본 프로토콜은 미세아교세포의 미세세포세포 파편에 대한 반복적인 자기 자극의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다. 이를 위해 체외 미세아교세포와 미엘린 파편 공동 배양 시스템이 구축되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
중추신경계(CNS)에 상주하는 식세포인 미세아교세포(Microglia)는 손상된 세포, 세포 파편 및 미엘린 잔여물을 제거하여 중추신경계의 무결성과 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 미엘린 파편의 축적은 다발성 경화증, 알츠하이머병, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상을 포함한 다양한 CNS 장애와 관련이 있습니다. 미엘린 파편이 있으면 신경 염증이 악화될 뿐만 아니라 미엘린의 재생 잠재력이 저하됩니다. 그러므로, 식세포작용을 통해 미엘린 파편을 제거하는 미세아교세포의 능력을 향상시키는 것은 유망한 치료 전략을 나타냅니다. 자기 자극은 중추신경계 질환에 대한 혁신적인 치료 방식으로 부상했으며, 미세아교세포 식세포작용을 촉진하고 중추신경계 회복을 지원할 수 있는 잠재력을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다. 미엘린 파편의 미세아교세포 청소에 대한 자기 자극의 효과를 추가로 설명하기 위해 미세아교세포와 미엘린 파편의 공동 배양을 포함하는 체외 실험을 설계했습니다. 공동 배양은 CNS 병리학의 맥락에서 미세아교세포 형성 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 반복적인 자기 자극을 받았습니다.
서론
미엘린(Myelin)은 중추신경계(CNS)에서 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에 의해 생성되는 축삭돌기를 둘러싸고 있는 안정적인 관형 막 구조입니다. 이 수초는 활동 전위1의 빠르고 효율적인 전파를 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 다발성 경화증(MS), 뇌졸중과 같은 다양한 신경 장애와 척수 손상(SCI) 및 외상성 뇌 손상(TBI)을 포함한 외상성 손상은 미엘린 무결성의 상실로 이어질 수 있습니다. 이로 인해 미엘린 수초(myelin sheath)의 붕괴로 인해 미엘린 파편(myelin debris)이 생성되고 수초(myelin structure) 2,3,4에 대한 직접적인 손상이 발생합니다. 미엘린 파편이 쌓이면 재수초화와 기능 회복을 방해할 뿐만 아니라 신경염증을 악화시킬 수 있습니다 5,6. 따라서 미엘린 파편을 효과적으로 제거하는 것은 신경 염증을 ....
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프로토콜
여기서, 3마리의 SD 암컷 쥐(2-3주령)를 사용하여 자당-구배 원심분리에 의해 수초체 파편을 추출했습니다. 모든 쥐는 중국 난징에 있는 난징 의과대학의 동물 핵심 시설에서 구입했습니다(동물 면허: SYXK (Su) 2021-0023). 모든 쥐는 대조 조건 (온도 22 ± 2 ° C, 12 h / 12 h 라이트 / 다크 기간, 55 % ± 5 % 상대 습도)에서 사육되었습니다. 모든 동물 실험은 난징 의과 대학 동물 관리 및 사용 위원회(No. IACUC-1903031 및 No. IACUC-2005001)에 의해 개발되었으며, 고통을 최소화하고 사용되는 동물의 수를 최소화하는 것을 목표로 하였다.
1. 수초(Myelin) 격리
참고: 앞서 설명한 대로 미엘린 파편을 추출했으며 일부 수정이 수행되었습니다27. 모든 단계가 4°C 및 멸균 조건에서 수행되었는지 확인합니다.
- 조잡한 수초의 분리
- 뇌 조직 추출
- 펜토바르비탈(50mg/kg, 복강내 주사)로 마취한 후 발가락 꼬집음 반응으로 마취 깊이를 평가합....
