이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

Mycobacterium tuberculosis에서 배양 여과액 단백질(CFP)의 분리 및 분획

880 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

2025년 7월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Mycobacterium tuberculosis의 분비된 단백질의 배양, 수확 및 농축을 설명합니다. 배양 여과액 단백질(CFP)을 정량화하고, 등전 집속으로 20개의 분획으로 분리하고, 분취용 SDS-PAGE 및 전기 용출 시스템을 사용하여 30개의 분획으로 추가로 분해합니다.

초록

결핵균(M. tuberculosis)의 분비 단백질은 결핵 발병, 면역 조절 및 질병 진행에 중요한 역할을 합니다. 결핵의 구성과 기능을 이해하는 것은 결핵 진단, 백신 개발 및 치료 개입에 도움이 될 수 있는 새로운 바이오마커를 식별하는 데 필수적입니다. 이 연구는 포괄적인 면역학 및 단백질체학 분석을 가능하게 하기 위해 배양 여과액 단백질(CFP)의 체계적인 분리, 분획 및 특성화에 중점을 둡니다. CFP는 제어된 단백질 발현을 보장하기 위해 화학적으로 정의된 조건에서 성장한 M. tuberculosis H37Rv 배양물에서 얻었습니다. 배양 상등액을 여과를 통해 정제하고 10kDa 이상의 단백질을 유지하기 위해 중공사 시스템을 사용하여 농축했습니다. 분획법은 액상 등전 집중을 통해 달성되었으며, 등전점을 기반으로 단백질을 20개의 별개의 분획으로 분리했습니다. 분취용 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 추가 분해능을 수행한 후 전기용출을 수행하여 30개의 단백질 분획을 생성했습니다. 이 접근법을 통해 얻은 분획 단백질은 면역학적 프로파일링 및 질량 분석 기반 단백질체학 분석을 위한 귀중한 자원을 제공합니다. 이 연구는 분비된 단백질을 체계적으로 분리하고 특성화함으로써 결핵 특이적 단백질 바이오마커를 식별하는 데 기여하여 진단 정확도를 높이고 결핵 발병에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

서론

광범위한 연구를 통해 Mycobacterium tuberculosis의 성장과 면역 상호작용에서 분비된 단백질의 중요한 역할이 강조되었습니다 1. M. tuberculosis의 배양 여과액에는 단백질 및 비단백질 성분이 복합적으로 배열되어 있어 생물학적 및 면역원성 특성을 이해하는 데 유용한 자원입니다. 초기 단백질체학 연구에서는 배양 여과액2에서 거의 450개의 단백질이 확인되었으며, 그 중 다수는 결핵에 대한 면역 반응을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다. 이러한 면역학적으로 관련된 항원을 식별하는 것은 혁신적인 결핵 진단 및 백신을 개발하는 데 필수적입니다. 그러나 이 분야의 진전은 M. tuberculosis 감염에 대한 면역 반응의 복잡성과 마이코박테리아 단백질을 분리하는 데 사용되는 생화학적 정제 방법의 기술적 한계로 인해 어려움을 겪고 있습니다.

M. tuberculosis 단백질을 분해하기 위해 다양한 분리 기술이 사용되어 작지만 기능적으로 중요한 단백질의 검출을 용이하게 하고 단백질체 연구의 범위를 확장했습니다. 이상적인 분리 방법은 복잡한 단백질 혼합물을 제한된 수의 별개의 분획으로 효과적으로 분해합니다. 마이코박테리아 단백질을 분리하기 위해 널리 사용되는 두 가지 방법은 크로마토그래피 기반 방법과 전기영동 기반 방법 1,2입니다.

친화성(affinity), 이온 교환(ion exchange) 및 역상 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피 기술은 10년 이상 단백질 분획의 초석이었습니다. 이러한 방법은 M. tuberculosis 단백질을 분리하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다3. 그러나 낮은 단백질 수율 및 비단백질 성분의 간섭과 같은 요인에 의해 제한되며, 이는 후속 면역학적 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이러한 단점은 면역학적으로 관련된 항원을 식별하기 위한 크로마토그래피의 유용성을 제한합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 2차원 전기영동 기반 분리 방법이 채택되었습니다. 1차원에서 단백질은 등전점에 따라 단백질을 분리하는 분취 IEF 시스템을 사용하여 등전 집중(IEF)을 기반으로 분리됩니다. 2차원에서 단백질은 분취용 SDS-PAGE를 사용하여 분자량에 의해 추가로 분해된 다음 전체 겔 용출기 기기로 용출됩니다.

