2. 단백질의 정제
    참고: 고순도의 충분한 양의 재조합 효소는 기능적 특성화 및 구조 생물학 연구에 필수적입니다. DgpB 및 DgpC는 기능성10,26에 대한 안정적인 단백질 복합체(용해 절차 중 자발적으로 DgpB/C 복합체를 형성)를 형성합니다. 그런 다음 DgpA 단백질 및 DgpB/C 복합체의 정제를 수행합니다.
    1. 박테리아 재현탁액에 1mM PMSF를 추가합니다. 1.1.4 단계의 DgpB 및 DgpC 박테리아 현탁액을 함께 혼합한 다음 초음파 세포 교란기를 사용하여 DgpA 박테리아 현탁액 또는 DgpB 및 DgpC 혼합물(기능적 DgpB/C 복합체 형성)을 용해합니다.
    2. 박테리아 용해물을 48,000 x g 에서 4°C에서 40분 동안 원심분리합니다. 단백질을 함유한 상등액을 유지하고 박테리아 펠릿을 버립니다.
    3. 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA) 컬럼을 사용하여 상등액에서 DgpA 또는 DgpB/C 복합체를 정제합니다. ÄKTA 정제기에서 Buffer A 및 Buffer B(표 1)를 사용하여 0 - 50% 이미다졸 농도 구배를 적용하여 결합된 단백질을 용리합니다.
    4. 용출된 샘플 10μL를 5 × 단백질 염료 2μL와 혼합한 다음 수직 전기영동 시스템을 사용하여 220V에서 45분 동안 SDS-PAGE 전기영동을 수행한 다음 Coomassie Blue 염색을 수행하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 향후 사용을 위해 SDS-PAGE 분석을 기반으로 DgpA 또는 DgpB/C 복합체를 포함하는 분획을 수집합니다.
      참고: His-SUMO 태그(17kDa)가 있는 DgpA(44kDa)는 약 61kDa(그림 2D)로 이동하고, His-SUMO 태그(17kDa)가 있는 DgpC(33kDa)는 약 50kDa, His-SUMO 태그(17kDa)가 있는 DgpB(15kDa)는 약 33kDa로 이동합니다(그림 2J)..
    5. 1.2.3단계의 DgpA 또는 DgpB/C 복합체 샘플을 10kDa 분자량 차단 투석막을 사용하여 버퍼 C에 대해 투석하여 이미다졸을 제거하고 유비퀴틴 유사 프로테아제 1(ULP1; 재료 표) His-SUMO 태그를 제거하는 효소29.
    6. 이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Q 컬럼)을 통해 버퍼 C(표 1)에 투석된 단백질 샘플을 로드합니다. 그런 다음 ÄKTA 정제기에서 Buffer C 및 Buffer D(표 1)로 준비된 100mM에서 600mM 범위의 염화나트륨 농도 구배를 사용하여 컬럼에서 결합된 단백질을 용리합니다.
    7. 분자량을 1.2.3단계로 Q 컬럼에서 용리된 DgpA 및 DgpB/C 복합체의 SDS-PAGE 분석을 수행하며, 분자량을 확인합니다: His-SUMO 태그(17kDa), DgpA(44kDa), DgpA의 올리고머 밴드(95kDa 이상)(그림 2E), DgpB(15kDa), DgpC(33kDa), DgpB 및 DgpC의 올리고머 밴드(53kDa 및 95kDa 사이)(그림 2K).
    8. Buffer E(표 1)와 함께 size-exclusion column(SEC)을 사용하여 단백질을 정제합니다. 용리 분획의 단백질을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 수행한 다음 Coomassie Blue 염색을 수행하여 단백질 밴드를 시각화합니다. SDS-PAGE에 의한 분석 후 표적 단백질 DgpA 또는 DgpB/C 복합체를 포함하는 분획을 수집합니다.
      참고: DgpA 대역은 95kDa 이상의 올리고머화된 DgpA 대역에서 약 44kDa에서 보이며(그림 2F), DgpC는 약 33kDa, DgpB는 올리고머화된 DgpB 및 DgpC(53kDa와 95kDa 사이)에서 약 15kDa입니다(그림 2L).
    9. 280nm에서 나노드롭을 사용하여 DgpA 또는 DgpB/C 복합체의 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 한외여과 튜브를 사용하여 DgpA 또는 DgpB/C 복합체를 약 20mg/mL로 농축하고 분취한 다음 액체 질소로 급속 동결합니다. 나중에 사용할 수 있도록 DgpA 또는 DgpB/C 복합체를 -80°C에서 보관하십시오.
  3. 순환 이색성(CD) 스펙트럼 데이터 수집
    참고: DgpA에 의해 촉매된 글리코실 산화는 대사 경로에서 중요한 시작 단계 역할을 하기 때문에 CD 분광법은 DgpA의 적절한 접힘 상태와 2차 구조 무결성을 모두 확인하기 위해 특별히 사용되었습니다. 이러한 구조적 매개변수는 효소 활성과 성공적인 단백질 결정화 모두에 매우 중요합니다.
    1. 1 x PBS 완충액(pH 7.4)을 사용하여 DgpA 단백질을 0.2mg/mL로 희석합니다(표 1).
    2. 1x PBS 버퍼(pH 7.4)를 석영 큐벳에 로드하고 CD 분광계를 사용하여 200 - 260nm에 걸쳐 baseline CD 스펙트럼을 기록하여 2차 구조 및 접힘 상태 차이를 민감하게 감지합니다27.
    3. 버퍼 큐벳을 1.3.1의 단백질 샘플로 교체하고, 200 - 260 nm에 대한 CD 스펙트럼을 기록하고, 버퍼 베이스라인을 빼서 단백질 샘플에 대한 CD 스펙트럼을 얻습니다.
    4. 정확성을 위해 3개의 스캔을 수집하고 2차 구조 특징 및 단백질 접힘 상태에 대한 데이터를 분석합니다(그림 3G, 3H).

