제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴런 커뮤니케이션은 시냅스 전달에 의해 매개되며, 이는 주로 활동 전위(AP)에 대한 반응으로 시냅스 소포(SV)에 저장된 신경 전달 물질의 방출에 의존합니다. SV는 시냅스전 말단에서 국소적으로 재활용되기 때문에 SV 외포작용과 세포내이입의 조정은 지속적인 시냅스 전달에 중요합니다. pHluorin이라고 하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질은 SV 내강을 표적으로 삼아 SV 엑소/세포내이입(SV exo/endocytosis)을 모니터링할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 그러나 pHluorin 기반 프로브를 사용한 AP 기반 SV 재활용을 추적하는 것은 유전적으로 암호화된 프로브와 후속 광학 이미징의 도입이 일반적으로 in vivo 동물 모델 또는 조직 제제에 대해 기술적으로 어렵기 때문에 여전히 in vitro 배양 준비로 제한됩니다. 제브라피시(Zebrafish)는 유전자 조작의 용이성, 광학적 선명도, 빠른 외부 개발 등 유용한 기능을 제공하는 모델 시스템입니다. 최근에는 운동 뉴런 말단에서 pHluorin 표지 프로브를 고도로 발현하는 형질전환 제브라피시를 생성하고, 생체 내에서 형성되는 잘 정립된 시냅스 모델인 신경근 접합부(NMJ)에서 AP 기반 SV 엑소/내포작용(endocytosis)을 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기사에서는 pHluorin 이미징에 적합한 유충 제브라피시 NMJ 제제를 준비하는 방법을 보여줍니다. 또한 이 준비물을 통해 기존의 정립 형광 현미경에서 타임 랩스 이미징이 가능하여 NMJ 기능을 분석하기 위한 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다.
서론
시냅스전 말단의 시냅스 소포(SV)에서 신경전달물질 방출에 의해 매개되는 시냅스 전달은 신경 기능1의 기저에 있는 기본 과정입니다. 초기 연구에서 시냅스 전달은 주로 신경전달물질과 그 수용체에 의해 유발되는 시냅스후 반응을 감지하는 전기생리학적 기술에 의해 측정되었습니다. 그러나 지난 수십 년 동안 시냅스전 기능2을 직접 시각화하는 여러 유형의 이미징 기술이 개발되었습니다. 가장 널리 사용되는 프로브 중 하나는 pHluorin 3,4라고 하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질입니다.
시냅스전 말단에서 시냅스 소포(SV)를 재활용하는 것은 신경전달물질의 지속적인 전달을 위한 중요한 과정이다5. 내강이 일반적으로 산성 pH 6,7로 유지되는 SV의 외세포작용(exocytosis)에 의한 신경전달물질의 방출 후, 세포내이입(endocytosis)에 의해 원....
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프로토콜
모든 동물 시술은 오사카 의과 약학 대학의 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 제브라피쉬는 14시간의 빛에서 10시간의 어두운 주기로 사육되고 유지되었습니다. 배아와 유충은 0.006%의 천일염과 0.01%의 메틸렌 블루를 함유하는 난수에서 28-30°C로 유지하였다. 실험은 수정 후 4-7일(dpf)에 수행되었습니다. 6 dpf 이후 실험을 수행할 때 5 dpf 이후부터 하루에 두 번 물고기에게 먹이를 주는 것이 좋습니다. 각 수유 전에 배지를 교체해야 합니다.
1. 솔루션 준비
- 200mL의 세포외 용액(112mM NaCl, 2mM KCl, 10mM HEPES, 10mM 포도당, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, pH 7.3-7.4)을 준비합니다. 3.5 M NaCl 6.4 mL, 1 M KCl 0.4 mL, 1 M HEPES (pH 7.5) 1 mL, 1 M CaCl2 0.4 mL, 1 M MgCl2 0.2 mL 및 포도당 360 mg을 혼합하고 200 mL에 초순수를 첨가한다. pH가 7.3-7.4 범위를 벗어나면 1M Na....