이 2차원 접근 방식은 몇 가지 이점을 제공합니다. 배양 여과액 단백질(CFP)을 600개의 개별 분획으로 분획하여 CFP의 복잡성을 크게 줄입니다. 또한, 이 분획은 용출 과정이 세포 면역학적 분석을 방해하는 성분을 도입하지 않기 때문에 직접 면역학적 분석에 적합합니다 4,5,6.

이 프로토콜은 면역학적 분석을 위한 배양 여과액 단백질의 준비 및 분리에 대해 자세히 설명합니다6.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 결핵 균의 성장 및 배양 여과액 단백질(CFP)의 제조

  1. Sauton의 액체 매체의 준비
    1. 950 mL의 증류수에 다음 성분을 결합하십시오 : 글리세롤, 30.0 mL; 칼륨 이수소 오르토 포스페이트 (KH2PO4 ), 0.5g; 황산 마그네슘, 0.5g; 구연산, 2.0g; 카제인 가수 분해물, 0.5g; 황산 제 2 철 암모늄, 0.05g; 글루타민산나트륨, 4.0g.
    2. 40% 수산화칼륨(약 5mL/L)을 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
    3. 부피를 1L로 구성하고 15psi에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
  2. 마이코박테리아 현탁액의 준비
    1. Lowenstein-Jensen(LJ) 경사면에서 성장한 Mycobacterium tuberculosis H37Rv(ATCC 27294)의 집락을 Sauton의 액체 배지 2mL로 이동합니다.
    2. 멸균 상태에서 유리 구슬로 세게 흔들어 마이코박테리아 덩어리를 분해합니다.
  3. 마이코박테리아 성장 시작
    1. 박테리아 현탁액을 10mL의 Sauton's 액체 배지가 들어 있는 McCartney 병으로 옮깁니다.
    2. 37 ° C에서 2 주 동안 병을 배양하십시오.
  4. 문화 확대
    1. 성장한 배양액을 1L 병에 담긴 200mL의 Sauton 배지로 옮깁니다.
    2. 37 °C의 쉐이커에서 4 주 동안 배양하십시오.
    3. log-phase 배양을 2L의 Sauton 배지를 포함하는 4L 플라스크로 옮깁니다.
    4. 표면 펠리클이 형성될 때까지 추가로 4주 동안 정지 상태에서 37°C에서 배양물을 성장시킵니다.
  5. 배양 여과액 단백질(CFP) 수확
    1. 실온에서 30분 동안 1,000-1,500 x g 에서 원심분리하여 배양액을 수확합니다.
    2. 0.45μm 진공 여과 시스템을 통해 상층액을 여과합니다.
    3. 10kDa 컷오프가 있는 접선 흐름 여과 시스템을 사용하여 CFP가 포함된 여과액을 농축합니다.
  6. 수확된 CFP 저장
    1. 시판되는 BCA 분석 키트를 사용하여 단백질 함량을 추정합니다.
    2. 단백질을 분주하고 아지드화나트륨을 최종 농도 0.2%까지 첨가한 후 -80°C에서 보관합니다.

2. 분취용 액상 등전 포커싱(IEF)

  1. 단백질 시료 준비
    1. 8M의 요소, 1mM의 디티오트레이톨(DTT), 5% 글리세롤, 2% 디지토닌, 2% 양쪽 처리(pH 3.0-10.0 및 pH 4.0-6.0, 1:4 비율)를 포함하는 60mL의 IEF 분리 완충액에 Mycobacterium tuberculosis CFP를 용해합니다.
  2. IEF 시스템 설정
    1. 양극 챔버를 0.1M 인산으로 채우고 음극 챔버를 0.1M 수산화나트륨으로 채웁니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 분취용 IEF 셀을 조립합니다( 재료 표 참조).
  3. IEF 수행
    1. IEF 시스템에 최대 350mg의 단백질을 로드합니다.
    2. 냉각 순환수 시스템으로 4°C에서 단백질에 집중합니다.
    3. 전압이 약 1400V에서 안정화될 때까지 12W의 일정한 전력을 적용한 다음 추가로 30분 동안 계속합니다.
  4. 분획 수집 및 분석
    1. IEF 분획을 수확하고 pH를 측정합니다.
    2. SDS-PAGE로 각 부분 표본을 분석하고 은 염색을 사용하여 단백질을 시각화합니다.