2. 단백질 결정학 및 구조 결정

참고: DgpA가 적절한 접힘과 구조적 무결성을 유지한다는 것을 확인한 후 구조 생물학 접근 방식을 사용하여 두 DgpA의 3차원 구조를 결정했습니다. DgpB/C 복합체의 촉매 능력이 이전 기능 분석 10,26,27을 통해 생화학적으로 확인되었기 때문에 CD 스펙트럼 검증 단계는 생략되었습니다.

  1. 단백질 결정 성장 및 최적화
    1. 0.5 μL의 정제된 DgpA(20 mg/mL) 또는 DgpB/C 복합체(20 mg/mL)를 좌식 드롭 방법30에서 48웰 결정판의 결정화 키트에서 동일한 부피의 저장 용액(0.5 μL)과 혼합합니다. 결정 성장을 위해 결정판을 16°C로 옮깁니다.
      참고: 현미경으로 이러한 좌식 방울을 관찰하여 DgpA 또는 DgpB/C 복합 결정 성장에 대한 조건(PEG 3350, 마그네슘 포름산염 등과 같은 단백질 농도 및 침전물 포함)을 식별합니다.
    2. 행잉 드롭 증기 확산 방법30을 사용하여 DgpA 및 DgpB/C 복합체 모두에 대한 결정화 최적화를 수행합니다.
    3. DgpA의 경우, 2.1.1단계(20mM 포름산마그네슘, 20% PEG3350)에서 확인된 상태부터 시작하여 4개의 포름산마그네슘 농도 구배(16mM, 18mM, 20mM 및 22mM)에 대해 6개의 PEG3350 농도 구배(17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%)를 테스트하여 직교 최적화 접근법을 적용합니다30.
    4. 실란화된 유리 커버슬립에서 0.8μL의 DgpA 단백질 용액(10 또는 20mg/mL)과 0.8μL의 저장 용액을 혼합하여 결정화 방울을 준비합니다. 그런 다음 커버슬립을 24웰 결정화 플레이트에 뒤집고 결정 성장을 위해 16°C에서 배양합니다.
    5. DgpB/C 복합체 최적화를 위해 동일한 접근법을 따르십시오: 0.8μL의 단백질 복합체(10 또는 20mg/mL)를 마그네슘 아세테이트(16, 18, 20 또는 22mM) 및 PEG 8000(8%, 9%, 10%, 11%, 12% 또는 13%)을 포함하는 0.8μL의 저장 용액과 혼합합니다. 마찬가지로, 24웰 플레이트 위의 실란화된 커버슬립에 방울을 매달아 놓고 16°C에서 배양합니다.
    6. DgpA 및 DgpB/C 복합체의 단백질 결정이 성장이 멈출 때까지 전체 크기로 성장하도록 한 다음 결정을 16°C에서 30분 동안 DgpA 및 DgpB/C 복합체의 기질 화합물(포도당 및 푸에라린) 5mM와 저장 완충액을 포함하는 담금 용액으로 옮깁니다.
    7. DgpA(포도당 또는 기질 없음) 및 DgpB/C 복합체(기질 없음)를 포함한 결정을 25% 글리세롤이 보충된 담금 완충액을 포함하는 동결 보호 용액으로 옮기고 데이터 수집을 위해 즉시 액체 질소에 보관합니다.
      참고: DgpA와 DgpB/C 복합 결정은 모두 기질(포도당 및 푸에라린)에 담갔지만 포도당만 DgpA의 촉매 중심에 성공적으로 통합되었습니다. 결과적으로, 구조 분석을 위해 세 가지 뚜렷한 결정 형태가 얻어졌습니다 : 포도당을 함유 한 DgpA (그림 3E); 기판이 없는 DgpA(그림 3B-C); 및 기판이 없는 DgpB/C 복합체(그림 3D). 동결 보호 용액은 액체 질소의 급속 냉각 중 얼음 형성을 방지하여 단백질 결정을 보호하여 구조적 무결성을 보존하고 방사선으로 인한 손상을 최소화합니다. 일반적으로 모액을 베이스로 사용하여 제조되는 이 용액에는 최적화된 농도의 동결 보호제(예: 글리세롤 또는 에틸렌 글리콜)가 보충됩니다.
  2. 데이터 수집 및 구조 결정
    1. 입사 파장이 0.978 Å인 상하이 국립 단백질 과학 시설(NFPS)의 상하이 싱크로트론 방사선 시설(SSRF)에서 포도당이 있는 DgpA 또는 기질이 없는 형태의 DgpB / C 복합체에 대한 결정의 X선 회절 데이터를 수집합니다.
    2. 결정학 데이터 처리 소프트웨어(31)를 사용하여 DgpA 및 DgpB/C 복합체를 포함한 3세트의 X선 회절 데이터를 처리합니다. 먼저 원시 데이터를 로드한 다음 소프트웨어에서 해당 버튼을 클릭하여 index, integrate 및 scale 기능을 순차적으로 실행합니다. 후속 구조 결정에 적합한 처리된 출력 파일(output.sca)을 생성합니다.
    3. 분자 대체 방법(Table of Materials)을 사용하여 포도당 또는 기질이 없는 형태(그림 3B-C, 3E) 및 기질이 없는 DgpB/C 복합체(그림 3D)의 구조를 측정합니다. 그런 다음 관련 리간드(예: 포도당, Mn2+, H2O 등)를 통합하여 구조와 전자 지도를 정제합니다.31.

