방법 논문

다운스트림 단백질 분석을 위한 결핵균 의 세포벽 및 세포막 단백질의 분리 및 분획

DOI:

10.3791/67680

⸱

2025년 9월 26일

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 등전점을 기반으로 한 분취 등전 초점(IEF)을 사용하여 불용성 세포벽 및 막 단백질을 간단한 분획(1-5 단백질)으로 분리한 다음 분자량으로 분리합니다. 생성된 분획은 추가 정제 없이 면역학적 및 단백질체학 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결핵 발병기전에서 중심적인 역할을 하는 마이코박테리움 세포벽 및 막 단백질은 분취 등전 초점(IEF) 및 분취 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 성공적으로 분리되었습니다. 이어서 소수성 단백질 분리를 위한 기존 방법의 한계를 극복하는 겔 용출이 이어집니다. 이 절차에서 M. tuberculosis 콜로니를 Lowenstein-Jensen 경사에서 2mL의 7H9 국물로 옮기고 유리 구슬로 분산시키고 37°C에서 2주 동안 배양했습니다. 그런 다음 배양액을 최대 200mL로 확대하고 셰이커에서 4주 동안 성장시켰습니다. 7H9 국물 500mL로 1L로 더 확대하고 추가로 4주 동안 성장시켰습니다. 성장한 마이코박테리아를 1741 × g에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화했습니다. 각 2g 펠릿에 대해 1mL의 파괴 완충액을 첨가하고 샘플을 초음파 처리했습니다. 용해물을 3436 × g 에서 15분 동안 원심분리하여 깨지지 않은 세포를 제거하고 상청액을 농축했습니다. 이 상청액(전체 세포 용해물)을 13751 × g 에서 30분 동안 원심분리하여 세포벽 단백질을 펠릿화했습니다. 나머지 상청액을 100,000 × g 에서 4시간 동안 초원심분리하여 세포막과 세포질을 분리하였다. 분리된 세포벽 및 막 단백질을 4°C에서 액체 분취 IEF 시스템에 로드하고 전압이 1400V에서 안정화될 때까지 12W에서 분리하여 20개의 분획을 분리했습니다. 이러한 IEF 분획은 분취 SDS-PAGE에 의해 추가로 분리되었고, 단백질은 250mA에서 전체 겔 용출기를 사용하여 용출되어 30개의 분획을 생성했습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 새로운 M. tuberculosis 세포벽과 막 특이적 바이오마커를 식별할 수 있었고 다른 병원체에서 유사한 단백질을 특성화할 수 있는 잠재력도 보여줍니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역학적 연구에 따르면 정제하기 쉬운 수용성 단백질 외에도 결핵균과 같은 병원체에 대한 인간 면역 반응은 결핵균의 세포벽1 및 세포막 단백질2에 존재하는 소수성 단백질도 지시되는 것으로 나타났습니다. 이러한 세포벽 및 막 단백질은 결핵을 포함한 많은 병원체에 대한 면역학적 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 단백질 중 일부는 T 및 B 세포 반응을 일으키는 면역우성 항원으로 보고됩니다. 대조적으로, 다른 단백질은 면역 세포에 의한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)과 같은 선천적 면역 반응을 시작하는 것으로 인식되어 면역 반응을 시작하는 것으로 인식되는 병원체의 분자 시그니처로 확인됩니다. 예를 들어, LprG, LpqH, LprA 및 PhoS1과 같은 마이코박테리아 지단백질은 Toll 유사 수용체 23에 의해 인식됩니다.

세포벽과 막 단백질의 소수성 특성은 가용화 및 분리 측면에서 중요한 기술적 과제를 제시합니다. 연구에 따르면 막 단백질은 마이코박테리아를 포함한 모든 유기체의 코딩 영역의 약 20%에서 30%를 구성합니다 4,5. 세포벽 및 막 단백질은 고유한 특성과 기술적 문제로 인해 가용성 단백질에 비해 가용화 및 분리가 더 어렵습니다. 그 결과, 막 단백질 구조의 2%만이 보고되었습니다6. 이러한 단백질을 분리하는 데 어려움을 겪는 데는 몇 가지 요인이 있습니다. 주요 과제는 세포 내 존재도가 낮기 때문에 추가 특성화를 위해 개별 단백질을 분리하는 것이 복잡해집니다7. 또한 이러한 단백질은 응집되는 경향이 있어 용해도가 더욱 복잡해집니다. 이 문제는 가용화를 돕기 위해 세제를 추가하여 해결할 수 있습니다. 그러나 일부 단백질은 세제가 있는 경우에도 여전히 응집체를 형성할 수 있으며, 이 경우 카오트로픽제와 환원제를 사용하여 용해도를 향상시킬 수 있습니다.

