쥐의 폐에 액체를 전달하기 위한 개선된 방법론: 소비자 검이경을 사용한 삽관

요약

이 프로토콜은 마우스를 최적으로 배치하고 카메라 기반 검이경을 경구로 삽입하면 성문을 시각화하고, 조직 외상을 최소화하면서 신속한 삽관을 수행하며, 폐에 액체를 일관되게 전달할 수 있는 방법을 보여줍니다.

초록

잠재적 치료법을 포함한 액체를 폐에 지속적으로 전달하는 것은 폐 질환 모델링 및 전임상 치료 개발에 매우 중요합니다. 그러나 텅 풀(tongue-pull) 방법에 의한 구인두 흡인과 같은 현재 마우스에 사용되는 방법은 다양한 전달을 초래할 수 있습니다. 여기에서는 성문을 시각화하고 기도로 직접 접종할 수 있도록 저렴한 휴대폰 연결 조명이 있는 검이경을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 적절한 조명 및 포지셔닝 보조 도구를 사용하여 최적화된 스테이징 기술에 대해 자세히 설명합니다. 광섬유 조명이 있거나 없는 20G 플렉시블 카테터를 사용하여 삽관을 안정적으로 수행하는 방법도 설명합니다. 이 기술은 폐 내 전달의 변동을 크게 줄이고 폐에 도달하는 전달되는 액체의 양을 증가시킵니다. 감소된 분산으로 인해, 혀 당기기(tongue-pull) 방법에 의한 구인두 점안 대신 이 방법을 사용할 때 더 작은 동물 코호트 크기를 사용할 수 있습니다. 다음은 기관내 튜브 배치에 대한 확실한 확인을 포함하여 마우스의 효과적이고 신속하며 일관된 삽관 및 폐로의 전달 방법입니다. 이 개선된 방법론을 통해 일관되고 안전한 삽관과 복제 가능하고 효율적인 폐 전달이 가능합니다.

서론

전 세계적으로 호흡기 질환은 5세 미만 아동의 사망 원인 1위이며 성인 이환율 및 사망률의 주요 원인이다¹. 2021년 SARS-CoV2 감염은 미국에서 세 번째로 큰 사망 원인이었습니다². 쥐 모델은 천식, 폐렴, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 폐 섬유증을 포함한 폐 질환을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 거의 모든 이러한 모델은 액체 작용제를 폐로 전달해야 합니다. 이는 기관을 직접 캐인레이션(일반적으로 외과적 절단 기법을 사용하여 직접 시각화), 비강 내 전달 또는 잘 확립된 혀 당김 방법에 의한 구인두 흡인에 의해 수행될 수 있습니다 ^3,4,5. 그러나 이러한 기술에는 모두 단점이 있습니다. 외과적 절단 기법 후 흉터 조직이 형성되면 폐에 제제를 반복적으로 투여해야 하는 연구에 적합하지 않으며, 후자의 두 가지 기법은 다양한 폐 전달로 이어질 수 있습니다. 또한, 텅-풀(tongue-pull) 방법을 사용할 경우 혀에 대한 조직 외상이 뚜렷하게 나타날 수 있으며, 전달 효율은 시술을 수행하는 연구자에 따라 달라집니다(그림 1 참조).

그림 1: 유도 삽관 및 IT 주입은 혀 당기기와 비교할 때 폐로의 전달을 개선하고 변동성을 줄입니다. (A) 3명의 다른 연구자가 구인두(OP) 투여를 위해 확립된 방법인 혀 당기기로 50μL의 희석된 인도 잉크를 전달했습니다. 두 명의 연구원은 또한 설명된 대로 삽관을 사용하여 폐에 잉크를 전달했습니다. (B) 분만 후 1-4시간 후에 폐를 제거하고 2배 확대하여 촬영하였다. 사진은 ImageJ를 사용하여 얼룩진 영역에 대해 평가했습니다. (n=6 (삽관) 또는 9 (op 투여), 2-3명의 다른 연구자에 의한 2회 또는 3회의 독립적인 반복 결과, p<0.0001 Welch의 T 테스트) (C) 폐 투여의 변동성도 평균으로부터의 퍼센트 편차로 계산하였다. OP 관리는 훨씬 더 가변적이었습니다. (p = 0.0317, 웨일스어의 T-검정, GraphPad Prism 10.2.3 모든 통계 및 그래프) (C57BL/6J 수컷 및 암컷 마우스를 사용했으며, 생후 ~10주였습니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

쥐의 해부학적 구조로 인해 삽관이 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 입은 작고, 협측 조직은 rima glottidis⁶에 대한 연구자의 견해를 방해할 수 있습니다. 또한 성대는 매우 작으며 혀 바닥에 가깝게 놓여 있기 때문에 보기가 어려울 수 있습니다. 마지막으로, 기관내관의 적절한 배치를 확인하는 것은 작은 일회식량이 종종 거울에 김을 서리지 못하기 때문에 어렵습니다⁷. 이러한 어려움으로 인해 생쥐를 삽관하는 다양한 혁신적인 기술이 개발되었습니다. 이러한 개선된 방법에는 카테터를 기관으로 전진시키기 위한 신생아 후두경 및 와이어의 사용 ^8,9, 카테터를 안내하고 보강하기 위한 광섬유 광원의 사용^10,11, 라이브 비디오 피드⁶의 사용이 포함됩니다. 보다 최근에는 임상 검이경의 사용이 구강 기관 삽관에 도움이 되었습니다¹². 다른 사람들은 성문을 시각화하고 생쥐를 삽관하기 위해 투과 조명을 사용했습니다 ^7,13,14. 그러나 이러한 방법에는 많은 단점이 있습니다. 생쥐의 목에 제모제를 사용하고 동물이 뜨거운 광원에 근접해 있기 때문에 투과 조명은 이상적이지 않은 접근 방식입니다. 카테터 안에 바늘을 사용하거나 날카로운 도구를 입에 삽입하는 것은 카테터를 뻣뻣하게 만드는 몇 가지 방법을 의미하며, 동물은 과도한 위험에 처하게 됩니다. 마지막으로, 위치를 확인하기 위해 기관을 절개하는 것은 불임의 필요성과 흉터 조직의 축적을 포함하여 상당한 단점을 제시합니다. 지금까지 삽관을 통한 기관내 주입은 널리 채택되기에는 너무 어렵다는 것이 입증되었으며¹⁵ 방법론적 개발의 발전은 많은 실험실에서 고립되고 사용되지 않은 상태로 남아 있습니다¹⁵. 추가 연구에서는 분만 중 마취제 선택에 초점을 맞추고 있으며, 케타민이 이소플루란보다 장점이 있을 수 있음을 발견했다⁵. 그러나 이소플루란은 규제 물질이 아니고 시술 완료 시 빠르게 사라지기 때문에 이러한 형태의 마취를 사용하면서 이 방법론의 다른 측면을 최적화했습니다^16,17.

