방법 논문

현장 분리 칩을 이용한 난치성 토양 박테리아의 분리 및 배양 (iChip)

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DOI:

10.3791/67692

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2025년 8월 6일

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 자연 환경에서 난치성 토양 미생물의 현장 배양을 위한 격리 칩(iChip)의 설계 및 사용을 설명합니다. 또한 항균제를 생산하는 토양 박테리아의 현장 재배에 대해서도 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 바람직한 특성을 가진 다양한 틈새에서 박테리아를 회수하도록 조정될 수 있습니다.

초록

생태계에는 수백만 개의 환경 미생물이 서식하고 있으며, 그 중 일부는 효소, 비타민, 아미노산, 유기산, 구충제, 항균제와 같은 생명공학적으로 관련된 제품을 생산할 수 있습니다. 이러한 환경 박테리아의 대부분은 실험실 배양 방법이 영양/환경 요구 사항을 충족하지 못하기 때문에 "배양 불가능"으로 간주됩니다. 더욱이, 그들은 자연에서 공존하기 때문에 미생물 군집의 다른 구성원이 생산하는 영양분/대사 산물에 의존할 수도 있습니다. "배양되지 않은" 미생물 다양성을 배양에 도입하면 그들이 암호화할 수 있는 다양한 생리 활성 제품을 탐색할 수 있는 기회가 될 것입니다. 이 기사에서는 "배양할 수 없는" 박테리아의 고처리 량 현장 배 양을 위해 개발된 다중 채널 확산 챔버인 iChip 기술의 구현에 대해 설명합니다. 항균제 내성의 전 세계적인 위협을 감안할 때, 이 기사는 예를 들어 항균제를 생산할 수 있는 미생물 '암흑 물질'로부터 분리주의 현장 배양 및 회수를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 토양 샘플 수집 단계부터 분리물 회수까지 관련된 단계를 설명하고 분리의 성공에 영향을 미칠 수 있는 그럴듯한 요인을 강조합니다. 이 기술을 사용하면 항생제 발견을 위해 "배양할 수 없는" 박테리아를 분리할 수 있을 뿐만 아니라 연구자들이 복잡한 토양 생태계를 탐구할 수 있으며, 이를 수많은 다른 응용 분야에 활용할 수 있습니다.

서론

이전에 탐구되지 않은 미생물의 풍부한 저장소는 토양, 수역 및 극한 환경과 같은 자연 환경에 존재합니다. 그러나 대부분의 미생물은 전통적인 실험실 배지와 방법을 사용하여 쉽게 배양할 수 없기 때문에 미생물의 엄청난 생물 다양성을 활용하는 것은 어렵습니다. 큰 플레이트 수 이상은 이 현상을 설명하며, 육안으로 관찰할 수 있는 미생물과 배양 배지에서 자라는 것으로 관찰되는 미생물의 불일치 수를 강조합니다1. 이러한 장벽을 우회하고 배양할 수 없는 다양한 미생물과 그 제품에 접근할 수 있게 하면 다양한 생명공학적 요구를 해결할 수 있습니다.

예를 들어, 항균제 내성의 발생은 전 세계 공중 보건에 위협이 되었습니다. 주요 제약 회사는 새로운 항균제 발견을 추구하는 것을 꺼려 기존 항생제에 대한 내성 출현 속도에 비해 발견 속도가 감소했습니다 2,3. 따라서 새로운 항균제의 발견이 절실히 필요합니다4. 미생물 군집은 동시에 또는 경쟁적으로 함께 진화했기 때문에5, 생존 가능성을 높이는 새로운 화합물을 생산할 수 있는 잠재력을 개발했습니다. 환경 미생물과 그 제품의 엄청난 다양성은 전통적인 실험실 배양 기반 방법이 종종 유사하고 알려진 미생물의 분리로 이어지기 때문에 완전히 탐구되지 않았습니다. 이는 기존의 배양 배지와 방법이 인간과 관련된 미생물의 배양에 편향되어 있고 자연 환경을 모방하지 못하기 때문입니다. 일부 종의 성장에는 종종 근처의 다른 미생물에 의해 생성되는 다양한 영양소와 특정 환경 조건이 필요할 수 있기 때문에 환경 미생물을 배양하기 위한 배양 배지를 설계하는 것은 어렵습니다.

