Method Article

다운스트림 단백질 분석을 위한 결핵균 의 세포벽 및 세포막 단백질의 분리 및 분획

DOI:

10.3791/67680

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 등전점을 기반으로 한 분취 등전 초점(IEF)을 사용하여 불용성 세포벽 및 막 단백질을 간단한 분획(1-5 단백질)으로 분리한 다음 분자량으로 분리합니다. 생성된 분획은 추가 정제 없이 면역학적 및 단백질체학 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결핵 발병기전에서 중심적인 역할을 하는 마이코박테리움 세포벽 및 막 단백질은 분취 등전 초점(IEF) 및 분취 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 성공적으로 분리되었습니다. 이어서 소수성 단백질 분리를 위한 기존 방법의 한계를 극복하는 겔 용출이 이어집니다. 이 절차에서 M. tuberculosis 콜로니를 Lowenstein-Jensen 경사에서 2mL의 7H9 국물로 옮기고 유리 구슬로 분산시키고 37°C에서 2주 동안 배양했습니다. 그런 다음 배양액을 최대 200mL로 확대하고 셰이커에서 4주 동안 성장시켰습니다. 7H9 국물 500mL로 1L로 더 확대하고 추가로 4주 동안 성장시켰습니다. 성장한 마이코박테리아를 1741 × g에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화했습니다. 각 2g 펠릿에 대해 1mL의 파괴 완충액을 첨가하고 샘플을 초음파 처리했습니다. 용해물을 3436 × g 에서 15분 동안 원심분리하여 깨지지 않은 세포를 제거하고 상청액을 농축했습니다. 이 상청액(전체 세포 용해물)을 13751 × g 에서 30분 동안 원심분리하여 세포벽 단백질을 펠릿화했습니다. 나머지 상청액을 100,000 × g 에서 4시간 동안 초원심분리하여 세포막과 세포질을 분리하였다. 분리된 세포벽 및 막 단백질을 4°C에서 액체 분취 IEF 시스템에 로드하고 전압이 1400V에서 안정화될 때까지 12W에서 분리하여 20개의 분획을 분리했습니다. 이러한 IEF 분획은 분취 SDS-PAGE에 의해 추가로 분리되었고, 단백질은 250mA에서 전체 겔 용출기를 사용하여 용출되어 30개의 분획을 생성했습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 새로운 M. tuberculosis 세포벽과 막 특이적 바이오마커를 식별할 수 있었고 다른 병원체에서 유사한 단백질을 특성화할 수 있는 잠재력도 보여줍니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역학적 연구에 따르면 정제하기 쉬운 수용성 단백질 외에도 결핵균과 같은 병원체에 대한 인간 면역 반응은 결핵균의 세포벽1 및 세포막 단백질2에 존재하는 소수성 단백질도 지시되는 것으로 나타났습니다. 이러한 세포벽 및 막 단백질은 결핵을 포함한 많은 병원체에 대한 면역학적 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 단백질 중 일부는 T 및 B 세포 반응을 일으키는 면역우성 항원으로 보고됩니다. 대조적으로, 다른 단백질은 면역 세포에 의한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)과 같은 선천적 면역 반응을 시작하는 것으로 인식되어 면역 반응을 시작하는 것으로 인식되는 병원체의 분자 시그니처로 확인됩니다. 예를 들어, LprG, LpqH, LprA 및 PhoS1과 같은 마이코박테리아 지단백질은 Toll 유사 수용체 23에 의해 인식됩니다.

