Method Article

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

DOI:

10.3791/67656

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 발현을 이해하는 것은 세포 기능을 해독하는 데 필수적입니다. 그러나 주어진 조직 내에서 수많은 유전자의 in situ 발현을 분석하는 방법은 여전히 제한적입니다. 여기에 설명된 EASI-FISH 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 손상되지 않은 성인 초파리 중추신경계(CNS)에서 수십 개의 유전자 발현을 검출하도록 조정되었습니다. 이 프로토콜에는 겔 견고성을 향상시키는 새로운 겔 제형이 포함되어 있어 여러 차례의 혼성화를 가능하게 하고 겔당 여러 뇌를 내장할 수 있습니다. 이러한 개선은 처리량을 증가시키고, 실험 조건의 최적 비교를 용이하게 하며, 시약 비용을 절감합니다. 또한 녹색 형광 단백질(GFP)의 공동 검출을 위해 GAL4-UAS 시스템을 사용함으로써 특정 신경 세포 또는 신경교세포 유형에서 유전자 발현을 시각화할 수 있습니다. 특히, 확장 현미경 검사를 통해 달성된 고해상도와 이 방법의 감도가 결합되어 단일 RNA 전사체를 검출할 수 있습니다. 이 접근 방식은 높은 이미지 품질과 높은 처리량을 효과적으로 통합하여 손상되지 않은 파리 뇌 전체에서 유전자 발현을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH는 40여 년 전 초파리에서 다염색체의 유전자를 매핑하기 위해 처음 사용되었습니다1,2. 오늘날 단일분자 FISH는 온전한 조직에서 mRNA 전사체를 공간적으로 국소화하고 정량화하기 위한 황금 표준입니다3. 그러나 샘플 무결성 및 RNA 손실 문제로 인해 초파리의 전체 마운트 단일 분자 FISH 기술은 동일한 샘플에서 분석할 수 있는 몇 개의 유전자로만 제한되었습니다4,5,6,7. 최근 바코드(예: 8,9,10)의 개발로 인해 두꺼운 조직에서도 검출할 수 있는 전사체의 수가 최대 수백 개까지 증가했지만11,12, 이러한 프로토콜의 수립에는 상당한 리소스 투자가 필요하며, 이는 구현에 장애물이 될 수 있습니다. 실제로, 많은 독창적인 공간 전사체 기술은 원산지 기관을 넘어 확산되지 않았습니다13. 그러므로, 온전한 동일한 뇌에서 수십 개의 유전자 발현을 검출하는 간단하고 비교적 저렴한 방법은 RNA 염기서열 분석 및 세포 아틀라스 데이터의 검증, CNS 전반에 걸친 분자 세포 유형 매핑, 유전자 발현의 발달, 성별 또는 종 특이적 차이의 정량화, 또는 초파리에서 사용할 수 있는 다양한 유전적 또는 환경적 교란에 의해 유도된 유전자 발현의 변화 측정과 같은 다양한 연구 목적을 촉진할 수 있습니다.

확장 현미경은 연구원들이 팽창 가능한 하이드로겔로 조직을 확장하여 더 높은 해상도로 조직을 관찰할 수 있도록 하는 기술입니다14. EASI-FISH는 팽창 현미경과 RNA FISH15를 결합하여 올리고 프로브 결합16을 검출하는 비효소 기술인 혼성화 연쇄 반응(HCR)을 활용합니다. EASI-FISH는 쥐의 측면 시상하부17의 두꺼운(300μm) 조직 절편에서 수십 개의 유전자의 발현 패턴을 매핑하기 위해 얇은 조직 FISH에 대한 대안적 접근 방식으로 처음 개발되었습니다. 이 방법은 이 조직의 두께가 300μm 미만이고 프로토타입 플라이 EASI-FISH 프로토콜이 최근에 설명되었다는 점을 감안할 때 성인 파리 뇌에 적용하기에 이상적입니다18. 여기에서 절개 및 고정된 초파리 뇌는 팽창성 하이드로겔에 내장되어 있으며, 여기서 mRNA와 단백질은 각각 알킬화제인 Melphalan-X 및 Acryloyl-X(Ac-X)와 함께 겔 폴리머에 공유 결합되어 있습니다. 뇌의 등방성 확장을 가능하게 하는 단백질 분해 후, 유전자 특이적 DNA 올리고 프로브는 관심 전사체를 찾기 위해 조직의 mRNA에 혼성화됩니다. 그런 다음 형광 태그가 지정된 DNA 헤어핀을 두 번째 혼성화 단계에서 추가합니다. 여러 hairpin 분자가 HCR 반응에서 중합되어 메타 안정 DNA 중합체를 형성합니다. 이는 개별 전사체에 대한 신호의 증폭으로 이어지며, 이는 광시트 또는 컨포칼 현미경으로 밝은 점으로 검출될 수 있습니다.