가용화를 위해 세제를 사용하면 후속 분리 방법을 방해할 수 있습니다. 예를 들어, 하전 세제는 이온 교환 크로마토그래피와 함께 사용할 수 없으며 모든 세제는 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 방해할 수 있습니다8. 따라서 선택한 분리 방법과 호환되는 세제를 선택하는 것이 중요합니다. 세포벽 및 막 단백질 분리의 또 다른 중요한 단계는 가용화에 사용되는 세제를 제거하는 것인데, 이는 단백질의 후속 기능 분석을 방해할 수 있기 때문입니다.

우리는 막 단백질, 특히 세포벽과 세포막의 소수성 단백질 분석과 관련된 많은 문제를 극복하는 강력한 방법론을 개발했습니다. 이러한 단백질을 연구할 때 주요 과제는 소수성 특성으로 인해 추출 및 분석이 어렵기 때문에 가용화입니다. 여기에 설명된 방법론은 세포벽과 세포막 단백질을 효율적으로 가용화하는 특별히 제조된 등전 초점(IEF) 완충액을 사용합니다. 이 가용화 단계는 이러한 소수성 단백질의 후속 분석을 가능하게 하므로 매우 중요합니다.

이 방법의 또 다른 장점은 단백질 혼합물의 복잡성을 줄이는 능력입니다. 단백질의 등전점(pI)과 분자량을 기반으로 하는 두 가지 상보적 분리 기술을 사용함으로써 이 방법론은 세포벽과 세포막 단백질을 단순화된 분획으로 효율적으로 분리합니다. 각 분획에는 일반적으로 1-3개의 단백질만 포함되어 있어 분해능이 크게 향상되고 다운스트림 특성 분석이 용이합니다.

결핵균 세포벽과 세포막 단백질을 모델 시스템으로 사용하여 개발된 이 방법론은 소수성 단백질 분리 및 분석과 관련된 문제를 효과적으로 해결합니다. 이는 이러한 복잡한 단백질 분획의 분리, 분리 및 특성화를 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공하여 이를 자세히 연구할 수 있는 능력을 향상시킵니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 관련 정부 지침을 준수했으며 기관 과학 자문 위원회 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 샘플을 채취하기 전에 연구 모집단으로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 결핵균 배양

  1. 약 10개의 M. tuberculosis 콜로니를 Lowenstein-Jensen 경사에서 2mL의 7H9 국물 배지로 옮깁니다(2.35g의 Middlebrook 7H9 국물 베이스를 400mL의 증류수, 50mL의 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제[OADC] 보충제, 0.5g의 Tween 80에 현탁하여 최대 500mL까지 함유)
    참고: M. tuberculosis 는 위험군 3 병원체입니다. BSL3 시설의 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 처리해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
  2. 멸균 조건에서 유리 구슬을 사용하여 병 셰이커에서 15rpm에서 1분 동안 세포를 분산시킵니다.
  3. 박테리아 현탁액을 McCartney 병에 담긴 10mL의 7H9 국물 배지로 옮기고 30rpm의 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 2주 동안 배양합니다.
  4. 로그상 배양액을 200mL의 7H9 국물 배지로 확대하고 30rpm에서 4주 동안 셰이커 배양에서 성장시킵니다.
  5. 또한, 500mL의 7H9 국물 배지를 포함하는 1L 플라스크에서 배양액을 스케일업하고 37°C에서 4주 동안 30rpm에서 셰이커 배양으로 성장시킵니다.
  6. 마이코박테리아를 1741g에서 30분 동안 원심분리하여 수확합니다.