3. 반응 활성 모니터링 및 운동 파라미터 측정

참고 : DgpA / B / C 시스템은 정의 된 2 단계 캐스케이드를 통해 C- 배당체 변환을 매개합니다 : DgpA는 당 부분을 산화시켜 촉매 작용을 시작하여 DgpB / C 복합체가 이후에 절단하거나 이성질화하는 중간체를 생성합니다 10,26,27. 이 연구에서 DgpA/B/C는 이 반응 캐스케이드를 담당하는 효소를 의미하며, DgpA와 DgpB/C 복합체 사이에는 직접적인 상호 작용이 발생하지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 이 결합 활성은 HPLC 산물 분석, 전자 전달을 모니터링하는 DCPIP 결합 분광 광도계 분석 또는 반응 매개 변수의 상세한 동역학 특성화의 세 가지 보완적인 접근 방식을 사용하여 엄격하게 정량화 할 수 있습니다27,32. 구체적으로, DgpA/B/C 촉매에 의해 생성된 C-배당체 절단 생성물(다이드제인)을 HPLC(265nm에서 UV 검출)로 분석했습니다. 제품 형성은 표준 보정 곡선을 사용하여 정량화되었으며(표준 곡선을 설정하는 방법은 3.3.2단계의 주석에 자세히 설명되어 있음), 운동 매개변수는 비선형 회귀 분석을 통해 Michaelis-Menten 모델에 제품 형성 속도를 피팅하여 결정되었습니다27,32. 푸에라린 C-글리코시드 결합 절단에 대한 포도당의 효과를 측정하는 억제 분석은 당류가 DgpA의 기질 역할을 할 수 있다는 확증적인 증거를 제공했습니다. 그 후, DCPIP 분석은 산화된 당33에서 전자를 수용하여 DgpA의 촉매 활성을 반영할 때 청색 2,6-디클로로페놀린도페놀(DCPIP)이 무색 류코-DCPIP로 환원되는 것을 측정하여 당 산화 반응을 모니터링합니다.