겔 형성 후 mRNA와 단백질을 겔 매트릭스에 공유 결합하고 단백질을 단백질 분해하면 mRNA 전사체가 상대적으로 안정적이고 프로브 결합에 더 쉽게 접근할 수 있는 환경이 만들어집니다. mRNA와 겔의 안정성으로 인해 라운드 사이에 효소 DNase1로 배양하여 DNA 프로브 및 HCR 생성물을 벗겨내15,17. 또한 샘플의 확장은 분자 탈군집화를 통해 자가형광 및 광 산란을 줄이고 이미지 해상도를 효과적으로 증가시킵니다14. 따라서 개별 mRNA 전사체를 보다 쉽게 분리할 수 있습니다.

GFP는 형광 또는 팽창 후 항체 결합으로 검출할 수 있을 만큼 절차를 충분히 유지합니다. 따라서 이 리포터는 관심 있는 세포 유형을 표시하고 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 사용 가능한 많은 뉴런 특이적 split-GAL4 드라이버 라인(예: 19,20)과 함께 사용하면 뉴런 유형의 분자 식별에 대한 추가 통찰력을 얻거나 해부학적 구조로 쉽게 구별할 수 없는 분자 하위 유형을 식별할 수 있습니다.

여기에 설명된 것은 탁월한 mRNA 보유, 기술적 어려움 제거 및 겔의 더 큰 견고성을 특징으로 하는 프로토타입 플라이 EASI-FISH 프로토콜의 업데이트된 버전입니다18. 수정 사항에는 PFA 농도 증가, 고정 온도 낮추기, Melphalan-X 및 Ac-X로 배양 전에 뇌를 장착하여 샘플 준비 촉진이 포함됩니다. 이 프로토콜은 또한 새로운 젤 레시피를 통합하여 겔 견고성을 높여 여러 차례의 FISH 및 이미징을 수행할 때 겔 손상을 효과적으로 줄입니다. 이러한 수정으로 인해 프로토콜을 보다 간단하게 수행할 수 있어 처리 시간과 시약 사용이 모두 감소하고 일관된 결과에 대한 신뢰도가 향상됩니다. 중요한 것은 다중화 능력이 향상되어 수개월 동안 동일한 뇌에서 수십 개의 유전자를 조사할 수 있다는 것입니다. 이는 성인 초파리(Drosophila) 뇌에 있는 여러 뉴런 유전자의 발현 패턴이 다양한 발현 수준에 걸쳐

나타나 있는 것으로 설명됩니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 성체(5-6일령) Drosophila melanogaster 암컷에게 수행되었지만 모든 성별 또는 초파리 종을 적용할 수 있습니다. 젤 앵커 레시피는 보충 표 1을 참조하십시오. 젤 제조법에 대하여, 보충 표 2; 및 다른 EASI-FISH 시약에 대해서는 보충 표 3을 참조하십시오. 일상적인 재료 및 시약 가이드는 보충 표 4를 참조하십시오. 광시트 현미경 젤 홀더는 보충 파일 1을 참조하십시오. 그림 1A-C는 확장 및 프로브 혼성화 전에 겔에 뇌가 내장되는 과정을 개략적으로 보여줍니다(2.1-3.8 단계). 그림 1D는 내장된 뇌의 사진이고, 그림 1E는 광시트 현미경을 위한 젤 홀더이며, 그림 1F는 일반적인 실험의 타임라인을 보여줍니다. 시약과 사용된 장비의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 파리 뇌 해부 및 고정

  1. 차가운 S2 배지에서 파리 뇌 또는 CNS를 해부합니다(해부에 대한 자세한 내용은 reference21 참조).
  2. 뇌를 수정하려면 2mL의 차가운 4% PFA/PBS에 최대 20개의 뇌 또는 10개의 CNS를 추가하고 4°C의 정맥에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    주의: PFA는 삼키거나 흡입하면 유해하고 피부와 눈을 자극하며 발암성일 수 있습니다.
  3. 샘플(1x)을 2mL의 차가운 PBT(0.5%, 보충 표 4 참조)로 헹군 다음 4°C의 너트레이터에서 2mL의 차가운 PBT(4x)로 샘플을 15분 동안 세척합니다.
  4. 샘플(1x)을 차가운 70% EtOH 2mL로 헹굽니다. 뇌를 4°C에서 2mL 70% EtOH에 최대 6개월 동안 보관합니다.