이 문제를 해결하고 현장 에서 환경 미생물을 배양하기 위해 확산 챔버가 처음 개발되었습니다6. 확산 챔버는 스테인리스 스틸 O- 링입니다. 링 내의 공간은 적절한 샘플 희석액으로 파종된 한천으로 채워집니다. 그런 다음 링의 상단과 하단을 폴리카보네이트 멤브레인으로 밀봉하여 토양 유래 영양분과 대사 산물의 확산을 허용하는 동시에 다른 미생물이 챔버6으로 침투하는 것을 방지합니다. 파종 후, 플레이트는 샘플이 수집되는 환경에 배치되어 제자리에서 배양할 수 있습니다. 확산 챔버는 매우 효율적이었고 이전에는 배양할 수 없었던 수많은 미생물을 배양했습니다. 그러나 한천을 사용한 O-링 설계는 힘들고 처리량이 낮아져 추가 혁신을 위한 문제 공간을 열어두었습니다6. 얼마 지나지 않아 순수 배양의 현장 배양 과 동시에 고처리량 회수가 가능한 분리 칩(iChip)이 설계되었습니다7. 이 디자인은 개념적으로 확산 챔버와 동일하지만 각 채널이 독립적인 확산 챔버 역할을 하는 여러 채널로 구성되어 각 챔버(8) 에서 단일 마이크로 콜로니를 잠재적으로 복구 할 수 있습니다. 확산 챔버 설계의 재구상은 기술의 처리량을 크게 향상시켰고 토양, 해수9, 온천10 등에서 더 큰 분류군의 생물 다양성을 분리하고 재배할 수 있게 했습니다. 최근에 기술된 항생제인 Teixobactin은 위에서 설명한 기술에 따라 발견되었습니다11. 이는 항균 작용의 새로운 메커니즘을 나타냈고 침습성 감염을 유발하는 병원체에 대해 치명적인 것으로 밝혀졌으며, 이 기술을 사용하여 생명공학적으로 관련된 천연 제품의 발견을 위해 미생물 "암흑 물질"로부터 미생물의 고처리량 분리를 효율적으로 간소화할 수 있음을 입증했습니다12.

이 기사는 토양 미생물 "암흑 물질"에서 항균제 생성 난치성 박테리아의 현장 배양 및 회수를 위한 이 고처리량 기술의 효과적인 구현을 위한 절차 가이드 역할을 합니다. 이 프로토콜은 분리 칩의 설계, 샘플 수집, 샘플 준비, 시종, 배양 및 회수를 간략하게 설명합니다. 제시된 프로토콜은 토양에서 미생물의 현장 배양을 보여주지만, 모든 환경에서 미생물의 현장 배양에 쉽게 적용될 수 있습니다. 이 기술의 높은 처리량 기능은 새로운 미생물을 발견하고 다양한 생명공학 응용 분야에 생합성 잠재력을 활용할 가능성을 높일 수 있습니다.