  1. HPLC에 의한 DgpA/B/C 활성 모니터링
    1. 20μM DgpA 및 DgpB/C 복합체(단계 1.2.7에서)를 포함하는 500μL의 버퍼 F(표 1) 및 0.1mM: 분할 반응의 경우 푸에라린 또는 게니시스테인-8-C-글루코시드, 또는 이성체화 반응의 경우 daidzin 또는 genistin을 사용하여 DgpA/B/C-촉매 C-배당체 절단 또는 이성체화 반응을 수행합니다27. 37°C에서 8시간 동안 반응을 수행하고 반응 혼합물에 1.5mL의 메탄올을 첨가하여 종료합니다.
    2. 반응 용액을 16,000 × g 에서 15분 동안 원심분리하여 메탄올 유도 효소 변성으로 인해 형성된 단백질 침전물을 제거합니다. 0.22μm 필터 멤브레인을 사용하여 상층액을 여과합니다.
    3. 10μL의 주입 부피와 265nm의 UV 검출 파장으로 1mL/분의 유속으로 그래디언트 용리로 HPLC 분석을 수행합니다.
      참고: 이동상은 아세토니트릴(이동상 A) 및 0.1% 수용성 아세트산(이동상 B)이었으며 구배 용리가 있었습니다. 이동상 용리의 그래디언트는 다음과 같습니다: 0-5분에 5%-20% A, 5-15분에 20%-45% A, 15-18분에 45%-52% A, 18-19분에 52%-55% A, 19-21분에 55%-5% A, 21-23분에 5% A. DgpA/B/C 효소 시스템은 daidzin 및 genistin과 같은 기질에 대해 현저하게 다른 촉매 효율을 나타내므로 각각의 산물 형성 속도에 상당한 차이가 있습니다. 기질 변환 역학 및 제품 축적 역학을 정량적으로 평가하기 위해 HPLC를 사용하여 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 및 48시간 간격으로 포괄적인 시간 경과 분석을 수행했습니다.
  2. 2,6-dichlorophenol indophenol (DCPIP) assay를 사용한 DgpA 활성 모니터링
    참고: DCPIP 분석은 산화된 당에서 전자를 받아들일 때 파란색 DCPIP가 무색 leuco-DCPIP로 환원되는 것을 측정하여 당 산화를 모니터링합니다33. 여기서, DCIPIP 리포터 분석법은 다양한 글리코실화 화합물, 단당류, 이당류 또는 다당류에 대한 DgpA 산화 활성을 기록하는 데 활용되었습니다. 야생형 DgpA 및 D182A, Δ(308-316) 및 Δ(311-316)을 포함한 당 결합 결함 돌연변이가 사용되었다27.
    1. 1x PBS 완충액(pH 7.4)에서 푸에라린, 비텍신, 제니스틴, 수용성 전분, 말토트리오스, 유당, 자당, 포도당 또는 맥아당을 포함한 10mM 기질과 함께 야생형 DgpA 및 3개의 당 결합 결함 돌연변이(DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) 또는 DgpA Δ(311-316))를 포함한 0.8mM DCPIP, 50μM 단백질을 배양합니다.
    2. 반응 20시간 후, 마이크로플레이트 리더33을 사용하여 600nm에서 DCPIP의 흡광도 변화를 기록합니다.