우리가 설명하는 방법은 다른 사람들이 해결하려고 시도한 시각화 문제를 극복하고, 실험 동물에 대한 위험을 완화하고, 기관내관을 통해 기관내로 소량을 주입하는 데 필요한 시간을 줄이고, 폐에 도달하는 액체의 양을 늘리고, 기관내관 배치 확인을 위한 개선된 방법을 제공합니다. 서스펜션 스탠드, 자기 도움의 손길(베이스에 고정된 유연한 팔의 악어 클립) 및 더 밝은 조명을 사용하여 개별 연구원이 효율적인 기관 내 전달을 수행할 수 있습니다. WIFI 연결이 가능한 '집에서' 검이경을 사용하여 시각화가 더 쉬워집니다. 이 장치는 상업용 삽관 기구보다 저렴합니다. 또한 WIFI 연결을 통해 휴대용 장치(예: 휴대폰)에서 동시 비디오 피드를 사용할 수 있어 교육에 적합합니다. 삽관은 20g x 1" flexible(PTFE) 카테터(바늘 제거)를 통해 나사산이 있는 광섬유 광원 또는 조명이 없는 카테터를 사용할 수 있습니다. 깊이는 삽관 안전 쐐기(카테터의 원뿔형 보호대)를 추가하는 방법과 비디오 피드에서 깊이 관찰의 두 가지 방법으로 제어됩니다. 기관내관 배치는 기존의 거울안개 방법보다 일회량을 더 명확하게 시각화하기 위해 "버블 방법"을 사용하여 확인됩니다¹⁸. 이것은 배치를 확인하기 위해 호흡 절박뇨¹⁰ 을 수정하기 위해 기관 폐쇄에 의존하는 것보다 동물에게 스트레스가 적습니다. 성공적인 삽관을 확인하기 위해 카테터에 연결된 확장 튜브의 조합 사용(이하 버블법이라고 함)은 Watanabe et. AL⁷, 그리고 단일 절차로 소비자 비디오 검이경을 사용하면 삽관이 폐로의 치료 전달을 위한 실용적인 방법이 되고 혀 당기는 방법이 명확하게 개선됩니다( 그림 1 참조). 특히 규제 물질(예: 케타민) 또는 고가의 장비를 사용하지 않고 비수술적 액체를 마우스 폐로 전달하기 위한 신뢰할 수 있고 일관되며 저렴한 방법을 찾고 있는 경우 다음 방법이 이상적일 수 있습니다.

프로토콜

이러한 절차는 프로토콜에 등재된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 검토 및 승인해야 하며, 진행하기 전에 수의사와 상의해야 합니다. 우리 기관의 IACUC는 실험을 시작하기 전에 프로토콜을 승인하고 제출하기 전에 비디오 콘텐츠를 검토했습니다. Tulane Department of Comparative Medicine을 통해 지원과 교육을 받아 모든 실험실 동물에 대한 최고 수준의 치료를 보장했습니다.

1. 설정

참고: 설정은 그림 2 를 참조하십시오.