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프로토콜

1. 디자인 및 3D 프린팅

  1. 시료 유형, 확산 챔버당 부피, 사용할 멤브레인의 치수 및 필요한 처리량(확산 챔버 수)에 따라 설계 및 크기를 선택합니다.
    참고: 중간 플레이트의 두께와 각 채널의 직경에 따라 각 원통형 확산 챔버의 부피가 결정됩니다. 크기는 수용할 개별 확산 챔버의 수에 따라 달라지며 멤브레인의 치수는 덮인 확산 챔버의 수에 직접적으로 의존합니다(그림 1).
  2. 프리젠테이션 소프트웨어 프로그램에서 모양 삽입 옵션을 사용하여 iChip 역할을 하는 데 필요한 치수의 원을 삽입합니다. 채널을 나타내기 위해 내부에 작은 원을 삽입합니다. 작은 원을 원하는 패턴으로 배열하여 상단/하단 및 중간 플레이트에 대한 예비 디자인을 준비합니다. 디자인을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼 클릭 메뉴를 사용하여 예비 디자인을 그림으로 저장합니다.
  3. 예비 설계를 템플릿으로 사용하여 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 2차원(2D) 설계 생성을 시작합니다.
    1. 스케치 메뉴에서 미리 정의된 모양(주로 원)을 삽입하여 플레이트 및 채널 배열에 대한 기본 설계를 작성합니다.
    2. 치수 옵션을 사용하여 플레이트 및 채널의 실제 치수를 설정합니다. 확인 을 클릭하여 디자인을 마무리한 다음 돌출 기능을 사용하여 2D 디자인을 원하는 두께의 3D 모델로 변환합니다.
    3. 마지막으로 파일 메뉴 저장 을 사용하여 3D 프린팅과 호환되는 STL(광조형) 파일 형식으로 3D 모델의 복사본을 저장합니다.
  4. 선호하는 살균 방법, 심기 장소 등의 요소를 고려하여 원하는 용도에 따라 인쇄할 재료를 선택하세요. 예를 들어, 멸균을 위해 고압멸균을 사용하거나 온도가 높은 장소에 심을 경우 내열성 재료를 선택하십시오.
    참고: 이 실험을 위한 3D 프린팅은 최대 268°C의 고온을 견딜 수 있는 세라믹과 유사한 재료를 사용하여 수행되었으므로 오토클레이브가 가능했습니다.
  5. 치수(디테일 및 해상도)와 사용된 재료에 따라 적절한 3D 프린팅 방법을 선택하십시오.
    참고: 적층 제조 방법인 광조형을 사용한 3D 프린팅은 자외선(UV) 레이저로 열경화성 수지를 경화시켜 복잡한 구조를 만들 수 있습니다. 광조형 (stereolithography) 은 여러 재료와 함께 사용할 수 있으며 뛰어난 표면 마감 및 높은 디테일 해상도를 허용합니다.

2. 토양 샘플 수집

  1. 모든 모바일 애플리케이션 스토어에서 사이트에 대한 고유한 3단어 주소를 제공하여 전 세계 3m x 3m 사이트를 식별할 수 있는 지오코딩 모바일 애플리케이션을 다운로드하여 설치합니다. 토양 샘플 수집 장소를 식별합니다. 그런 다음 지오코딩 모바일 애플리케이션을 열어 관심 사이트와 고유한 세 단어 주소를 식별합니다.
  2. 고유한 세 단어 주소, 날짜, 시간, 샘플을 수집할 깊이, 기상 조건, 근처의 동식물, 현장 노출 및 현장 온도(원하는 깊이의 표면 및 지하)를 기록합니다.
    알림: 토양에는 병원성 박테리아가 포함될 수 있습니다. 따라서 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 가운 등)를 사용하고 생물안전 레벨 2에 적합한 프로토콜을 따르십시오. 시료 오염 및 노출을 방지하기 위해 접촉을 최소화합니다. 토양 샘플을 취급하기 전과 후에 작업 표면을 소독하십시오.
  3. 삽에 70% 에탄올을 뿌리고 깨끗하게 닦아 오염을 제거합니다. 흙을 모을 폴리스티렌 상자에 70% 에탄올을 뿌리고 깨끗하게 닦아 오염을 제거합니다. 계속 진행하기 전에 잔류 에탄올이 완전히 건조되도록 하십시오.
    참고: 이 프로토콜은 폴리스티렌 상자를 사용하여 샘플을 수집하고 배양을 수행하지만 원하는 경우 유리 및 금속 용기와 같은 대안을 사용할 수도 있습니다.
  4. 표면에서 식물 재료, 깔짖기 및/또는 돌을 제거하여 표토를 노출시킵니다. 이전과 같이 삽을 다시 오염을 제거하고 표토를 청소하고 지하 3-6인치 깊이의 토양을 평가합니다. 눈금자를 사용하여 표면의 깊이를 측정합니다. 표면 멸균 삽을 사용하여 원하는 깊이에서 4-5kg의 흙을 폴리스티렌 상자에 모으십시오.
  5. 뚜껑으로 상자를 밀봉하십시오. 둘 이상의 샘플을 수집해야 하는 경우 교차 오염을 방지하기 위해 두 샘플링 사이트 사이의 삽의 오염을 제거하십시오. 모든 샘플이 수집되면 샘플을 즉시 실험실로 다시 운반합니다.

