우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol
이 논문에서
요약
초록
외배엽 유도체와 중간엽 유도체를 모두 생성할 수 있는 놀라운 능력을 가진 두개골 신경능상세포(CNCC)는 세포의 운명 결정과 가소성을 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 많은 관심을 불러일으켰습니다. 배측 신경 상피에서 유래한 이 세포 집단은 일시적이며 발달 중인 배아에서 상대적으로 드물기 때문에 기능 검사, 게놈 스크리닝 및 생화학 분석을 in vivo에서 수행하기 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 시험관 내에서 CNCC 개발을 모델링하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었습니다.NS(Neurosphere) 기반 배양 방법은 발달 중인 전방 신경 상피를 3D로 요약하는 복잡한 미세환경을 제공합니다. 이러한 시스템을 사용하면 동일한 플레이트에서 많은 NS가 성장하여 많은 양의 CNCC를 생성할 수 있지만, 생성된 NS는 형성된 CNCC의 모양, 크기 및 수에 있어 변동성이 높기 때문에 정량 분석을 수행하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 96웰 형식의 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 NS를 생성하기 위한 재현 가능한 방법을 간략하게 설명합니다. 96웰 플레이트에서 생성된 NS는 두개신경능선세포(CNCC)를 생성하며, 이를 추가로 배양할 수 있습니다. 이 접근법은 시작 세포의 수를 제어함으로써 NS 사이의 크기와 모양의 변동성을 줄이고 실험 전반에 걸쳐 재현성을 높입니다. 마지막으로, 이 배양 시스템은 여러 응용 분야에 적용할 수 있으며 더 높은 수준의 유연성을 제공하여 사용자 정의가 가능하고 다중화 실험 조건에 적합합니다.
서론
두개신경능선세포(Cranial neural crest cells, CNCC)는 발달 중인 배아의 가장 앞쪽, 신경판(neural plate)과 표면 외배엽(surface ectoderm1) 사이의 경계에서 발생하는 줄기 모양의 세포 집단입니다. 그런 다음 CNCC는 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪고, 신경 상피에서 박리되고, 배아의 다양한 위치로 배측으로 이동하여 다양한 세포 유형으로 분화합니다2. 이 세포 집단을 연구하는 것은 놀라운 가소성(plasticity)3과 두개안면뼈(craniofacial bones) 및 연골(cartilages)4과 같은 외배엽(ectodermal) 및 중간엽(mesenchymal) 유도체로 분화할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있기 때문에 매우 흥미롭습니다. CNCC는 배아에서 비교적 접근하기 쉽지만, 세포 수가 적은 일시적인 집단이기 때문에 in vivo에서 체계적인 기계론적 연구를 수행하기 어렵습니다. CNCC 세포주는 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 몇 년 동안 분리되고 특성화되었습니다. 특히, O9....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 마우스 ESC 군집으로부터 단일 세포 현탁액의 생성
참고: 이 프로토콜은 젤라틴 코팅된 TC 처리된 6웰 플레이트의 비활성화된 공급체에서 성장한 CK35 mESC(생식주 전달에 적합한 mESC 라인, 생체 내 모델15를 개발할 수 있는 옵션을 갖음)의 사용에 맞게 조정됩니다. TC 처리된 6웰 플레이트의 1웰은 약 1.5 × 10 6mESC를 산출해야 하며, 이는 나머지 프로토콜에 충분합니다. 필요한 경우 확장할 수 있습니다. 선택한 ESC 균주 및 유지 배양 방법과 적절한 배양 배지에 따라 초기 단계를 조정합니다. 이 프로토콜은 멸균 상태에서 수행되어야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- mESC 배양 배지에서 성장한 70%-80% 합류점에서 mESC에서 시작합니다. 본 연구에서 사용된 mESC 배양 배지 조성은 표 1 을 참조하십시오.
참고: mESC가 80% 이상 합류하지 않도록 하면 분화가 시작되고 집계 프로....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
프로토콜에 따라 mESC 콜로니를 해리하고 3000개의 세포를 비TC 처리된 U-bottom 96웰 플레이트에 파종했습니다. 2일차에 응집된 NS를 비TC 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮겨 부착할 수 있도록 했습니다. NS 어그리게이션 프로토콜의 단순화된 시각화는 그림 1A에 나와 있습니다. NS는 9일까지 배양한 후 면역형광 염색을 위해 처리했습니다. NS에서 플레이트로 이동한 세포는 이미징을 위해 커버슬립으로 옮겨지고 CNCC 유지 배지에서 13일까지 배양되었습니다. 이와 동시에, 페트리 접시에서 NS를 생성하기 위한 프로토콜이 참조 및 비교 지점으로 수행되었습니다. 실험의 전반적인 목표는 페트리 접시에서 수행된 프로토콜에서 관찰된 NS-NS 변동성을 줄이는 것이었습니다.