2. 뇌 장착 및 RNA 및 단백질 링커 추가 (1일차)

참고: 항상 장갑을 착용하고 RNase Away로 장비와 작업 공간을 지속적으로 닦으십시오. 장갑은 (1) RNase를 샘플에서 멀리 유지하고 (2) 건강에 위험을 초래하는 여러 시약으로부터 보호하기 위해 필요합니다.

  1. RNase 오염 제거 시약으로 전하를 띠지 않은 슬라이드를 닦아 겔 챔버를 준비합니다. 실리콘 개스킷에서 접착제를 보호하는 불투명 필름을 제거하고, 개스킷(최대 4개의 챔버 포함)을 슬라이드에 부착한 다음 P20 피펫 팁을 사용하여 각 챔버 표면을 1μL 폴리라이신으로 코팅합니다. 자연 건조하고 이 과정을 반복합니다.
    참고: 2.1단계는 전날 완료할 수 있습니다.
  2. 뇌를 0.2mL PCR 튜브(튜브당 최대 4개)로 옮기고 150μL의 PBT(0.1%)에서 (2x) 5분 동안 재수화하고 PBS에서 5분 동안 (2x) 재수화합니다.
  3. 뇌를 장착하려면 챔버당 40μL의 PBS를 추가한 다음 미세한 핀셋으로 챔버 중앙의 뇌를 일렬로 부드럽게 붙이고 뇌 사이에 약간의 공간을 남겨둡니다(그림 1D 참조). 챔버당 최대 6개의 브레인 또는 2개의 CNS를 장착할 수 있습니다.
  4. PBS를 제거하고 즉시 50μL의 20mM MOPS 버퍼를 추가합니다. 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 뇌가 MOPS 완충액에서 평형을 이루는 동안 Melphalan-X 및 Ac-X 원액을 해동하고 챔버당 75μL의 Melphalan-X/Ac-X 용액을 준비합니다(MOPS 완충액으로 Melphalan-X 원액을 1:1로 희석하고 1:100으로 Ac-X 첨가). 소용돌이와 회전을 잠시 하여 용액을 수집합니다. 용액이 30분 배양 시간이 끝날 때 용액이 준비되도록 준비 시간을 정합니다.
    주의 : Melphalan-X는 삼키거나 흡입하면 유해하고 피부와 눈을 자극하며 발암성일 수 있습니다.
  6. 모든 MOPS 버퍼를 제거하고 50μL의 Melphalan-X/Ac-X 용액을 추가합니다.
  7. 상단에 커버슬립을 올려 챔버를 덮되 개스킷 접착제를 사용하여 밀봉하지 마십시오. 챔버를 가습 상자에 넣고 RT에서 밤새 빛으로부터 보호되어 배양합니다.

3. 겔화 및 단백질 분해 효소 K 소화 (2일차)