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결과
절개된 샘플이 심각한 조직 손상 없이 준비되고 자극 전극이 척수에 적절하게 삽입되면 고주파 전기 자극에 의해 강력한 플루오린 반응을 유도할 수 있습니다(그림 4D, E). pre-stimulus baseline fluorescence는 presynapse의 표면에 존재하는 프로브로 인한 것일 수 있습니다. 자극 중 형광의 증가는 프로브가 표면으로 방출되는 것을 반영합니다. 이후의 붕괴는 세포내이입(endocytosis)과 프로브를 함유한 SV의 재산성화를 반영합니다. pHluorin 기반 프로브의 이러한 특성은 다양한 실험 설정 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19의 이전 연구와 잘 일치합니다........
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토론
유충 제브라피시 NMJ는 시냅스 생리학 및 병리학 연구를 위한 새로운 모델 시스템입니다26,31. 뉴런 특이적 방식으로 SpH를 발현하는 형질전환 제브라피시(transgenic zebrafish)가 이미 생성되어 운동 결함17을 보이는 돌연변이의 분석에 사용되었다. Wen et al.17은 WT 대조군 NMJ에서 100Hz에서 1000개의 AP를 자극하는 동안 pHluorin 형광이 약 2배 증가함을 입증했습니다. 대조적으로, VpHalo를 사용한 최근 연구는 20Hz에서 200개의 AP 동안 pHluorin 형광의 3배 이상 증가가 관찰되었음을 보여주었으며, 이는 SpH17,27
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공개 사항
이해 상충은 선언되지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI Grant 18K06882 to F. O.의 지원을 받았습니다. 일본 과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science) KAKENHI 보조금 21K06429 및 24K10020을 Y.E.에
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 40x 침수 대물 | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4ch 중력 흐름 관류 시스템 | ALA | VCPlus-4G | |
| 5x 대물 | 렌즈 Olympus | NPLN5X | |
| Custum 제작 이미징 챔버 | Physiotech | custum 제작 | 우물(하단 직경 1cm, 상단 직경 1.5cm)이 있는 검은색 아크릴 플레이트(직경 10.7cm, 두께 3mm) 약 0.5ml의 퍼퓨세이트. |
| 디지털 I/O 장치 | Arduino | Uno Rev3 | |
| D-Tubocurarine, dichloride, pentahydrate | Sigma | 93750 | |
| Excel | Microsoft | Microsoft Office Professional Plus, 2016 | |
| Fiji/imageJ | , https://imagej.net/ | imageJ, 1.54f | |
| Fine binps | AsOne | 7-562-05 (Dumont #5) | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | IWAKI | IK-PAS-5P | 팁은 최종 직경이 1.5&ndash가 될 때까지 다듬고 불로 연마해야 합니다; 2mm. |
| 유리 페트리 접시 | AsOne | 1-4564-06 | |
| Igor Pro | WaveMetrics | Ver. 6.37 | |
| 인라인 용액 히터 | Warner Instruments | SF-28 | |
| LED 조명 시스템 | X-cyte | XYLIS | |
| 메틸렌 블루 | Wako | 133-06962 | |
| Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | Ver. 2.0.0 | |
| 관류 튜브용 미니 마그네틱 클램프 | Warner Instruments | 64-1553 | |
| 전동 미세 조작기 | Scientifica | PatchStar | |
| 전동 이동식 샘플 플레이트 | Scientifica | MMSP | |
| 피펫 홀더 | Narishige | H-13 | |
| 피펫 풀러 | Narishige | PC-100 | |
| 백금 와이어(φ 0.1mm) | Nilaco | PT-351165 | |
| 백금 와이어(φ 0.5mm) | Niaco | PT-351381 | |
| Scalpel | AsOne | 8-3086-02 (Feather #11) | |
| Scientific cMOS camera | Thorlabs | CC215MU | |
| Sea salt | NAPQO | Instant Ocean | |
| Stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| Stimulus isolater | AMPI | ISO-FLEX | |
| 흡입관 | 워너 인스트루먼트 | ST-3, 64-1406 | |
| 온도 컨트롤러 | 워너 인스트루먼트 | TC-324C | |
| 세타 유리 모세관 | 셔터 기기 | BT-150-10 | |
| 트리카인(MS-222) | TCI | T0941 | |
| 정립 현미경 | 올림푸스 | BX51WI |
참고문헌
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E.
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