그림 2: 유도 삽관에 사용되는 스테이션은 그림과 같이 준비됩니다. 왼쪽부터: 분만을 위한 피펫, 적절한 기관내관 배치를 확인하기 위한 버블 튜브, 겸자, 주걱, 소아 비강 검경(이 절차에는 필요하지 않음), 도움의 손길, 확대광, 노즈 콘이 있는 마우스 스탠드, 광섬유 프로브, 마취 유도실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 삽관 키트와 함께 제공된 안전 쐐기를 이소프로판올 준비 패드로 청소합니다. 깨끗한 안전 쐐기(비디오에서는 녹색)를 20G의 유연한 캐뉼라에 밀어 넣고 제공된 바늘을 안전하게 폐기합니다.
   참고: 사용된 설치류 삽관 키트(재료 표)에는 삽관 안전 쐐기가 포함되어 있습니다. 이것은 20G x 1인치의 유연한 카테터 위에 맞는 작은 원뿔형 슬리브입니다. 카테터가 용골을 손상시키는 것을 방지합니다.
2. 휴대폰, 상업용 검이경, 노즈 콘이 있는 마우스 스탠드, 미세하게 톱니 모양의 구부러진 집게, 준비된 기관내관(1.1부터) 및 광섬유 조명(사용하는 경우)을 포함하여 필요한 다른 도구를 수집합니다. 사용하기 전에 이소프로판올 준비 패드로 이 모든 것을 청소하십시오.
3. 약 20cm의 유연한 튜브를 사용하십시오. U자 모양으로 구부리고 한쪽 끝에 Luer 잠금 연결을 추가하고 트위스트 타이로 고정합니다. 200-300 μL의 멸균 여과수 또는 인도 잉크를 튜브에 추가합니다. 이하에서는 이 조립체를 "버블 튜브(bubble tube)"라고 한다.
4. ~13cm의 사이즈 0 꼰 실크 봉합사를 원형으로 묶어 봉합 루프를 만듭니다. 이 루프를 스탠드 상단에 놓고 봉합사의 양쪽이 고정되어 있고 스탠드가 깨끗한지 확인합니다. 금속 돋보기 베이스 위에 마우스 스탠드를 놓습니다. 마우스의 입이 있을 곳 주위에 도움의 손길을 놓습니다.
   참고: 많은 공급업체가 교체 가능한 스탠드를 만들며(재료 표 참조) 실험실 내에서 저렴하게 만들 수 있습니다 ^4,7,14. 크기 0 꼰 실크 봉합사를 사용하여 동물을 매달았습니다. 그러나, 동일한 목적을 위한 다른 물질의 사용은 기술되어 있다 ^4,13.
5. 마취 유도실에 마우스를 놓습니다. 0.8L/min에서 일정한 유량 O₂ 및 2% 이소플루란을 사용합니다. 콧방울을 배치하는 동안 동물이 깨어나지 않도록 동물을 충분히 마취하십시오(참고 참조). 마우스의 호흡수를 크게 억제하지 마십시오. 규칙적인 호흡은 성대를 이해하는 데 도움이 됩니다.
   알림: 마우스의 호흡수는 정상이어야 합니다. 이 기준은 적절한 마취 깊이를 설정하는 데 사용됩니다. 이것은 동물마다 다를 수 있으며 200 호흡 / 분을 초과 할 수 있습니다. 따라서 호흡을 세거나 발가락 꼬집음을 사용하는 것은 실용적이지 않거나 필요하지 않습니다.
   주의: 필요한 경우 이 절차를 중단할 수 있습니다. 그러나 동물은 반드시 필요한 것보다 더 오래 유도실에 머물러서는 안 됩니다.
6. 검이경을 휴대폰에 연결하고 비디오 피드가 안정적인지 확인합니다.
   주의: 이 절차 중 연구원의 이소플루란 노출을 최소화하려면 이 방법으로 여러 번 삽관하거나 교육을 수행하는 경우 화학 호흡기를 사용하십시오. 또는 흄 후드에서 절차를 수행하십시오.

2. 동물 병기 결정

1. 첫 번째 동물이 잠들자마자 유도실에서 동물을 꺼내 목덜미를 깎고 윗니를 봉합사 길이에 놓습니다. 마우스를 스탠드에 다시 눕히는 동안 봉합사의 위치를 유지하기 위해 동물에게 가벼운 장력을 가합니다.
   참고: 평균적으로 동물은 유도를 포함하여 총 2분 동안 마취됩니다. 이것은 동물에 대한 위험을 크게 줄이고, 안과 윤활의 필요성을 제거하며, 타액 축적을 방지합니다. 가능한 한 짧은 시간 동안 동물을 진정 상태로 유지하십시오.
2. 넥 각도를 약간 뒤로 조정합니다(넥을 약간 확장, 5°-15°로 배치). 콧방울을 콧구멍 위로 부드럽게 밉니다. 봉합사를 방해하여 마우스를 매달아 놓을 수 있으므로 원뿔을 세게 누르지 마십시오.
3. 크고 가늘게 구부러진 집게를 사용하여 혀를 아랫입술에 최대한 가깝게 단단히 잡습니다. 위쪽 치아에서 아래쪽 치아의 한쪽으로 아래로 당깁니다.
   주의: 장시간 견인, 과도한 긴장 또는 혀를 짓밟으면 동물의 건강을 해칠 수 있습니다. 혀에 외상(멍, 출혈, 부기 또는 건조)의 징후가 있는지 모니터링하고, 관찰된 경우 절차를 중단하고 수의사에게 알리십시오.
4. 도움의 손을 사용하는 경우 이 위치에서 집게를 지지하십시오. 연구자의 경험과 시력에 따라 조명이 있는 돋보기가 동물의 위치를 적절하게 잡는 데 도움이 될 수 있습니다.
5. 삽관 안전 쐐기(비디오에서는 녹색)가 제자리에 있는 유연한 카테터를 통해 광섬유 조명(사용하는 경우)을 공급합니다.
   알림: 광섬유 케이블을 광원에 너무 세게 고정하지 마십시오. 너무 세게 밀면 기관내관을 제자리에 둔 채 빛을 제거하기가 어렵습니다.

3. 성대와 삽관의 시각적 감상

1. 주로 사용하지 않는 손에 검이경을 들고 혀에 가볍게 누릅니다. 그런 다음 카메라와 광원의 각도를 조정하여 혀 기저부 근처의 성대를 시각화합니다.
   참고: 해부학적 구조와 조직 색상의 약간의 변화는 방향을 잡는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 호흡과 관련된 움직임을 사용하여 구조적 식별을 확인합니다.
2. 광섬유 조명을 켠 상태에서(사용하는 경우) 검이경 상단을 따라 캐뉼라를 공급하고 참조를 위해 혀 바닥이나 검이경의 입술 부분에 가볍게 접촉합니다. 부드러운 팔레트와 검이경의 가장자리 사이에 있는 마우스의 입으로 전진시킵니다.
   참고: 광섬유 조명을 사용하지 않는 경우 이 단계에서 4단계에서 설명한 "버블 튜브"를 카테터에 부착할 수 있습니다. 마우스의 입에 밝고 집중된 조명은 이러한 절차 수정에 필요합니다.
3. 카테터가 매우 얕도록 접근 각도를 조정합니다. 카테터를 삽입한 직후(성대에서 1mm 미만) 카테터의 끝을 올려 탁상과 거의 평행이 되도록 합니다. 이것은 후두개염이 카테터를 배측으로 식도로 밀어 넣는 것을 방지합니다. 특히 훈련 중, 어려움이 있을 때 또는 경험 초기에 비디오 피드를 사용하는 것은 성대 사이에 기관내관을 배치하는 데 매우 중요합니다.
   알림: 타액 생성은 이 절차를 완료하는 동안 성대를 보는 것을 방해하지 않습니다. 그러나, 방해하는 타액을 제거하기 위해 창끝이 있는 면 어플리케이터를 사용하는 것은 이전 간행물에서 쥐에게 삽관을 할 때 설명되었습니다¹⁹. 이 방법은 타액이 문제가 되는 경우 유용할 수 있습니다.
   1. 저항이 발생하면 즉시 카테터를 제거하고 호흡이 정상으로 돌아오도록 합니다. 출혈이 관찰되면 수의사와 상담하십시오.
      참고: 카테터를 전진시킬 때 저항이 거의 없어야 합니다.

