Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

요약

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

초록

폐는 병원균 및 기타 유해한 환경 자극에 지속적으로 노출되어 손상, 기능 장애 및 질병 발병에 취약합니다. 호흡기 감염, 알레르기, 섬유증 및 암에 대한 마우스 모델을 활용한 연구는 질병 진행 메커니즘을 밝히고 치료 대상을 식별하는 데 매우 중요했습니다. 그러나 쥐의 폐에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 면역 세포와 상피 세포 중 하나를 동시에 분리하는 것보다 두 집단을 분리하는 것을 우선시합니다. 여기에서는 유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류에 적합한 면역 및 비면역 집단 모두에 대한 포괄적인 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 집단에는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 다양한 골수성 세포 부분 집합이 포함됩니다. 이 프로토콜은 기관지폐포 세척과 그에 따른 폐의 팽창을 수반합니다. 그런 다음 폐는 리바아제 혼합물로 분해됩니다. 이 처리 방법은 다양하고 다양한 세포 유형을 유리하게 만들고 필터에 대한 수동 해리가 필요하지 않은 단일 세포 현탁액을 생성하여 세포 생존을 촉진하고 다운스트림 분석을 위해 많은 수의 살아있는 세포를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 또한 naive 및 influenza 감염 폐 모두에서 상피 및 골수성 세포 하위 집합에 대한 게이팅 체계를 정의합니다. 살아 있는 면역 세포와 비면역 세포를 동시에 분리하는 것은 세포 간 누화를 조사하고 건강 및 질병에서 폐 생물학에 대한 더 깊은 이해를 얻는 데 중요합니다.

서론

폐는 기도(airway), 폐포(alveoli) 및 간질(interstitium)로 구성되어 있습니다. 면역 세포와 비면역 세포는 이러한 구획 내에 상주하여 항상성 폐 기능(가스 교환)과 바이러스 감염과 같은 환경적 위협에 대한 숙주 방어에 기여합니다. 크고 작은 기도 또는 기관지와 세기관지에는 상피 세포가 늘어서 있습니다. 이 영역에서 우세한 상피 세포는 곤봉 세포와 섬모 세포(ciliated cell)로, 보호 분자를 분비하고 점액 섬모 청소를 촉진하는 역할을 합니다¹. 폐포는 폐에서 가장 말단에 있는 구조로, 폐포 I형 세포(ATI)와 폐포 II형 세포(ATIIs)의 두 가지 상피 세포 유형이 늘어서 있습니다. ATI는 가스 교환을 담당하고 ATII는 적절한 표면 장력을 보장하기 위해 계면 활성제를 분비하고 재활용합니다 ^2,3. ATII는 자가 재생되며 ATI로 분화될 수도 있는데, 이는 특히^{폐 손상 4} 이후에 중요한 역할을 한다. 또한 ATII는 폐포 틈새에 서식하는 주요 면역 세포 유형인 폐포 대식세포(AM)에 대한 지지 틈새를 제공합....

프로토콜

이 프로토콜은 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침을 준수합니다(보조금 번호: R35GM150816 및 P30DK043351). 8-12주 된 암컷 C57BL/6J 마우스가 실험에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 수컷 마우스에도 적합합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 재료 준비

1. 얼음 위에서 dispase, liberase, DNAse를 포함한 필수 효소를 해동합니다.
2. 다른 필요한 시약을 준비하십시오. 10mL 주사기에 2mM EDTA 5mL를 DPBS로 채우고 27G 바늘로 끼웁니다. 1mL 주사기에 DPBS를 채우고 카테터를 부착합니다.

2. 폐 적출

1. 400-500 mg/kg 및 25-100 mg/kg 케타민/자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 마우스가 풋 패....

결과

성공적인 분해는 90%-95%의 생존율을 가진 약 20-2,500만 개의 세포를 얻을 수 있습니다. 약 25,000개의 계수 구슬이 폐의 8% 분획에 추가되면 구슬은 수집된 이벤트의 1%-3%를 손상시켜야 합니다. singlet에 대한 게이팅 후 세포의 약 90%-95%가 Zombie Aqua 음성(생존력 표시)이어야 합니다(그림 2A, 그림 3A).

CD45⁺ 세포 중 CD64⁺F4/80⁺ 세포는 대식세포로 정의됩니다(그림 2B). 기준선에서 폐에 있는 모든 대식세포의 80%-90%는 AM(Siglec-F⁺CD11c⁺)으로 정의되고 나머지는 IM(Siglec-F-CD11c^-)으로 분류.......

토론

이 프로토콜은 90%-95%의 생존율로 마우스당 약 2,0-2,500만 개의 세포를 분리하는 마우스 폐 소화를 간략하게 설명합니다. 또한 추가 분석을 위해 BALF를 수집할 수 있습니다. 그 결과로 생성된 세포 현탁액은 염기서열분석 또는 세포 배양을 위해 세포를 분리하기 위한 유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류를 포함한 여러 실험실 기술과 호환됩니다. 간단히 말해서, 관류 후 BALF가 수집되고 폐가 디스파제로 팽창됩니다. 그런 다음 폐를 잘게 썰어 리버라제/DNase 용액에서 소화합니다. 용해 및 여과 후에는 인플루엔자 바이러스 감염 중 골수성 및 상피 부분 집합의 유세포 분석 분석을 포함한 다운스트림 응용 프로그램을 진행할 수 있습니다.