2. 전세포 용해물 단백질의 제조

  1. 분리 된 박테리아 펠릿을 표준 프로토콜에 따라 초음파 처리합니다.
  2. 8.5%(100mL당 8.5g) NaCl이 포함된 20mM Tris와 같은 구성으로 파괴 완충액을 준비합니다.
  3. 농축된 HCl로 최종 pH를 7.4로 조정합니다.
  4. 새로 제조된 프로테아제 억제제를 다음 농도로 파괴 완충액에 첨가한다(첨가할 프로테아제 억제제의 세부 사항은 보충 표 1에 나열되어 있다)
  5. 박테리아 세포 펠릿 2g당 M . tuberculosis bacilli(100mL 포장 부피 및 계량)를 처리하고, 리소자임(세포 현탁액 1mg/5mL)과 함께 파괴 완충액 1mL를 첨가하고 부드럽게 교반하면서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  6. 분쇄 완충액의 두 배에 간균을 현탁시킵니다.
  7. 완충액에 0.04%(wt/vol) 아지드나트륨과 0.05% Tween 80을 첨가합니다.
  8. 40% 진폭에서 30분 동안 9초 켜고 9초 꺼짐의 주기로 초음파 처리기를 사용하여 파쇄 완충액의 박테리아 세포를 파괴하고 단백질 변성을 방지하기 위해 현탁액을 얼음 위에 유지합니다.
  9. 준비된 용해물을 3438g에서 4°C에서 15 분 동안 원심분리하여 깨지지 않은 세포를 제거합니다.
  10. 원심 농축기(3kDa 컷오프 - 5mL)를 사용하여 상청액을 농축합니다.
  11. BSA 단백질을 표준으로 사용하는 비신코닌산(BCA) 단백질 정량 분석을 사용하여 상청액의 단백질 농도를 결정합니다.
    참고: SDS-PAGE 분석에서 분석을 위해 50μg 단백질을 로드합니다.

3. 초원심분리에 의한 세포벽 및 세포막 단백질의 분리

  1. Raja et al.9의 프로토콜에 따라 전체 세포 용해물에서 세포벽, 세포막 및 세포질 단백질을 분리합니다. 아래에 설명된 대로.
  2. 전체 세포 용해물을 4°C에서 13751 × g 에서 30분 동안 원심분리하여 세포벽 단백질을 펠릿으로 분리합니다.
  3. 초원심분리기를 사용하여 상청액을 4°C에서 100,000 × g 에서 4시간 동안 초원심분리하여 세포막 단백질을 펠릿으로 분리하고 세포질 단백질을 상청액에 남깁니다.
  4. BCA 단백질 분석을 사용하여 세포벽 및 세포막 분획의 단백질 농도를 추정합니다.
    참고: SDS-PAGE 분석에서 분석을 위해 50μg 단백질을 로드합니다. 분리된 세포벽과 세포막은 추가 분석이 있을 때까지 -80°C 냉동고에 보관됩니다.

4. 분취 액상 등전 초점(Rotofor[IEF 장치])

  1. 초원심분리에 의해 분리된 세포벽 및 세포막 단백질을 8 M 요소, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, 2% 디지토닌을 포함하는 IEF 완충액에 가용화합니다.
  2. 2% 양쪽전해질(pH 3.0 - 10.0 및 pH 4.0 - 6.0, 1:4 비율) 첨가
  3. 냉각수 수조와 함께 4°C로 유지되는 액체 IEF 시스템을 사용하여 가용화된 단백질을 분획합니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 IEF 분리를 수행하고 전압이 안정화될 때까지(1300V에서 1600V 사이) 12W의 일정한 전력을 적용합니다.
  5. 전압 안정화 후 추가로 30분 동안 IEF 실행을 계속하며 총 실행 시간은 약 5-6시간입니다.
  6. 진공 펌프를 사용하여 개별 IEF 분획을 수집하고 pH 값을 결정합니다.
  7. 분리된 분획(50μg)을 SDS-PAGE에 노출시키고 CBB(Coomassie Brilliant Blue) 또는 은 염색을 사용하여 단백질을 시각화합니다. 분리된 IEF 분획은 추가 분석이 있을 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다.