4. 기관내관 배치 확인

1. 검이경을 사용하여 기관내관이 올바른 위치에 있는지 육안으로 확인합니다. 또한, 기관이 식도보다 삽입 중 저항이 적다는 점을 고려하여 튜브의 올바른 배치를 확인하십시오. 적절한 위치에서 기관내관이 성대에서 ~5mm 떨어져 있는지 관찰합니다. 목 피부를 통해 빛나는 광섬유 소스의 빛을 찾아 배치가 올바른지 다시 확인합니다.
   참고: 삽관 안전 쐐기는 기관내관이 너무 멀리 삽입되는 것을 방지해야 합니다. 안전 쐐기는 용골관에 대한 외상을 방지합니다. 그러나 그것이 발전을 방해할 필요는 없습니다. 안전 기능으로 사용해야 하며 최적의 깊이는 종종 쐐기가 허용하는 것보다 얕습니다.
2. 그런 다음 기관내관을 제자리에 고정한 상태에서 광섬유 조명을 제거합니다. 거울 김서림이 아닌 "버블 방법"(아래 자세히 설명)을 사용하여 카테터가 적절하게 배치되었는지 확인하십시오.
3. 1.3단계에서 준비한 버블 튜브를 회수합니다. 시술 전에 준비하고 모든 동물에게 재사용하십시오.
   주의 : 버블 튜브에 있는 200-300μL의 물이나 잉크는 절대 흡인해서는 안 됩니다. 이를 방지하려면 액체가 Luer 잠금 장치에서 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오.
4. 기관내관을 제자리에 놓고 Luer 잠금 장치를 사용하여 버블 튜브를 제자리에 고정합니다. 일회식의 양은 즉시 명백해야 합니다. 그렇지 않다면, 기관내관이 잘못 배치된 것입니다. 신속하게 제거하고 마우스의 정상 호흡수가 돌아오도록 하십시오.
   주의: 카테터를 식도에 잘못 넣으면 기관이 압박되어 충분한 호흡을 할 수 없습니다. 잘못된 배치는 종종 호흡 곤란(늑간 근육의 상당한 기여 포함) 및/또는 급격한 호흡수 감소를 동반합니다. 또한 식도를 캐뉼링하면 근육 경련이 발생하여 후속 삽관이 더 어려워질 수 있습니다. 이러한 이유로 훈련하는 동안 여러 동물을 사용하는 것이 좋습니다.

5. 기관내 전달

주의: 구인두 분만을 위한 혀 당기기 방법과 매우 유사하게, 삽관을 통한 분만은 동물을 익사시킬 위험이 있습니다. 청소년 및 성인 마우스에서 50μL는 일반적으로 안전한 양의 액체이며 폐 전체에 퍼지기에 충분합니다.

1. 투여를 위해 주사기를 사용하는 경우: 카테터에서 버블 튜브와 Luer 잠금 장치를 분리하고, 장전된 Luer 슬립 주사기를 부착한 다음 플런저를 눌러 원하는 부피(최대 50μL)를 전달합니다.
2. 투여를 위해 피펫을 사용하는 경우: 원하는 부피(최대 50μL)를 카테터에 직접 피펫팅하고 마우스가 용액을 흡입할 수 있도록 합니다.
   참고: 교육하는 경우 희석된 인도 잉크, 여과된 인도 잉크 또는 메틸렌 블루와 같은 표시기를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 폐로의 확산 전달을 보장하려면 최대 500μL의 공기로 전달된 액체를 폐로 플러시합니다²⁰. 이는 사전 로드된 0.5mL Luer Lock 주사기 또는 필터 팁이 장착된 P1000 피펫터를 사용하여 수행할 수 있으며, 둘 다 신뢰할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 원하는 경우, 전달된 액체의 부정적인 흡인의 위험 없이 피펫터의 여러 함몰을 수행할 수 있습니다.
   주의: 이 방법을 사용하여 동물에게 접종하는 경우, 구인두 흡인 또는 비강 내 분만에 비해 전달 효율이 증가하므로 접종 농도를 낮추는 것이 좋습니다.
   알림: 접종물을 공기로 세척할 때 일회 호흡량(~200μL) 이상을 사용해야 할 수 있습니다. 그러나 500 μL의 사용은 폐활량의 약 절반에 불과하기 때문에 기압 외상의 위험이 없습니다²¹. 성체 마우스는 약 ~800 μL의 흡기 예비 용량을 가지고 있으므로, 마우스가 플러싱 직전에 흡기를 했더라도 기압 외상은 발생하지 않습니다²¹. 더 낮은 공기 플러싱 부피가 접종물 분포에 대한 요구 사항에 적합할 수 있는지 고려하십시오(100-200μL가 제안됨).

6. 납품 평가

참고: 이것은 절차를 교육하거나 연습하는 경우에만 수행됩니다.