  1. 커버슬립과 Melphalan-X/Ac-X를 조심스럽게 제거하고 장착된 브레인(2x)을 100μL PBT(0.1%)로 2분, (1x)를 100μL PBS로 2분 동안 세척합니다.
  2. TREx-1000 솔루션, 4HT, TEMED 및 APS를 해동하고 얼음에 보관하십시오.
    참고: TREx-1000은 -20 °C에서 침전될 수 있습니다. 해동 후 와류가 완전히 용해됩니다.
    주의 : 이러한 시약은 삼키거나 흡입할 경우 피부와 눈을 자극할 뿐만 아니라 유해하거나 독성이 있습니다.
  3. TREx-1000과 4HT, TEMED 및 APS를 94:2:2:2의 비율로 혼합하여 겔 용액을 준비합니다. 소용돌이치고 얼음 위를 유지하십시오. 각 챔버에 대해 150μL의 겔 용액을 준비합니다.
  4. 피펫 팁으로 챔버에서 PBS를 제거하고 보푸라기가 없는 닦음으로 남아 있는 PBS를 조심스럽게 흡수합니다. 각 챔버에 대해 즉시 뇌 위에 40μL의 겔 용액을 추가합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
  5. 겔 용액을 제거하고 40μL의 신선한 겔 용액을 추가하고 4°C에서 10분 동안 추가로 배양합니다.
    알림: 마이크로 원심분리기 튜브에 겔 폐기물 용액을 모으고 버리기 전에 중합하십시오.
  6. 젤 용액을 제거하고 개스킷의 표면 접착제에서 투명 보호 필름을 벗겨냅니다. 마지막 45μL의 새 겔 용액을 추가하고 챔버 위에 커버슬립을 부드럽게 놓고 기포가 갇히지 않도록 합니다. 커버슬립을 눌러 챔버를 밀봉하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다(4°C에서 총 30분 평형).
  7. 37°C에서 1.5시간 동안 겔을 중합합니다.
  8. 젤이 굳으면 벤치에서 몇 분 동안 식히십시오. 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 새 면도날로 실리콘 개스킷을 제거합니다. 다음으로, 젤을 직사각형으로 자르고 오른쪽 상단 모서리를 잘라 샘플 방향을 추적합니다.
  9. 소량의 ProK Buffer를 적신 미세한 페인트 브러시로 슬라이드에서 젤을 제거하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 개별적으로 옮깁니다.
  10. 각 겔에 500 μL의 ProK 버퍼와 5 μL의 ProK 효소(1:100)를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

4. DNA 분해 및 프로브 혼성화(3일차)

  1. RT.
    에서 PBS 1mL로 젤(3x)을 10분 동안 세척합니다. 알림: 용액을 교체할 때 젤이 손상되지 않도록 가는 팁 전사 피펫을 사용하십시오.
  2. 37°C에서 1mL의 DNase1 완충액에 30분 동안 겔을 배양합니다.
  3. 50μL의 DNase1 효소를 450μL의 DNase 완충액에 추가합니다. 부드럽게 섞되 소용돌이치지 마십시오. 각 겔을 500μL의 DNase1에서 2시간 37°C 동안 배양합니다. RT.
    에서 1mL의 PBS로 15분 세척(4x) 참고: 겔은 DNase 분해/세척 전후에 4°C에서 5x SSC에 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
  4. 해동 혼성화(hyb) 및 프로브 세척 버퍼. 37°C에서 30분 동안 프로브 없이 500μL의 hyb buffer에 겔을 배양합니다
    주의 : hyb와 프로브 세척 버퍼에는 암을 유발하는 것으로 의심되는 포름아미드가 포함되어 있습니다.
  5. 프로브를 hyb 버퍼(10nM)에서 1:100으로 희석하여 겔당 300μL를 준비합니다. hyb 버퍼와 프로브로 겔을 37°C에서 밤새 배양합니다. 프로브 세척 버퍼와 PBS를 37°C로 유지합니다.

5. 프로브 세척 (4일차)

  1. 37°C에서 750μL의 프로브 세척 버퍼로 젤(3x)을 30분 동안 세척합니다.
  2. 젤(3x)을 30분 동안 세척한 다음 37°C에서 PBS 1mL로 1시간(3x) 세척합니다.
  3. 하룻밤 동안 RT에서 2mL의 PBS로 젤을 세척하거나 주말에는 4°C로 젤을 세척합니다.

6. 형광 헤어핀을 이용한 혼성연쇄반응(HCR) (5일차)

참고: HCR 원칙은 reference22를 참조하십시오.

  1. RT에서 30분 동안 500μL의 증폭(amp) 버퍼에 겔을 배양합니다.
  2. PCR 기계에서 형광 헤어핀을 95°C에서 90초 동안 가열하고 25°C로 30분 동안 급속 냉각합니다.
  3. 각 프로브에 대해 일치하는 헤어핀 쌍(h1 및 h2)을 암페어 버퍼에서 1:50으로 희석하여 겔 및 와류당 300μL를 준비합니다.
  4. 어둠 속에서 RT에서 3시간 동안 헤어핀 혼합물로 젤을 배양합니다.
  5. 750μL의 5x SSCT로 겔(2x)을 15분 동안 세척하고 RT에서 1mL의 0.5x SSCT로 (2x)를 30분 동안 세척합니다.
  6. 뇌가 GFP를 발현하는 경우, 5 mg/mL의 초순수 BSA를 함유한 PBT(0.1%)에 500 μL의 항-GFP-AF488 항체(1:500)를 넣고 4 °C에서 하룻밤(또는 주말에) 배양합니다.