non-TC 처리된 96-well plate에서 개별적으로 배양했을 때, NS는 표현형 변동성이 감소된 것으로 나타났다. 모든 NS는 5일째에 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
체외 3D 분화 모델을 사용하면 2D 세포 배양에서 관찰하기 어렵거나 관찰할 수 없는 복잡한 세포 상호 작용을 분석할 수 있습니다. 시험관 내에서 CNCC 발달을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 이들은 일반적으로 배아줄기세포 콜로니(ESC colonies) 7,21 또는 조직 외식(tissue explant) 22,23에서 직접 유래한다. 이러한 시스템은 신경능선세포를 생성하는 데 효율적인 것으로 입증되었지만, 이러한 방법은 배양 방법 및 미세환경에 대한 상당한 민감성을 보여주며, 이는 NS24 내부의 세포 구성 및 세포 특성 모두에 차이를 초래합니다. 또한 이러한 방법은 ES.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
프라이머 설계에 대한 조언과 세포 배양에 대한 전문 지식을 제공해 주신 Remi Xavier Coux 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 유럽연구위원회(ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST)와 Fondation pour la Recherche Médicale(Amorçage - AJE202205015403)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 주사기 필터 | ClearLine | 146560 | |
| 15 mL 고선명도 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Falcon | 352096 | |
| 200 µ L ClearLine Plus 낮은 바인딩 필터 팁 | Dutscher | 713263 | |
| 40 µ m filters | Falcon | 352340 | |
| 5 mL 혈청학 피펫 | Starstedt | 86.1253.001 | |
| 50 mL 고선명도 폴리프로필렌 원추형 튜브 | Falcon | 352070 | |
| Accutase | Merck-Sigma | A6964 | |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A21206 | |
| Alexa Fluor 594 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A21203 | |
| Alexa Fluor 647 당나귀 안티 염소 IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A31571 | |
| 항생제-항진균 용액 | Merck-Sigma | A5955 | |
| B27 PLUS 보충제 | Thermofisher Scientific | 17504044 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Merck-Sigma | A9418 | |
| 클로로포름 | Carlo Erba | 438601 | |
| 콜라겐분해효소 IV형 | Thermofisher Scientific, Gibco | 17104019 | |
| Costar 6 웰 클리어 TC 처리된 다중 웰 플레이트 | 코닝 | 3516 | |
| 커버 안경, 라운드 | VWR | 630-2113년 | |
| DMEM KnockOut | Thermofisher Scientific | 10829018 | |
| DMEM/F12+Glutamax | Thermofisher Scientific | 10565018 | |
| DMEM 고포도 | Merck-Sigma | D0822 | |
| DNA LoBind 튜브, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNase/RNase-free 증류수 | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(PBS) | Thermofisher Scientific | 14190144 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30121023 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| ESGRO mLIF Medium Supplement | Merck-Sigma | ESG1107 | |
| Ethanol 70% | Carlo Erba | 528170 | |
| Fetal 소 혈청 | Merck-Sigma | F7524 | |
| Fibronectin | Merck-Sigma | F085-2MG | |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| 젤라틴 용액 | Merck-Sigma | ES-006-B | |
| GlutaMAX | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15-500UG | |
| 인간 FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| 인간 SOX9 항체 | R& Dsystems | AF3075 | |
| 소 췌장에서 추출한 인슐린 | Merck-Sigma | I6634 | |
| iScript cDNA 합성 키트 | Biorad | 1708891 | |
| Mouse Anti-Human AP-2 alpha 단클론 항체, Unconjugated | DSHB | 3B5 | |
| Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal 항체, Unconjugated | DSHB | PAX7 | |
| N2 supplement | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| Neurobasal Medium | Thermofisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Tissue Culture treated plate, 96 well, Flat | bottom Falcon | 351172 | |
| Non-Tissue Culture treated plate, 96 well, U-bottom | Falcon | 351177 | |
| Paraformaldehyde 16% solution, em grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba | 415154 | |
| 정제된 항-튜불린 &베타; 3 (TUJ1) 항체 | Biolegend | MMS-435P | |
| RapiClear 1.47 | Sunjin Lab | RC147001 | |
| RapiClear 1.52 | Sunjin Lab | RC152001 | |
| Scotch 양면 12.7 mm × 22.8 m | Clear fiberless 양면 테이프 | ||
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Meridian Bioscience | BIO-98020 | |
| 멸균 일회용 수술용 메스 | Swann-Morton | 05XX | |
| Superfrost Plus 접착 현미경 슬라이드 | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | A16046. AP | |
| TRIzol 시약 | FisherScientific | 15596026 | |
| 트립신-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | 10113103 | |
| TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)세포 | 신호 전달 기술 | E7E2G | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher Scientific |
참고문헌
- Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
- Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos R....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