3. 분취용 SDS-PAGE 및 전체 젤 용출

  1. SDS-PAGE용 샘플 준비
    1. IEF 분획을 시판되는 6x SDS-PAGE 시료 버퍼와 혼합합니다.
    2. 혼합물을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 분취용 SDS-PAGE 실행
    1. 16cm × 20cm 폴리아크릴아미드 겔에 4% 스태킹 겔과 12.5% 분해 겔이 있는 최대 10mg의 단백질을 로드합니다.
    2. 염료 선단이 바닥에서 2cm 떨어질 때까지 50mA의 정전류로 전기영동을 실행합니다.
  3. 겔에서 단백질 용출
    1. 용출 완충액(60mM의 Tris, 40mM의 CAPS, pH 9.4)에서 겔을 10분 동안 평형화합니다.
    2. 겔을 전체 젤 용출 기기로 옮깁니다.
    3. 1시간 동안 250mA의 정전류를 적용하여 단백질을 용리합니다.
  4. 분획 수집 및 분석
    1. 분리된 단백질을 각각 2.5mL의 부피를 가진 30개의 개별 분획으로 용리합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 추정 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
    3. SDS-PAGE로 각 분획에서 10μg의 단백질을 분석하고 은 염색을 사용하여 시각화합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

그림 1은 준비된 배양 여과액 단백질(CFP)의 복잡성을 보여줍니다. 초기에는 100μg의 CFP를 2D-SDS PAGE 분석을 통해 복잡성을 평가했습니다. 이 분석을 통해 CFP에 거의 100개의 뚜렷한 단백질 반점이 존재하는 것으로 나타났습니다(그림 1).

각 실행에서 수집된 20개의 분획을 SDS-PAGE로 분석했습니다. 이 중 3개의 서로 다른 런에서 3개의 대표 분수가 그림 2에 나와 있습니다.

그림 3은 2.54에서 12.9 범위의 분리된 분획의 pH 분포를 보여줍니다. 대부분의 분획(분획 5 - 14)은 pH가 4와 6 사이였으며, 여기서 대부분의 마이코박테리아 단백질이 집중되어 있었습니다. 분획 전반에 걸...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

Mycobacterium tuberculosis의 배양 여과액 단백질(CFP)은 다양한 농도로 존재하는 다양한 단백질 성분의 복잡한 혼합물을 나타냅니다. 단백질체학 연구는 CFP 내에서 최대 1,314개의 단백질을 확인했습니다 4,5. 수많은 연구에서 면역 반응을 조절하는 데 CFP의 중요한 역할이 강조되었습니다. 특히, CFP는 T 세포 반응 4,5,6,7 및 B 세포 매개 항체 반응 8,9,10,11

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ä KTA 플럭스 접선 흐름 여과 시스템 사이티바29038437
양쪽 전해질 (pH 3.0 - 10.0 )바이오 RAD1632094
양쪽 전해질 (pH 4.0 - 6.0 )바이오 RAD1631143
BCA 단백질 분석 머 크71285-엠
모자머 크C2632
카제인 가수분해물머 크65072-00-6
구연산머 크C0759
디지토닌머 크300410
DTT머 크D9779
황산철 암모늄히미디어GRM10944
글리세롤머 크지5516
글리세롤 머 크252859
Lowenstein-Jensen 경사 히미디어SL001
황산마그네슘머 크M7506
Millipore Stericup 퀵 릴리스 진공 여과 시스템머 크S2HVU11RE
인산 머 크695017
칼륨 이수소 오르토인산염머 크P0662
수산화칼륨 머 크484016
분취 IEF 셀(Rotofor) 바이오 RAD170-2986 
아지드나트륨 머 크S2002
글루타민산나트륨머 크49621
수산화나트륨히미디어MB095
트리스머 크252859
요소머 크U5128
전체 젤 용출 장치 바이오 RAD1651250

참고문헌

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

단백질 분획등전점 전기영동SDS-PAGE단백질 바이오마커면역학적 프로파일링접선 흐름 여과단백질체 분석T세포 항원
Mycobacterium tuberculosis에서 배양 여과액 단백질(CFP)의 분리 및 분획
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.