- 뇌 조직 추출
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결과
이 연구에서는 초기에 뇌 유래 미엘린 파편을 추출하고 반복적인 자기 자극을 활용하여 식세포 능력을 향상시켜 BV-2 미세아교세포를 체외 에서 공급했습니다. 그 후, BV-2 미세아교세포를 배양하고 자기 자극 전에 LPS 개입을 실시하여 엄격한 신경학적 검증하에 미세아교세포의 생체 내 상태를 모방했습니다. 그 후, LPS 자극 후 rMS 중재가 적용되었습니다. 세포의 식균작용을 검증하기 위해 IBA-1을 사용하여 미세아교세포를 표지하고 CFSE를 사용하여 미엘린 파편을 표지하는 면역형광을 사용했습니다(그림 1). 면역형광 결과는 대조군에 비해 LPS 그룹에서 포위된 외부 미엘린 파편(CFSE)의 면적과 IBA+/미엘린+ 세포의 수가 모두 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 더욱이, 자기 자극 후, 삼켜진 외부 미엘린 파편의 면적과 IBA+/미엘린+ 세포의 수는 LPS.......
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토론
반복적 자기자극법(rMS)은 인지장애, 알츠하이머병(AD), 뇌졸중, 뇌손상, 척수손상(SCI) 등 다양한 신경 및 정신 질환의 치료에 널리 적용되고 있는 비침습적 신경자극 기법입니다. rMS는 펄스 자기장을 활용하여 뉴런의 막 전위를 조절하여 신경계11 내의 신경 흥분성에 선택적으로 영향을 미칩니다. rMS는 뉴런에 미치는 영향 외에도 미세아교세포 기능을 조절하고 신경염증을 억제하며 중추신경계 미세환경을 개선하는 것으로 나타났습니다19. 이전 연구에서 우리는 손상 부위의 반복적인 자기 자극이 미엘린 파편을 삼키는 미세아교세포의 능력을 크게 향상시키고, 미엘린 파편의 제거를 가속화하며, SCI 쥐의 척수 미세환경을 개선한다는 것을 관찰했다16. 이 현상을 추가로 조사하기 위해 세포 수준에서 미세아교세포작용에 대한 반복적인 자기 자극의 효과를 .......
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공개 사항
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감사의 글
이 연구는 중국 국립자연과학재단(82302877, 82172541), 후난성 자연과학재단(2023JJ30549)의 보조금으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DAPI | Beyotime, 중국 | P0131 | |
| BCA 키트 | ThermoFisher Scientific, 미국 | 23227 | |
| Bv-2 세포 | ATCC | CBP60922 | |
| 세포 배양 12웰 플레이트 | Biofil, 중국 | ||
| 세포 배양 24웰 플레이트 | Biofil, 중국 | ||
| 공초점 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss, 독일 | 800 | |
| 항온 인큐베이터 | ThermoFisher Scientific, 미국 | ||
| CFSE | MedChemExpress, 미국 | HY-158820 | |
| DMEM-배양 배지 | KeyGen, 중국 | KGL1202-500 | |
| FBS | Gibco, 미국 | 16250078 | |
| Iba1 | Abcam, 미국 | ab48004 | |
| 자기 자극 장치 | Yiruide, 중국 | CCY-IA | |
| 자기 자극 코일 | Yiruide, 중국 | ||
| 파라포름알데히드 | BioSharp, 중국 | ||
| PBS | KeyGen, 중국 | KGL2210-500 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco, 미국 | 15140-122 | |
| 자당 | MedChemExpress, 미국 | HY-B1779 | |
| 트립신 | KeyGen, 중국 | KGL2107-100 | |
| 초원심분리기 | Beckman, 미국 | L-100XP |
참고문헌
- Osso, L. A., Hughes, E. G. Dynamics of mature myelin. Nat Neurosci. 27 (8), 1449-1461 (2024).
- Gao, R., et al. Myelin debris phagocytosis in demyelinating disease. Glia. 72 (11), 1934-1954 (2024).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C.
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재인쇄 및 허가