  3. 푸에라린의 C- 글리코시드 결합 절단 반응에 대한 포도당의 억제율 측정
    참고: DgpA는 C-배당체의 당 부분을 산화시킬 수 있는 당 산화환원효소 계열에 속합니다. 그림 3E 는 포도당이 DgpA 촉매 중심에 결합되어 있음을 보여주며, DgpA 구조를 결정하기 위한 프로토콜은 2.2.3단계에 자세히 설명되어 있습니다. 포도당과 C-배당체 푸에라린 사이의 DgpA의 경쟁적 결합을 조사하기 위해 다음 실험을 수행했습니다.
    1. 1 × PBS 완충액(pH 7.4)에서 반응을 수행합니다. 3.1단계에서 설명한 대로 C-배당체(푸에라린) 절단 반응 시스템에 다양한 농도의 포도당(1mM, 5mM, 10mM, 20mM, 50mM, 80mM 및 100mM)을 추가합니다. 37°C에서 12시간 동안 반응을 수행합니다.
    2. 기준 화합물(표준 daidzein)에 대한 HPLC 검량선을 사용하여 제품(daidzein)의 정량 분석을 수행합니다. 먼저 다양한 포도당 농도를 포함하는 반응과 억제되지 않은 C-배당체 절단 반응(포도당 없음) 간의 생성물 수율 차이를 결정한 다음 이 차이를 억제되지 않은 반응의 산물 수율로 나누어 억제율을 계산합니다.
      참고: 정량적 HPLC 분석을 위한 검량선을 생성하려면 농도 범위(예: 0.1-1mM, 0.1mM 단위)에 걸쳐 참조 표준물질(예: puerarin 또는 daidzein)의 연속 희석을 준비합니다. HPLC로 각 농도를 분석하고, 피크 면적을 기록하고, 해당 표준 농도에 대해 표시합니다. 선형 회귀 분석(y = mx + b, 여기서 y = 피크 면적, x = 농도)을 수행하여 표준 곡선을 설정합니다. 그런 다음 회귀 방정식을 사용하여 측정된 피크 영역에서 알려지지 않은 샘플 농도를 보간할 수 있습니다.
  4. 운동 매개변수의 결정
    참고: kinetic parameter는 효소 촉매 효율을 정량적으로 평가하기 위한 중요한 황금 표준물질로 널리 인정받고 있습니다. DgpA/B/C 촉매 반응을 정량적으로 평가하기 위해 DgpA/B/C에 의해 촉매된 C-배당체 푸에라린 절단 반응에 대한 운동 매개변수를 측정했습니다.
    1. DgpA/B/C 촉매 C-배당체 절단 반응을 위한 기질 C-배당체(푸에라린) 농도 구배(0.01 - 4mM 범위, 2배 증가)를 준비합니다.
    2. 단계 3.1에 설명된 방법에 따라 37°C에서 8시간 동안 반응을 수행합니다. 표준 daidzein의 HPLC 검량 곡선을 사용하여 제품(daidzein)의 정량 분석을 수행합니다. 그런 다음 정량화된 양을 반응 시간으로 나누어 반응 속도(제품 형성 속도)를 계산합니다.
    3. 통계 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 계산된 반응 속도와 기질 농도를 Michaelis-Menten 모델에 피팅하여 Km 및 kcat kinetic 매개변수를 결정합니다.