세포벽과 막 단백질의 소수성 특성은 가용화 및 분리 측면에서 중요한 기술적 과제를 제시합니다. 연구에 따르면 막 단백질은 마이코박테리아를 포함한 모든 유기체의 코딩 영역의 약 20%에서 30%를 구성합니다....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 관련 정부 지침을 준수했으며 기관 과학 자문 위원회 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 샘플을 채취하기 전에 연구 모집단으로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 결핵균 배양

  1. 약 10개의 M. tuberculosis 콜로니를 Lowenstein-Jensen 경사에서 2mL의 7H9 국물 배지로 옮깁니다(2.35g의 Middlebrook 7H9 국물 베이스를 400mL의 증류수, 50mL의 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제[OADC] 보충제, 0.5g의 Tween 80에 현탁하여 최대 500mL까지 함유)
    참고: M. tuberculosis 는 위험군 3 병원체입니다. BSL3 시설의 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 처리해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
  2. 멸균 조건에서 유리 구슬을 사용하여 병 셰이커에서 15rpm에서 1분 동안 세포를 분산시킵니다.
  3. 박테리아 현탁액을 McCartney 병에 담긴 10mL의 7H9 국물 배지로 옮기고 30rpm의 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 2주 동안 배양합....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고속 초원심분리에 의한 세포벽 및 세포막 단백질 분리
세포벽 및 막 단백질은 프로토콜에 설명된 대로 초원심분리를 통해 전체 세포 용해물에서 분리되었습니다. M. tuberculosis 의 분리된 세포내 분획-세포벽, 세포막 및 세포질 단백질 프로파일의 SDS-PAGE 분석이 그림 1에 나와 있습니다.

분취 액상 등전 포커싱에 의한 세포벽 단백질의 분리
Mycobacterium tuberculosis 세포벽 단백질은 프로토콜에 설명된 대로 IEF 완충액을 사용하여 가용화되었습니다. 가용화된 단백질은 등전점을 기준으로 20개의 분획으로 분리되었습니다. 그림 2 는 IEF로 분리된 세포벽 분획의 pH 프로파일을 보여줍니다. 단백질 프로파일을 보여주는 이러한 분획의 SDS-PA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포벽과 막 단백질의 소수성 특성은 가용화 및 분리에 있어 중요한 실험적 과제를 제시합니다. 위에서 언급한 프로토콜에서 우리는 이러한 소수성 단백질을 효과적으로 분리하기 위한 새로운 2차원 전기영동 기반 분리 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜에서 우리는 처음에 액체 IEF 시스템을 사용하여 등전점을 기반으로 막과 세포벽 단백질을 분리했습니다. 가용화 문제를 해결하기 위해 고농도의 카오트로픽제(요소)와 세제(디지토닌)를 사용했는데, 이는 이러한 단백질의 가용화를 촉진하고 초기 분리 중에 가용화 문제 없이 더 높은 단백질 농도를 로딩할 수 있도록 했습니다. 또 다른 장점은 이러한 가용화제가 분획에 사용되는 IEF 완충액에 필수적이어서 단백질 샘플의 추가 희석을 방지한다는 것입니다.

IEF로 분리된 분획은 SDS-PAGE 절차를 사용하여 분자량으로 다시 분해되었습니다. SDS-PAGE로 분리된 단백질은 Tris-CAPS 완충.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 KR Uma Devi 박사의 DST SERB 보조금으로 전폭적으로 지원됩니다. B. Ramalingam 박사는 DBT-Ramalingaswamy 펠로우십의 지원을 받았습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7H9 국물 히미디어 M198
40% 바이오 해정 3/10 Ampholyte 바이오 RAD1631113
BCA 단백질 분석 머 크BCA1
바이오 라이트 5/7 Ampholyte 바이오 RAD1631152
원심 농축기 3 kDa머 크Z629456
디지토닌.머 크D141
드나제머 크11284932001
DTT머 크D9779
EDTA머 크E9884
에그타머 크E3889
글리세롤머 크지5516
류펩틴머 크18회
펩스타틴 A머 크P5318
PMSF머 크78830
르나제머 크10109134001
로토포 바이오 RAD170-2986  등전초점(IEF) 장치
초음파 처리기비브라 셀, 소닉스VC 750 시리즈
TLCK머 크T7254
TPCK머 크4376
요소머 크U5378
전체 젤 용출 장치 바이오 RAD1651250

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterium TuberculosisCell Wall ProteinsCell Membrane ProteinsProtein FractionationIsoelectric FocusingSDS PAGEHydrophobic Protein SeparationSubcellular FractionationProtein BiomarkersGel Elution

Related Articles