BALF를 회수할 수 없거나 폐가 제대로 팽창된 상태로 유지되지 않는 경우 카테터가 잘못 배치되었기 때문일 수 있습니다. 카테터가 기관/기관지에 너무 깊숙이 삽입되면 조직을 뚫고.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
슬립 팁이 있는 1mL 주사기	VWR	BD309659
1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브	DOT Scientific	RN1700-GMT
10mL 피펫(일회용)	Fisher Scientific	12-567-603
BD Luer-Lok Tip이 있는 10mL 주사기	VWR	75846-756
123 count eBeads 계수 비드	Thermo Scientific	01-1234-42
12채널 피펫 (30-300ul)	USA Scientific	7112-3300
16% 파라포름알데히드	VWR	100503-917
23 G 바늘과 일반 베벨	VWR	305194
27 G 바늘과 일반 베벨	VWR	BD305109
5 mL 피펫 (일회용)	Thermo Fisher Scientific	170373
50 mL 원심분리 튜브	Olympus	28-108
96-웰 라운드 바닥판	Corning	3797
ACK 용해 버퍼	Gibco	A100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11c	BioLegend	117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal 항체 (PE (Phycoerythrin)/Cy7)	BioLegend	123114
APC anti-mouse CD64 (Fcγ RI)	BioLegend	139306
APC/Cyanine7 안티 마우스 CD45	BioLegend	103115
BD Insyte Autoguard 차폐 IV 카테터	VWR	381423
Brilliant Violet 421 안티 마우스 I-A/I-E (MHC-II)	BioLegend	107632
Brilliant Violet 421 안티 마우스/인간 CD11b	BioLegend	101235
Brilliant Violet 605 안티-마우스 Ly-6C	BioLegend	128036
Brilliant Violet 711 안티-마우스 CD45	BioLegend	103147
C57BL/6J 마우스	Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) 단클론 항체 (APA5), PE-Cyanine7, eBioscience	Life Technologies	25-1401-82
CD170 (Siglec F) 단클론 항체 (1RNM44N), PE	Life Technologies	12170280
세포 여과기	Corning	352350
원심분리기	Eppenodorf	원심분리기 5910R
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I (DNase)	Millipore Sigma	DN25-100MG	-20 °에 저장된 원액으로 DPBS에서 20 mg/mL로 재구성; C
Dispase	VWR	76176-668	한 번 해동하고 -20°C에서 1mL 부분 표본으로 보관; C
해부 겸자(Dumont #7)	정밀 과학 도구	11297-00
해부 가위	정밀 과학 도구	14060-09
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
eBioscience 고정 키트	Life Technologies	00-5523-00
EDTA	Life Technologies	AM9260G
에탄올	VWR	TX89125170HU
FBS	GeminiBio	100-106	한 번 해동하고 -20 °C에서 분취액으로 장기 저장 전에 열 비활성화됩니다. C
FITC 안티-마우스 CD31 항체	BioLegend	102406
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
유리 슬라이드	Fisher Scientific	12-552-3
졸업 저수지	USA Scientific	1930-2235
아이스 버킷	코닝	432128
케타민 하이드로콜로라이드 주사(100mg/mL)	데크라		케타민과 자알라진 안락사 혼합물은 30mg/mL 케타민 염산염 및 4.5mg/mL 자일라진을 최대 1개월 동안 멸균 DPBS로 보관할 수 있습니다.
Liberase	Millipore Sigma	5401119001	-20°C에서 저장 용액으로 DPBS에서 5mg/mL로 재구성;
C 96웰 플레이트용 뚜껑	Fisher Scientific	07-201-731
오비탈 인큐베이터 셰이커	Barnstead Lab-Line	SHKE4000
p1000 피펫	Eppenodorf	3123000063
p1000 팁	USA Scientific	1122-1830
p200 피펫	Eppenodorf	3123000055
p200 팁	USA Scientific	1110-1700
PE 안티-마우스 CD326 (Ep-CAM)	BioLegend	118206
PerCP/Cyanine5.5 안티-마우스 CD104 항체	BioLegend	123614
PerCP/Cyanine5.5 안티-마우스 Ly-6G	BioLegend	127616
Pipet-Aid	Drummond	4-000-101
정제된 안티 마우스 CD16/32	BioLegend	101302	텍스트에서 "Fc 블록"으로 언급
스프레이 병	VWR	23609-182
봉합사 (크기 2-0)	VWR	100190-026
언더패드	VWR	56617-014
Xysed (자일라진 100mg/mL)	Pivetal		위의 케타민 하이드로콜로라이드 노트를 참조하십시오.
좀비 아쿠아 고정식 생존 가능성 키트	BioLegend	423102

은 됨