4. 반응 중간 생성물의 준비 그리고 탐지

참고: C-배당체 절단 활성 외에도 DgpA/B/C는 O-배당체에서 C-배당체로의 이성질체화를 촉매합니다. 따라서 O-배당체가 DgpA/B/C의 기질로 사용되는 경우 중간 생성물은 이성질체화된 C-배당체로 생산됩니다. 중간 생성물(푸에라린)을 특성화하기 위해 중간 화합물을 정제한 후 LC-MS/MS 및 NMR 분광법을 포함한 분석 화학 도구를 사용하여 분석했습니다.

  1. DgpA / B / C- 촉매 C- 배당체 이성체화 반응에서 반응 중간 생성물의 준비 27
    1. 위의 단계 3.1에 설명된 프로토콜에 따라 0.2mM O-배당체(daidzin)를 기질로 사용하고 90mL 반응 부피에서 20μM DgpA 및 DgpB/C 복합체를 사용하여 DgpA/B/C 촉매 O-C-배당체 이성체화 반응을 준비합니다.
    2. 그래디언트 용리 전략에서 분취용 HPLC를 사용하여 중간 생성물 C-배당체(푸에라린)를 정제합니다(NOTE).
      참고: 이동상은 아세토니트릴(이동상 A) 및 0.1% 수용성 아세트산(이동상 B)이었으며 구배 용리가 있었습니다. 이동상 용리의 그래디언트는 다음과 같습니다: 0-5분에 5%-20% A, 5-15분에 20%-45% A, 15-18분에 45%-52% A, 18-19분에 52%-55% A, 19-21분에 55%-5% A, 21-23분에 5% A.
    3. 3.3.2단계에서 표준 검량(standard) 검량(calibration) HPLC 곡선을 사용하여 정제된 중간 생성물의 농도를 계산하고, 4.1.1단계에서 90mL 반응 시스템에서 약 6mg의 푸에라린을 얻은 다음, 나중에 사용할 수 있도록 진공 원심 농축기로 정제된 중간 생성물을 건조합니다.
  2. LC-MS/MS를 사용한 반응 중간 생성물의 특성화
    1. 4.1.3단계에서 건조된 중간 생성물을 수집합니다. daidzin 유래 중간체 100μg의 칭량을 측정한 다음 2mL의 메탄올에 용해시켜 최종 농도 50μg/mL를 얻습니다. 13,500 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 하고 LC-MS/MS 분석을 위해 상층액을 수집합니다.
    2. 주입 부피가 5μL인 LC-MS/MS 분석을 위해 4.1.2단계에서 동일한 HPLC 그래디언트 용리 프로그램을 사용합니다.
  3. NMR을 사용한 반응 중간 생성물의 특성화
    1. 1 H 및 13C NMR 분광법에 대해 340 μL의 dimethyl sulfoxide-d 6에서 daidzin 반응에서 정제 된 중간 생성물 4 mg을 용해시킵니다. 기기 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 온도 298K, 심 3회, 펄스 폭 18μs, 이완 지연 1.5초, 48회 스캔, 기타 매개변수는 기본 설정27입니다.
    2. 600MHz NMR 기기를 사용하여 NMR 1H및 13C스펙트럼을 수집합니다.