1. 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다. 안락사의 일차적 방법으로서의 CO₂ 질식과 안락사의 확정적 방법으로서의 자궁경부 탈구가 여기에서 사용되었다.
2. 흉벽을 열고 폐를 제거합니다. 복막을 열고 꼬리 쪽에서 횡격막에 접근한 다음 심장이 보이는 곳에 작은 가위로 구멍을 뚫습니다. 이렇게 하면 폐가 수축하고 갈비뼈를 절단하여 흉강을 열 수 있는 더 많은 공간을 확보하게 됩니다.
   참고: 폐의 혈액을 줄이기 위해 관류가 필요한 경우 이 단계에서 심장의 우심실을 통해 절차를 수행하십시오.
3. 제거 후 1mL의 멸균 PBS로 폐를 잠시 헹굽니다. 상대적인 엽 위치를 유지하면서 최대 면적을 노출시키기 위해 흰색 표면(수술용 스펀지와 같은)에 평평하게 놓습니다.
4. 생체 외 폐 사진을 찍고(여기서는 휴대폰 사용) ImageJ에서 이미지를 열고 염료 앞면의 윤곽을 추적하여 염색된 영역과 염색되지 않은 영역을 정량화합니다. 편향을 피하기 위해 독립적인 맹검 연구자를 사용하여 염색된 영역을 정량화합니다.
   참고: 그림 3과 같이 발광과 IVIS를 사용하는 경우 6단계 대신 생체 내 라이브 이미징을 수행해야 합니다.

결과

그림 1과 그림 3에서 볼 수 있듯이, 전통적인 혀 당기기(구인두 전달)를 사용한 폐내 접종은 고르지 못한 잉크 분포와 연구자 간의 편차를 더 크게 가져왔습니다. 대조적으로, 삽관 후 IT 주입은 오른쪽 폐와 왼쪽 폐 모두에 더 일관된 전달로 이어졌으며 변동성이 적었습니다(그림 1C 및 그림 3D). 혀 당기기를 사용하여 구인두 흡인에 의해 잉크를 투여한 동물의 폐에서 잉크는 미묘하며 동물의 큰 기도 근처에만 존재합니다(그림 1A). 이와는 대조적으로, 유도 삽관을 사용하여 잉크를 전달했을 때, 잉크는 폐의 훨씬 더 넓은 영역을 표시하는 조직 속으로 훨씬 더 멀리 퍼졌습니다. 잉크로 염색된 폐 표면적을 여러 방법 간에 비교했을 때, 삽관 방법이 텅 풀(tongue-pull)보다 훨씬 우수한 것으로 입증되었습니다(그림 1B). 잉크 전달량의 변동성도 삽관 조건에서 크게 낮았습니다(그림 1C). 염색된 폐 면적이 증가하고 폐에 도달하는 액체의 양에 대한 변동성이 낮아진 것은 IT 전달이 혀 당기기보다 우수하다는 것을 강력하게 시사합니다.

비디오 1에서 볼 수 있듯이, (이전에 발표된 바와 같이) 기존의 내시경은 초점 거리가 너무 길어 성대 주름을 이해하고 기관내 튜브 배치를 안내할 수 없습니다 ^6,19. 대조적으로, 소비자용 검이경을 사용하여 촬영한 비디오 이미지(그림 S1 및 타임스탬프: 비디오의 6:34 및 7:05)는 해상도가 훨씬 우수하여 성문의 시각화가 개선되었습니다.

이 삽관 방법에는 기관 내 튜브 배치에 대한 여러 확인이 포함됩니다. 생쥐의 일회 호흡량은 버블 방법(그림 S2 및 타임스탬프: 8:25)을 사용할 때 쉽게 알 수 있었으며 전달된 모든 액체가 폐로 들어갈 것이라는 최종 보증 역할을 합니다.

두 가지 전달 방법의 차이를 추가로 평가하기 위해 두 가지 다른 방법(혀 당김 방법에 의한 구인두 점안 또는 유도 삽관 후 기관내 전달)을 사용하여 마우스에 1 x 10¹¹ vg의 AAV6.2-Luciferase를 접종한 후 폐 조직에서 전이유전자 발현을 평가했습니다. 벡터 투여 7일 후, 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 사용하여 발광 측정을 수행했습니다(그림 3A). 그런 다음 양쪽 폐의 평균 방사도를 계산했습니다. 이미징 10분 전(30초 노출) 200μL의 루시페린(15mg/mL)을 (피하주사) 주사했습니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이, 구인두 점안을 통해 벡터를 투여받은 동물은 흉부와 코 부위 모두에 널리 분포된 발광 신호를 가지고 있었습니다. 대조적으로, 유도 삽관을 사용한 기관내 전달에 의해 벡터를 받은 동물은 폐에서 집중된 발광을 보여주었습니다. 삽관된 동물의 평균 광도는 구인두 전달에 비해 상당히 컸으며, 이는 평균과의 차이를 사용하여 계산하여 폐로의 매개체 전달 효율성이 향상되고 전달의 변동성이 감소했음을 나타냅니다(그림 3C 및 그림 3D).

삽관 방법의 긍정적인 결과는 쥐의 폐에 최대 50μL의 복제 가능한 점안(그림 1 및 그림 3 참조)이며, 다른 영역(그림 3에서 볼 수 있듯이 상기도/코와 같은)이 아닌 폐 전체에 확산 분포가 있었습니다(그림 1에서 입증됨).

동물에게 가해진 모든 피해, 과도한 스트레스, 폐에 도달하는 액체의 양 감소, 폐에 접종물의 잘못된 분포 또는 장기간의 훈련 필요성은 부정적인 결과를 구성했지만 발생하지 않았습니다.