3. 파종을 위한 샘플 준비

  1. 수집된 토양 샘플에서 파편, 암석 및 낙엽이 없는 토양 1g의 무게를 10mL의 멸균 식염수가 들어 있는 멸균 50mL 원심분리기 튜브에 담습니다.
    참고: 토양 샘플의 일부를 -80°C에서 글리세롤스톡 13,14로 보존하여 향후 요구 사항을 위해 천연 미생물 개체군을 보존합니다.
  2. 토양과 식염수를 약 10초 동안 소용돌이치게 하여 혼합하여 토양 슬러리를 만듭니다. 튜브의 큰 토양 입자가 가라앉을 수 있도록 원심분리기 튜브를 5분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 상청액 토양 현탁액을 "S"라고 표시된 새 시험관에 조심스럽게 옮깁니다.
  3. 토양 현탁액을 희석되지 않은 샘플로 사용하여 샘플 1mL를 새 튜브의 멸균 식염수 9mL로 옮겨 연속 희석을 수행합니다. 10-1 에서 10-5까지 희석액을 준비합니다.
    참고: 비선택적 배지에서 희석된 토양 현탁액의 플레이트 수는 샘플의 박테리아 밀도에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 이는 파종에 적합한 희석액을 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이것은 샘플에 존재하는 배양 가능한 박테리아의 추정치일 뿐입니다.

4. 파종 및 조립

  1. 생물 안전 캐비닛 내부에서 70% 에탄올에 10분 동안 담가 상판, 하판 및 중판의 표면 오염을 제거합니다. 멸균 탈이온수로 플레이트를 세척하여 과도한 에탄올을 헹구고 멸균 페트리 접시에서 자연 건조시킵니다.
  2. 파종할 준비를 위해 멸균 페트리 접시에 중간 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 SMS 한천 배지를 전자레인지에서 녹이고 식힌 다음 45°C에서 22.5mL의 SMS 한천을 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  3. 여기에 토양 샘플의 적절한 희석액 2.5mL를 첨가하고 기포의 유입을 피하면서 부드러운 반전으로 잘 혼합합니다.
    참고: 파종에 적합한 희석액을 선택하십시오. 10-4 희석에서와 같은 최종 파종 밀도를 달성하려면 시료가 파종에 사용되는 배지에서 10배 더 희석되므로 10-3 현탁액을 선택하십시오.
    1. 챔버당 1개의 세포를 고정화하기 위해 파종 희석액을 선택한 다음 제자리에서 콜로니로 발달할 수 있습니다.
      알림: 증류수는 토양 환경을 모방하고 이러한 조건에서만 자라는 미생물의 성장을 허용하기 위해 SMS 배지 대신 사용할 수도 있습니다. 선택적으로, 진균 성장을 방지하기 위해 시클로헥시미드와 같은 항진균제를 파종 배지에 첨가할 수도 있다.
  4. 파종된 SMS 한천 배지 3-4mL를 중간 플레이트 위에 천천히 부어 전체 표면을 덮습니다. 그런 다음 SMS 한천 배지를 약 5-10분 동안 굳힙니다. SMS 한천 배지가 설정되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균 면도날을 사용하여 플레이트 표면에서 과도한 SMS 한천을 긁어내어 개별 확산 챔버에 한천 플러그를 남깁니다.
  5. 0.03μm 폴리카보네이트 멤브레인 필터 중 하나에서 보호 시트를 제거한 후 멸균 겸자를 사용하여 상판 안쪽에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 시드된 중간 플레이트의 노출된 면에 또 다른 0.03μm 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 놓습니다.
  6. 상단 플레이트와 하단 플레이트를 배치하고 중간 플레이트와 폴리카보네이트 멤브레인을 끼우고 모든 플레이트의 나사 구멍을 정렬하여 조립을 완료합니다(그림 1B). 너트와 볼트를 조여 어셈블리를 고정합니다.
    알림: 파종 없이 멸균 SMS 한천만으로 대조군 iChip을 병렬로 조립하고 파종된 것과 함께 토양에 심어 밀봉을 확인하는 것이 좋습니다. 이것은 환경에서 미생물의 유입 가능성을 배제하고 음성 대조군 역할을 할 것입니다.