5. 분취 SDS-PAGE 및 전체 겔 용출

  1. IEF로 분리된 세포벽 및 세포막 분획을 6x SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하고 SDS-PAGE 분석 전에 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 12.5% 분해능 겔과 4% 스태킹 겔로 구성된 16cm 20cm 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 2차원에서 단백질 분획을 분리합니다.
  3. 샘플을 로드하기 위해 13cm 길이의 단일 샘플 웰을 사용합니다.
  4. 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 50mA/gel의 정전류로 전기영동을 수행합니다.
  5. 전기 영동 실행 후 10분 동안 용출 완충액(60mM Tris, pH 9.4; 40mM 3-(Cyclohexylamino)-1-프로판술폰산[CAPS])에서 겔을 평형화합니다.
  6. 기기 제조업체의 설명에 따라 젤을 전체 젤 용출 장치로 옮깁니다.
  7. 용출기를 250mA의 정전류로 1시간 동안 작동시켜 겔에서 단백질을 용리합니다.
  8. 진공 펌프를 사용하여 각 젤에서 각각 3mL의 부피를 가진 약 30개의 단백질 분획을 수집합니다.
  9. BCA 단백질 분석을 사용하여 용출된 분획의 단백질 농도를 정량화합니다.
  10. 용출된 분획 10μg을 SDS-PAGE 분석에 적용하고 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색으로 시각화합니다.
    참고: 분리된 전체 겔 용출 분획은 추가 분석이 있을 때까지 -80°C 냉동고에 보관되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고속 초원심분리에 의한 세포벽 및 세포막 단백질 분리
세포벽 및 막 단백질은 프로토콜에 설명된 대로 초원심분리를 통해 전체 세포 용해물에서 분리되었습니다. M. tuberculosis 의 분리된 세포내 분획-세포벽, 세포막 및 세포질 단백질 프로파일의 SDS-PAGE 분석이 그림 1에 나와 있습니다.

분취 액상 등전 포커싱에 의한 세포벽 단백질의 분리
Mycobacterium tuberculosis 세포벽 단백질은 프로토콜에 설명된 대로 IEF 완충액을 사용하여 가용화되었습니다. 가용화된 단백질은 등전점을 기준으로 20개의 분획으로 분리되었습니다. 그림 2 는 IEF로 분리된 세포벽 분획의 pH 프로파일을 보여줍니다. 단백질 프로파일을 보여주는 이러한 분획의 SDS-PA...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포벽과 막 단백질의 소수성 특성은 가용화 및 분리에 있어 중요한 실험적 과제를 제시합니다. 위에서 언급한 프로토콜에서 우리는 이러한 소수성 단백질을 효과적으로 분리하기 위한 새로운 2차원 전기영동 기반 분리 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜에서 우리는 처음에 액체 IEF 시스템을 사용하여 등전점을 기반으로 막과 세포벽 단백질을 분리했습니다. 가용화 문제를 해결하기 위해 고농도의 카오트로픽제(요소)와 세제(디지토닌)를 사용했는데, 이는 이러한 단백질의 가용화를 촉진하고 초기 분리 중에 가용화 문제 없이 더 높은 단백질 농도를 로딩할 수 있도록 했습니다. 또 다른 장점은 이러한 가용화제가 분획에 사용되는 IEF 완충액에 필수적이어서 단백질 샘플의 추가 희석을 방지한다는 것입니다.

IEF로 분리된 분획은 SDS-PAGE 절차를 사용하여 분자량으로 다시 분해되었습니다. SDS-PAGE로 분리된 단백질은 Tris-CAPS 완충...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 KR Uma Devi 박사의 DST SERB 보조금으로 전폭적으로 지원됩니다. B. Ramalingam 박사는 DBT-Ramalingaswamy 펠로우십의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7H9 국물 히미디어 M198
40% 바이오 해정 3/10 Ampholyte 바이오 RAD1631113
BCA 단백질 분석 머 크BCA1
바이오 라이트 5/7 Ampholyte 바이오 RAD1631152
원심 농축기 3 kDa머 크Z629456
디지토닌.머 크D141
드나제머 크11284932001
DTT머 크D9779
EDTA머 크E9884
에그타머 크E3889
글리세롤머 크지5516
류펩틴머 크18회
펩스타틴 A머 크P5318
PMSF머 크78830
르나제머 크10109134001
로토포 바이오 RAD170-2986  등전초점(IEF) 장치
초음파 처리기비브라 셀, 소닉스VC 750 시리즈
TLCK머 크T7254
TPCK머 크4376
요소머 크U5378
전체 젤 용출 장치 바이오 RAD1651250

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
  10. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).
  11. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
  13. Deenadayalan, A., et al. An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Med Res Arch. 11 (11), (2023).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

SDS PAGE

관련 논문