동영상 1: 쥐의 구인두와 성대에 대한 전통적인 내시경 보기는 초점이 맞지 않아 효과적으로 사용하기 어렵습니다. 이 내시경의 초점 거리가 3cm라는 것은 성대와 방향을 인식하기 어렵다는 것을 의미합니다. 왼쪽 하단의 혀. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 삽관은 O.P. 흡인에 비해 변동성이 적고 폐에 더 많이 전달됩니다. (A) 6-10주 암컷 BALB/c 마우스에 1x10¹¹ vg의 AAV6.2-Luciferase(Penn Vector Core)를 투여한 다음 7일 후에 생체 내 생물 발광 이미징(IVIS)으로 평가했습니다. 이미징 10분 전(30초 노출) 200μL의 루시페린(GoldBio, 15mg/mL)을 (피하) 주사했습니다. (biorender.com 로 생성) (B) OP 흡인(혀 당기기, 왼쪽) 또는 IT 전달(삽관, 오른쪽)에 의해 AAV6.2-Luciferase를 투여받은 마우스의 대표적인 IVIS 이미지. 관심 영역은 동일한 크기이며 영역 내의 평균 광도가 이미지에 표시됩니다. (C) OP 흡인(n=7) 대 삽관(n=5) 마우스에서 루시퍼라아제 신호의 정량화. p<0.0001 원시 루시페라제 데이터의 로그 변환 후 페어링되지 않은 웨일스어 t-검정에 의해. (D) 평균 평균 광도의 백분율로 나타낸 평균으로부터의 편차. (p=0.0381, 웨일스의 T-검정) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 S1: 가이드 삽관을 위해 설명된 프로토콜에 사용된 소비자용 검이경의 예시 이미지(왼쪽)와 유사한 비용 및 가용성의 내시경(오른쪽)이 표시됩니다. 이미지 간의 초점이 명확하게 다르다는 점에 유의하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 S2: 사용 중인 버블 튜브를 보여주는 예시 이미지. 일회 호흡량은 거품 튜브의 물방울을 몇 센티미터 빠르게 움직입니다. 튜브가 식도에 있는 경우 비말은 거의 움직이지 않습니다. 호흡수와 일회 호흡량은 이 방법으로 추정할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 S3: 값비싼 광섬유 조명 키트를 구입할 필요가 없는 기본 조명 어셈블리입니다. 20G 바늘을 50mL 원추형, 0.75mm 광섬유 케이블을 저렴하게(대량으로) 구입하여 면도날로 길이(~1m)로 자르고 제자리에 테이프로 붙였습니다. 카테터를 제자리에 고정하는 것은 광섬유 케이블에 꼭 맞기 때문에 불필요했습니다. 휴대폰 손전등 위에 원뿔형 뚜껑을 고정하면 어두운 방에서 삽관을 수행하기에 충분한 광 전달이 가능합니다. 이 조립은 이 기술을 통합한 실험실에서 부담하는 비용을 더욱 줄여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

삽관과 기관내 점안은 액체를 폐로 전달하는 가장 좋은 방법이지만, 쥐의 해부학적 구조로 인해 많은 어려움이 있어 폐 연구 실험실에서 널리 채택되지 못하고 있다¹⁵. 폐에 접종물을 효율적으로 전달할 수 있지만, 이 삽관 기술과 다른 삽관 기술에 의한 IT 전달의 잠재적인 단점은 상기도를 우회한다는 것입니다. 비강 내 분만은 상기도를 우회하지 않는 입증된 방법입니다. 비강 내 전달은 폐 바이러스학 실험실에서 자주 사용되며 경우에 따라 더 효과적일 수 있지만,²², 일부 흡인제에 대한 자연 노출 경로²³ 를 반영하지 않으며, 폐에서 더 다양한 양의 접종을 초래하며,²⁴, 이소플루란을 마취제로 사용할 때 덜 효과적이다⁵. 이와 같이, 에어로졸화 장치에 대한 광범위한 연구가 이루어졌고, 이를 다른 폐 전달 기술과 비교해 왔지만,²⁵ 이러한 방법은 에어로졸 관련 위험을 내포하고 비용이 많이 드는 경향이 있다. 이러한 모든 어려움으로 인해 혀 당김²⁶에 의한 구인두 점안이 이루어졌으며, 이는 많은 실험실에서 폐액 전달에 선호되는 방법입니다. 우리가 보여준 바와 같이, 이 방법은 삽관 후 기관내 점안보다 훨씬 더 다양합니다. 또한, 혀 당기는 방법에 의한 전달은 투여 중에 평가할 수 없으며, 삼키는 것을 막는 데 필요한 장력으로 인해 마우스 혀에 과도한 외상이 발생할 수 있습니다. 혀는 또한 유도 삽관 및 IT 주입 기술에서 유지됩니다. 그러나 비디오 피드는 성문(glottis)을 보여주기 때문에 이 방법을 사용하는 연구자는 혀에 상당한 긴장을 가하여 후두 위치를 강제할 필요가 없습니다. 이러한 견인력 감소는 조직 외상을 줄여줍니다. 그러나 삽관과 IT 주입으로 인한 상당한 이점에도 불구하고 일부 실험실에서는 문제가 있어 사용하는 데 걸림돌이 있었습니다. 예를 들어, 식도의 잘못된 캐넘레이션으로 인한 기관 압박은 호흡을 방해하고 사망률을 증가시킬 수 있습니다. 기관내관을 너무 깊게 삽입하면 카리나 또는 주요 기관지가 손상될 수 있습니다. 마지막으로, 전통적인 방법에 의한 쥐 삽관은 시간이 오래 걸리기 때문에 신뢰할 수 있는 폐 내 전달을 원하는 대부분의 연구자에게는 실용적이지 않습니다. 우리의 방법은 마우스 삽관과 관련된 어려움을 해결하며, 심지어 마우스 삽관에 대한 해부학적 장벽을 극복하기도 합니다.