5. 현장 재배 및 회복

  1. 멸균 삽을 사용하여 폴리스티렌 상자에 수집된 토양에 iChip 크기보다 큰 함몰부를 만듭니다. 함몰 내에 어셈블리를 수직으로 심고 흙으로 단단히 포장하여 모든 표면이 완전히 덮이도록 합니다. 그런 다음 2-4주 동안 원하는 기간 동안 제 자리 배 양을 허용합니다. 배양하는 동안 멸균 증류수를 사용하여 주기적으로 토양을 적셔 확산 챔버에 파종된 SMS 한천 플러그가 마르는 것을 방지합니다.
    알림: 어셈블리를 수직 위치에 놓으면 수평으로 심을 경우 발생할 수 있는 것처럼 정기적으로 토양을 적시는 동안 확산 챔버를 통해 물이 지속적으로 스며드는 것을 방지할 수 있습니다.
  2. 원하는 배양 후 심은 iChip 주변의 토양을 부드럽게 제거하여 복구합니다. 그런 다음 멸균 식염수로 세척하여 부착된 토양 입자를 제거하고 추가 처리를 위해 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
  3. 어셈블리에서 너트와 볼트를 풉니다. 그런 다음 조심스럽게 분해하십시오. 멸균 겸자를 사용하여 폴리카보네이트 멤브레인을 제거하고 중간 플레이트를 준비된 페트리 접시로 옮깁니다.
  4. 멸균 목재 어플리케이터를 사용하여 각 확산 챔버 내에서 개별 한천 플러그를 회수합니다. 한천 플러그를 SMS 한천 또는 0.1x 트립스성 콩 국물 한천과 같은 적절한 배지에 접종하여 실험실 재배를 시도합니다.
    참고: 배양된 분리주는 한천 오버레이와 같은 일상적인 방법으로 항균제 생산에 대해 스크리닝할 수 있습니다15.
  5. 또는 현장 에서 배양 된 난치성 토양 박테리아를 포함하는 회수된 한천 플러그를 염색하고 이미지화하여 현장 조건에서 마이크로콜로니의 성장을 확인합니다.
    참고: 검출 감도를 높이기 위해 분쇄된 한천 플러그는 박테리아를 염색할 수 있는 형광 염료를 사용한 다음 형광 현미경을 사용하여 염색할 수도 있습니다.

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결과

이 프로토콜에 사용된 iChip은 그림 1과 같이 설계, 3D 프린팅 및 조립되었습니다. 설명된 프로토콜의 개요는 그림 2에 나와 있습니다. 실험에 사용된 토양 샘플은 인도 라자스탄에 있는 IIT 조드푸르 캠퍼스에서 수집되었습니다. 그 장소의 독특한 세 단어 주소는 'communicate.supervising.recurrence'였습니다. 선택한 장소는 샘플링 당일 기온이 40°C인 반건조 지역이었습니다. 토양 샘플은 한여름에 수집되었습니다. 샘플은 표면 아래 온도가 35°C인 6-7인치 깊이에서 멸균 폴리스티렌 상자에 무균 상태로 수집되었으며 수집 후 24시간 이내에 처리하기 위해 실험실로 가져갔습니다. 그런 다음 적절한 희석액을 추정하기 위해 순차적으로 희석하고 트립틱 대두 한천에 도금했습니다. 토양의 배양 가능한 미생물 밀도는 토양 g당 8 × 106 CFU였습니다. 토양 현탁액의 10-3...