7. 젤 장착 및 이미징 (6일차)

  1. 항체 배양 후 겔을 한 번 헹구고 PBT 1mL(0.1%)로 30분 동안 세척(1x)한 다음 PBS 1mL로 30분 동안 (3x)를 세척합니다.
    알림: PBS에서 세척하면 2배 팽창합니다. 3x 팽창의 경우 0.05x SSC로 세척하십시오.
  2. 세탁하는 동안 광시트 현미경 젤 홀더의 겔 부착 표면에 1μL의 폴리라이신을 2회 코팅하여 코팅 사이에 37°C에서 건조시킵니다. 마찬가지로, 컨포칼 이미징의 경우, 유리 바닥 접시의 젤 부착 부위를 폴리라이신을 반복적으로 도포하여 코팅합니다.
  3. 1mL의 5μg/mL DAPI/PBS 또는 DAPI/0.05x SSC로 RT에서 30분 동안 겔을 염색하거나 4°C에서 밤새 염색합니다.
  4. 젤 홀더(광시트 현미경) 또는 유리 바닥 접시(컨포칼 현미경)에 젤을 장착하려면 젤을 커버슬립에 놓고 보푸라기가 없는 닦음으로 가장자리를 조심스럽게 말리십시오. 조직이 대물렌즈에 가장 가까울 수 있도록 겔의 방향이 지정되었는지 확인합니다. 붓을 사용하여 젤을 한 번의 움직임으로 폴리 라이신 표면에 부드럽게 놓습니다. 이미징의 경우 PBS(또는 3배로 확장하는 경우 0.05x SSC)로 젤을 목욕시킵니다.
    참고: 이미징 후 젖은 페인트 브러시로 폴리 라이신 표면에서 젤을 부드럽게 제거하고 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮길 수 있습니다.
  5. 즉각적인 재검사를 위해 7일째로 진행하십시오. 장기 보관(1주일에서 6개월)을 위해 4°C에서 5x SSC 1mL에 젤을 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 진행하기 전에 PBS 1mL로 젤(3x)을 10분 동안 세척합니다.
    참고: 확장 범위는 설명된 버퍼에서 일반적으로 일관됩니다(PBS에서 ~2배, 0.05x SSC에서 ~3배). 확장 계수를 확인하려면 형광 실체 현미경에서 촬영한 이미지에서 확장 전후의 뇌 크기를 측정합니다. 확장 후 뇌를 시각화하려면 DAPI로 잠시 염색합니다. 대략적인 확장 계수는 확장 후 크기를 확장 전 크기로 나눈 값입니다.

8. 다중화를 위한 프로브 및 헤어핀 스트리핑(7일차)

  1. 37°C에서 1mL의 DNase1 완충액에 겔을 30분 동안 배양합니다.
  2. 50 μL의 DNase1을 450 μL의 DNase 완충액에 추가합니다. 부드럽게 섞되 소용돌이치지 마십시오. 500 μL의 DNase1에서 37 °C에서 2 시간 동안 겔을 배양합니다.
  3. RT에서 1mL의 PBS로 15분 동안 세척(4x)합니다. 이제 겔은 다음 혼성화 라운드(3일차, 6단계)를 위한 준비가 되었습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 변형된 EASI-FISH 프로토콜의 성능은 성인 초파리 뇌에서 여러 차례에 걸쳐 여러 가지 다른 신경전달물질 관련 및 신경펩티드 유전자의 발현을 감지함으로써 입증되었습니다. 전형적으로, 겔화 및 팽창된 뇌는 라운드당 2개 또는 3개의 프로브로 혼성화되었고, 그 다음에는 Alexa Fluor (AF) 488 (GFP가 발현되지 않은 경우), AF546 및 AF647 또는 Janelia Fluor (JF) 669와 접합된 헤어핀 쌍을 가진 HCR이 뒤따랐다. 이미징은 대부분 광시트 현미경에서 수행되었으며, 전체 뇌를 포괄하기 위해 함께 꿰매어진 단일 z-stack 또는 여러 타일을 획득했습니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단일 z-스택도 획득했습니다(자세한 내용은 그림 2 및 그림 3의 전설 참조).