시각 보조 도구를 구현하여 쥐 삽관의 해부학적 문제를 극복하기 위해 몇 가지 방법이 제안되었습니다. 예를 들어, 전통적인 내시경의 사용이 제안되었습니다⁶. 그러나 기구의 긴 초점 깊이는 쥐 삽관에 사용하기에 적합하지 않습니다(그림 S1). 이는 비디오 1에서도 쉽게 드러나는데, 성대는 보이지만 흐릿합니다. 임상 검이경은 직접 후두 내시경 검사에도 사용되었다¹². 그러나 임상 검이경의 비용과 비디오 피드의 부족으로 인해 대부분의 실험실에서 접근할 수 없으며 교육에 적합하지 않습니다. 널리 이용 가능한 소비자 검이경의 사용은 유도 삽관의 실용성을 크게 향상시켰습니다. 더 짧은 초점 거리, 더 작은 몸체, 확장된 억제 립은 더 선명한 비디오 피드, 더 나은 기동성 및 위치를 허용하며, 이경 립을 사용하여 혀 바닥에 압력을 가할 수 있어 rima glottidis에 대한 접근성을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 시각 보조 장치 외에도 transillumination은 성문을 성공적으로 시각화하고 마우스를 삽관하는 데 사용되었습니다 ^7,13,14. 그러나 투과조명 기반 접근 방식은 마우스 목을 오버레이하는 영역에 제모제, 뜨거운 광원에 대한 근접성, 카테터 내 바늘 사용, 마우스 입에 날카로운 기구 삽입 및/또는 배치를 확인하기 위해 기관 위에 작은 절개를 해야 할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 위험을 방지하고 게시된 방법의 가장 좋은 측면을 기반으로 합니다. 삽관에 대한 해부학적 장벽을 극복하는 것 외에도 비용 고려 사항이 본 방법에서 고려되었습니다.

도움의 손길, 마우스 스탠드, 검이경 및 광섬유 조명을 함께 사용하면 삽관을 더 쉽게 배울 수 있고 훨씬 더 빠르게 수행할 수 있어 실험실 비용을 절감할 수 있습니다. 시판되는 삽관 스탠드의 비용은 수제 삽관대를 사용함으로써 피할 수 있다²⁷. 광섬유 조명 어셈블리의 비용은 광섬유 케이블을 별도로 구입하여 충당할 수 있습니다(훨씬 저렴한 비용, ~$9 대 $218-kent scientific-작성 당시). 광섬유 광원을 완성하기 위해 핀홀과 테이프가 있는 50mL 원뿔형 뚜껑을 사용하여 휴대폰 손전등에서 빛을 수집할 수 있습니다( 그림 S3 및 재료 표 참조). Das et. al은 유사한 장치를 설명합니다¹¹. 일부 실험실의 경우 이 솔루션의 비용 절감으로 인해 이 방법을 훨씬 더 쉽게 이용할 수 있는 절차가 될 수 있습니다. 비용 외에도 기관내 튜브 배치를 확인하는 데 어려움이 있어 생쥐의 삽관을 어렵게 만들었습니다.

과거에는 기관내관이 적절한 위치에 있는지 확인하기 위해 연구자들은 기관내관 위에 치과용 거울을 들고 거울 김서림을 사용했습니다¹⁸. 그러나 작은 일회 호흡량과 실내 온도의 변화는 종종 거울 김서림을 방지하고 판단 오류로 이어집니다. 쥐 삽관의 경우 심각한 부상 위험이 있습니다. 다른 사람들은 기관내관을 막아 호흡 곤란을 유발하는 방법에 의존했다¹⁰. 이것은 동물에게 광범위한 스트레스를 유발하고 "버블 방법"보다 적은 정보를 제공합니다. 또한, 기관내관 배치에 대한 불충분한 확인으로 인해 폐 치료제와 위로의 공기가 주입되면 투여된 약제의 효과를 저해할 뿐만 아니라 고통을 유발할 수 있습니다. "버블 방법(bubble method)"을 사용하면 기관내관 배치를 더 빠르고 신뢰할 수 있는 육안으로 확인할 수 있으며, 앞서 설명한 유사한 방법을 약간 개선한 것이다²⁸. 또한 "버블 방법"을 통해 연구자는 동물의 호흡수와 일회 호흡량을 대략적으로 추정할 수 있습니다.

동물의 위치와 성대의 시각화가 이 기술의 핵심입니다. 우리는 소아 비강 검경이 너무 크고 번거로워서 삽관 중에 입을 벌리고 뺨을 방해하지 않는다는 것을 발견했지만, 연구원이 검이경 배치를 시연할 수 있게 해주었기 때문에 교육 중에 매우 도움이 되었습니다. 연수생이 관련 해부학적 구조를 인식하도록 안내하는 것은 어렵고 마우스 입의 가시성을 향상시키는 것이 핵심이었으며 이는 상업용 검이경을 사용하여 상당한 도움을 받았습니다. 조명이 달린 돋보기와 도움의 손길을 사용한 스테이징은 경험이 부족한 작업자의 삽관을 돕는 데 필수적이지만, 숙련된 작업자에게는 그다지 중요하지 않을 수 있습니다.

이 방법에 대한 교육을 받는 동안 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 기관내관이 반복적으로 식도로 들어가는 경우 성문에 경련이 일어나거나 연구개에 염증이 생길 수 있으며 적절한 배치가 더 어려울 수 있습니다. 이 상황에서는 동물이 다시 삽관을 시도하기 전에 몇 분 동안 회복할 때까지 기다립니다. 재시도 횟수는 IACUC 프로토콜에 명시되어야 하며 항상 준수되어야 합니다. 성대를 보는 데 문제가 있는 경우, 과도한 마취로 인해 호흡수가 억제되거나 마우스 위치가 부적절할 수 있습니다(가장 일반적으로 머리를 뒤로 너무 많이 기울임). 이 경우 동물의 위치를 변경하고 다시 시도하기 전에 마취에서 회복할 때까지 기다립니다. 버블 튜브는 동물의 일회 호흡량을 명확하게 보여주어야 합니다. 거품이 약간만 움직이는 경우, 잘못 배치된 기관내관에 의해 기관에 가해지는 압력으로 인한 헐떡임이 이러한 움직임을 유발할 수 있습니다. 이 경우, 타임스탬프: 8:25 및 그림 S3 을 참조하여 올바르게 배치된 기관내관에서 "버블 튜브"를 사용할 때 일회 호흡량이 얼마나 쉽게 드러나는지 확인하십시오. 기관내관을 잘못 삽입한 경우 즉시 제거하고 동물이 회복할 때까지 기다렸다가 절차를 다시 시도하십시오.