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결과

에 설명된 절차를 따릅니다. 그림 1, 먼저 DgpA, DgpB 및 DgpC 유전자를 E. coli BL21(DE3) 세포. DgpB와 DgpC는 안정한 효소 복합체(DgpB/C 복합체)를 형성하기 때문에10,26,27,34, 이 두 단백질을 발현하는 세포를 공동 정제를 위해 결합했습니다. 세포 용해 후, 상층액을 48,000 x에서 원심분리에 의해 수집하였다g 4 °C에서 40 분 동안 니켈 친화성 크로마토 그래피를 적용했습니다. 결합된 단백질은 완충액 A(그림 2A, 2

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토론

현재 이 분야에서 C-배당체 대사 효소의 구조적, 기능적 특성은 불분명하며 적절한 연구 방법이 부족합니다 10,24,26. 본 연구는 화학과 생명공학의 결합(Combined chemistry and biotechnology) 40,41,42,43,44,45)의 중요한 장점을 활용하여 구조 생물학, 효소학 및 기타 생명공학 기술을 LC-MS/MS 및 NMR과 같은 화학 기술과 함께 활용하여 C의 구조 및 기능적 특성을 탐구하는 연구 방법론을 제안합니다

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공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 베이징중의대학(BUCM)의 스타트업 기금 프로그램(90011451310011)과 W.M., 코로나19에 대한 긴급 자금 프로그램(1000061223476)과 W.M., 국가전통의학관리국의 혁신팀 및 인재 양성 프로그램(ZYYCXTD-C-202006)과 대학원생을 위한 독립 연구 프로젝트(ZJKT2023012)에서 H.P.의 지원을 받았다. 유익한 토론을 해주신 Wenfu Ma 연구실의 모든 연구실 구성원에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,6-디클로로인도페놀 (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-메르캅토에탄올(β-ME)시그마-알드리치08168
  5 × 단백질 로딩 염료Sangon BiotechC508320
아세트산Shanghai MACKLINA111247
AcetonitrileThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR 분광계BrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
원심분리기 5424REppendorf022620601
Chirascan; 플러스 CD 분광계응용 광물리학Chirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) 유능 세포Thermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
포도시그마-AldrichG8270
GraphPad 프리즘 9GraphPad 소프트웨어버전? Prism 9Km 및 kcat 운동 매개변수 계산
HiLoad Superdex 200pg 분취용 SEC 컬럼Cytiva28989335
HisTrap HP His 태그 단백질 정제 컬럼Cytiva17524802
Q FF 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼Cytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  버전 723
HPLC 컬럼 TC-C18(2), 170Å, 5 &마이크로; m, 4.6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
이소 프로필 β -D-1-thiogalactopyranoside? IPTG)시그마-알드리치PHG0010
유당시그마-알드리치17814
LC-20AT, 고성능 액체 크로마토그래피ShimadzuLC20AT
맥아당시그마-알드리치47288
말토트리오스시그마-알드리치443713
염화망간Shanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
메탄올써모 피셔 과학&무역;? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio 과학 기술N8110
Olympus SZX12 실체 현미경OLYMPUS SZX7
페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)시그마-알드리치P7626 
PhoenixPhoenix 개발팀1.21.2Phenix는 단백질 결정 구조 측정을 위한 포괄적인 소프트웨어 제품군으로, SAD(Single-wavelength Anomalous Dispersion) 및 MR(Molecular Replacement) 방법을 Phaser 소프트웨어와 통합합니다.
준비 고성능 액체 크로마토그래프Waters2545/2998
단백질 결정 스크리닝 키트Hampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
쉐이킹 인큐베이터Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
뱀 가죽&무역; 투석막, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
가용성 전분Sigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 초고속 원심분리기Thermo Fisher Scientific™
SpectraMax i3x 멀티모드 마이크로플레이트 리더분자 장치SpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop 마이크로 볼륨 분광 광도계 사양분자 장치QuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep ColumnWaters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
유비퀴틴 유사 프로테아제 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
초저온 냉동고Thermo Fisher Scientific905GP-ULTS
진공 원심 농축기베이징 JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
당 75006590

참고문헌

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

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