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토론

지구상의 수많은 독특한 서식지에는 엄청난 다양성을 나타내는 독특한 미생물 군집이 있습니다. 이는 재배에 필요한 적절한 성장 조건 제공의 한계로 인해 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 일부 박테리아는 생존을 위해 다른 박테리아가 방출하는 대사산물에 의존하므로 실험실 조건에서 독립적으로 생존할 수 없습니다. 또한 박테리아는 실험실 환경에서 모방할 수 없는 생지구화학적 순환을 조율하는 데에도 중요한 역할을 합니다. 미생물 생물 다양성의 대부분과 이들이 암호화하는 새로운 화학 구조는 미생물 "암흑 물질"의 배양할 수 없는 부분에서 손실됩니다.

현장 재배의 개념은 이 중요한 문제를 해결합니다. 박테리아는 영양분과 대사 산물의 유입을 허용하지만 오염을 방지하는 확산 챔버를 사용하여 자연 서식지에서 배양됩니다. 이 프로토콜은 iChip 기술의 구현, 배양을 위한 확산 챔버의 고처리량 발전 및 모든 환경(이 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 공개합니다.

감사의 글

AV는 인도 정부의 PMRF(Prime Minister's Research Fellowship) 프로그램의 지원을 받았습니다. V.V.는 인도 정부 과학기술부의 INSPIRE(Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship) 프로그램의 지원을 받았습니다. IB의 방문은 USIEF의 풀브라이트 APE 펠로우십으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 저자는 이 작업을 위한 물류 지원과 인프라 제공에 대해 생명과학 및 생명공학과와 조드푸르 인도 공과대학에 감사를 표합니다. Sudarshna Negi 박사, Aastha Kapoor 씨, Tamal Dey 씨, Bharat Pareek 씨, Ajeet Singh 씨 및 IIT Jodhpur 미생물 생리학 연구소의 다른 구성원들의 기술 지원에 감사드립니다.

ADSB-2024 참가자 코호트

조드푸르 인도 공과대학 생명과학 및 생명공학과에서 조직된 2024년 토양 박테리아에서 항생제 발견(ADSB) 단기 과정의 참가자 집단(이름은 알파벳순으로 나열됨):

아비나쉬 쿠마르 예나, 바니쉬리 잘리, 바라트 구르나니, 바라트 파리크, 디프로 무케르지, 가리마 칸와르 셰카왓, GT 비슈누, 자이타 사카르, 크리슈나 사하란, 크리티 싱갈, 레크 라지, 미타 빈두스리, 풀렌 사르마, 프리얀카 쿠마리, 라차나 디네시, 사티엔드라 싱, 스와티 수지스

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 프린터Protolabs, 미국1631-8333D 프린팅 서비스 제공업체
Agarose Himedia, 인도MB002배지 성분
Casamino AcidsSisco, India68806배지 성분
카제인 다이제스트 ASES, 인도C5890미디어 구성 요소
폴리카보네이트 멤브레인Sterlitech, USAPCT00347100소모품
감자 전분Himedia, 인도GM403미디어 구성 요소
PowerPoint Microsoft, 미국N/AiChip 구성 요소 생성에 사용 예비 설계
PTC CreoPTC, USAN/A3D 컴퓨터 지원에 사용 iChip 구성 요소 모델링
Tryptic Soy BrothHimedia, IndiaM011실험실 매체
What3WordsWhat3Words, UKN/A샘플링 위치의 좌표를 기록하는 데 사용

참고문헌

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  14. Enright, D. J., Quaal, R., Verabeehu, A., Nguyen, A., Maddox, J., Glassman, S. I. Evaluating Best Practices for Isolating Pyrophilous Bacteria and Fungi from Burned Soil. bioRxiv. , (2024).
  15. Nkanga, E. J., Hagedorn, C. Detection of antibiotic-producing Streptomyces inhabiting forest soils. Antimicrob Agents Chemother. 14, 51-59 (1978).

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