삽관과 기관내 점안은 다른 방법보다 훨씬 우수하지만, 기술적으로 너무 어려워 널리 채택되지 못했습니다. 여기에 설명된 방법은 기관내 점안과 쥐 삽관을 접근 가능하고 실용적으로 만듭니다. 이 기술의 향후 응용 분야는 폐로 전달되는 내용과 폐가 주어지는 상황에 크게 의존하겠지만, 쉽고 신뢰할 수 있는 방법은 폐 생물학의 많은 발전을 위한 길을 열어줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
광섬유 Lighti광섬유 조명 키트, 마우스	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	다른 조명 및 대체 광섬유 케이블과 호환되는 광섬유 어셈블리의 구성 요소
Fiberoptic Assembly	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	논의되지 않음(그러나 작동하지 않을 이유는 없습니다)
대체 광섬유 어셈블리	Harvard 장치	72-9075	대안, 논의되지 않음(그러나 작동하지 않을 이유는 없습니다)
실에서 수작업으로 만든	대체 광섬유 어셈블리	N/A	고무 마개를 사용하여 여기에서 찾을 수 있는 지침: DOI 10.3791/50318
실험실에서 수작업으로 만든	대체 광섬유 어셈블리	N/A(아래 나열된 재료)	50mL 원추형 뚜껑, 테이프 및 0.75mm 광섬유
삽관 스탠드, 마우스	Kent Scientific 로 제작;	ETI-MSE-01	삽관을 위한 조정 가능한 스탠드, 많은 자체 제작 버전 사용 가능, 팁 랙 및 목재 플랫폼 사용, 일부 대안에는 사용 가능한 많은 적합한 대안이 나열되어 있습니다.
대체 삽관 스탠	Braintree Scientifuc	RIS 100	대안, 논의되지 않음(그러나 작동하지 않을 이유는 없습니다)대체
삽관 스탠	Natsume Seisakusho	KN-1014	논의되지 않음(그러나 작동하지 않을 이유는 없습니다)대체
삽관 스탠드	Vetland	000A3467	대안, 논의되지 않음(그러나 작동하지 않을 이유는 없습니다)
실에서 수작업으로 만든	삽관 스탠	N/A	여기에서 3링 바인더로 제작: DOI 10.3791/60844(여러 대체 방법 게시됨)
비흡수성 꼰 실크 봉합사, 크기 0	정밀 과학 도구	18020-00	1인치보다 길면 용골&NBSP가 손상됩니다.
Safelet IV 카테터 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	또는 이와 유사한
RS-5358 마이크로 해부 겸자	Fisher	RS-5358	또는 이와 유사한 손길을 포함합니다
조명과 스탠드가 있는 돋보기, EOOKU 유연한 마그네틱 헬프, 5X& 10X 12V 108pcs LED 구슬 돋보기 램프, 3가지 모드 조정 가능한 회전 구즈넥 암 및 헤비 듀티 베이스 플레이트	아마존	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-플렉시블-조절 가능-구즈넥 /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9입니다. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-MREW . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& 키워드=돋보기+유리+with +빛+EOOKU+3+in+1& qid=1709661 709& 접두사=돋보기+유리+with+ 빛+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	또는 이와 유사한 구부러진 미세한 톱니 모양의 집게가 작동합니다
귀지 제거 - 귀지 제거 도구(8개 귀 세트 포함) - 카메라가 있는 귀지 클리너 - 조명이 있는 귀지 제거 키트 - 6개의 귀 숟가락이 있는 귀지 카메라 - iOS 및 용 귀 클리너 안드로이드 (블랙)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- 제거-제거제-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1AD2066F-97D2-4731 -9356-36B3EDF1AE04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC = 1	또는 이와 유사한 여러 브랜드 사용 가능
AZIMOM PMMA 플라스틱 엔드 글로우 광섬유 케이블 0.75mm(0.02in) 100m(328ft)/롤 별 하늘 천장 모든 종류의 LED 경량 엔진 드라이버 소스	아마존	https://www.amazon.com/AZIMOM -plastic-cuttable-ceiling-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY. AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& 키워드=섬유%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& SR =8-9& th=1	또는 이와 유사한 섬유는 라인 7 50mL 원추형 튜브 세포 처리의 장치를 구축하는 데 사용되며
			투명 플라스틱 50mL 나사 캡 원추형 뚜껑이 작동해야 229421. 동물과 접촉하거나 근접하지 않으므로 불임이 필요하지 않습니다
이소플루란	VetOne	은 수의사 직원
Innoculum 에 문의하십시오.	N/A
펫 팁(필터)	N/A	멸균 필터 p100 및 p1000 팁 사용	/공급업체 관련 없음
유도 챔버	N/A	귀하의 기관에서 사용 가능한 브랜드	/공급업체는 관련 없음
이소프로판올 준비 패드	N/A	기기 청소용	브랜드/공급업체는 관련 없음
튜빙	N/A	작은 직경의 유연한 튜브가 작동합니다	"버블 튜브"  건설용; (우리의 직경은 ~3mm이며 IV 라인에서 가져왔습니다)
위의 튜브에 맞는	루어 잠금	장치 N/A	"버블 튜브"
3M 하프 페이스 마스크 호흡기	3M	17-986-9B	가스 노출 제한
트위스트 타이	N/A	/A	블 튜브의 U자형을 유지하기 위해