그림 2

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

온전한 초파리 신경계에 대해 설명된 EASI-FISH 프로토콜은 동일한 뇌 또는 CNS에서 수십 개의 전사체를 검출할 수 있습니다. 견고하고 간단하며 민감하며 GFP 검출과 결합하여 뉴런 또는 아교세포의 하위 집합을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 구현하기 쉽기 때문에 온전한 파리 뇌에서 유전자 발현을 매핑하고 정량화하는 데 관심이 있는 초파리 연구실의 연구를 용이하게 해야 합니다.

EASI-FISH는 확장 현미경을 포함하지 않는 이전 FISH 프로토콜에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 우수한 RNA 안정성은 이전에 마우스 조직에서 보고된 바와 같이 여러 라운드의 FISH에서 관찰됩니다17. 이는 mRNA가 겔 매트릭스에 고정되고 조직 유래 RNase의 고정 및 부분 분해 때문일 수 있습니다. 다른 공개된 프로토콜

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

확장 현미경의 역학에 대한 조언을 해준 Paul Tillberg, 뇌 해부에 도움을 준 Christina Christoforou, 비판적인 피드백을 준 Geoffrey Meissner에게 감사드립니다. 또한 타냐 울프(Tanya Wolff)와 게리 루빈(Gerry Rubin), 그리고 제프리 마이스너(Geoffrey Meissner)와 와이어트 코르프(Wyatt Korff)에게 두 개의 대규모 연구의 일환으로 생성된 결과를 포함할 수 있도록 허락해 준 것에 대해 감사드립니다. 모든 작업은 Janelia Research Campus에서 수행되었으며 Howard Hughes Medical Institute의 지원을 통해 MultiFISH 및 Fly-eFISH 프로젝트 팀, Gerry Rubin, Project Technical Resources에 대한 자금을 지원했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR 튜브 미국 과학 1402-4700
0.5mL 나사 캡 마이크로 원심분리기 튜브, AmberUSA Scientific 1405-9707
0.5M EDTA, PH 8, RNase freeInvitrogenAM9260G
10M NaOHSigma72068
10x PBS FisherBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40% 아크릴아미드 Bio-Rad1610140
4-Hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma176141
5 M NaCl RNase-free ThermofisherAM97060G
5 ml 전사 피펫- 파인 팁글로벌 사이언티픽 134070-S20
6 웰 유리 바닥 플레이트 CellvisP06-1.5H-N
아세토니트릴, 무수 ThermoFisher042311-K7
아크릴 산TCIA0141
아크릴로일-X ThermoFisherA20770
암모늄 퍼설페이트 (APS)SigmaA3678
증폭 버퍼 분자 기기https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
무수 DMSOInvitrogenD12345
AstA_B2분자 기기PRR477
ChAT_B1분자 기기PRG115
Crz_B5분자 기기PRR480
DAPI시그마D9542
FIJI오픈 소스https://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2분자 기기PRR487
GAD1_B5분자 기기RTE581
GFP 다클론 항체, Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
혼성화 버퍼분자 기기
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris 뷰어Oxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
MOPs 버퍼FisherBP308-100
N,N 메틸렌-비스-아크릴아미드 Bio-Rad1610142
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)SigmaT22500
뉴클레아제 무료 물 AmbionAM9932
올리고 프로브 분자 기기https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
파라포름알데히드 (PFA)EMS15710
PBSFisher 
포토플로-200 EMS74257
Poly-L-lysine hydrobromide (polylysine)SigmaP1524
프로브 세척 버퍼분자 기기https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Proteinase K NEBP8107S
QIAquick 뉴클레오티드 제거 키트Qiagen28306
RNase Away ThermoFisher7003, 오염 제거 시약
RNase-Free DNase1Qiagen79254
S2 중간ThermoFisher21720024
실리콘 가스켓 InvitrogenP24743
Tdc2_B5분자 기기RTE880
Tk_B5분자 기기PRR484
UltaPure 10% SDSThermofisher15553027
초순수 BSAThermoFisherAM2616
비접합 및 Alexa 형광 접합 헤어핀분자 기기
VAChT_B1Molecular InstrumentsRTA904
vGLUT_B2Molecular InstrumentsRTB212
Zeis Z7 젤 홀더 자넬리아 시 CAD 파일 사용 가능
: Zeiss LSM 980 컨포칼 도립 현미경Zeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 광학 시트 현미경Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fishBP24384https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish요청 , ,

References

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