헬리코박터 파일로리균 및 항생제 내성 검출을 위한 위 점막 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석

요약

헬리코박터 파일로리균 검출 및 약물 내성 검사를 위한 빠르고 정확한 방법은 임상 실습에서 헬리코박터 파일로리균을 효율적으로 박멸하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 H. pylori 및 항생제 내성의 신속한 검출을 위해 위 점막 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 관련된 특정 방법론을 제시하는 것을 목표로 합니다.

초록

헬리코박터 파일로리는 전 세계 인구의 거의 절반을 감염시키는 주요 병원체이며 항생제 내성이 증가하여 공중 보건을 위협하고 있습니다. 또한 헬리코박터 파일로리는 만성 위염, 위 및 십이지장 궤양, 위암, 위 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종의 원인이 됩니다. 따라서 H. pylori에 대한 시기적절하고 정확한 진단과 항생제 내성 측정을 수행하는 것이 필수적입니다. 현재 H. pylori 진단의 기존 방법은 주로 신속 우레아제 검사(RUT), 요소 호흡 검사(UBT), 혈청 항체 검사, 항원 검사, 위내시경 검사, 세균 배양 등이 있습니다. 그러나 약물 내성 검출은 말할 것도 없고 처음 5가지 검출 방법을 통해 박테리아를 배양할 수 없었습니다. 박테리아 배양은 시간이 많이 걸리며 항생제 감수성 검사는 신속하고 일상적으로 수행할 수 없습니다. 임상 환경에서 H. pylori의 신속하고 정확한 식별과 항생제에 대한 감수성은 효과적인 제거에 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 목적은 위 점막 샘플에 대한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 활용하여 H. pylori의 진단을 신속하게 진행하고 항균제에 대한 내성을 평가하는 표적 접근 방식을 설명하는 것입니다. qPCR은 클라리스로마이신 및 퀴놀론에 대한 내성과 각각 관련된 23S rRNA 및 gyrA 유전자에서 H. pylori 감염에 대한 ureA 유전자 및 돌연변이를 검출하기 위해 개발되었습니다. 현재 위 점막 qPCR은 표준 운영 절차가 없기 때문에 여전히 문제가 있습니다. 따라서 실험 절차의 정확한 전달을 보장하기 위해 실험 세부 사항과 방법론을 공유하는 것이 필수적이며, 이를 통해 투명성을 높일 수 있는 황금 표준 프로토콜에 기여할 수 있습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기술의 적용을 통해 H.pylori 감염 및 항생제에 대한 내성을 평가하는 기존 방법에 대한 경제적이고 신속한 대안을 제공합니다.

서론

H. pylori는 낮은 산소 수치가 있는 곳에서 생존할 수 있는 그람 음성 박테리아입니다. 이 유기체는 여러 개의 뚜렷한 유전적 집단에 속하며 높은 유전적 다양성을 보여줍니다. 유기체는 일반적으로 나선형 모양이지만 막대¹로 변경 될 수 있습니다. 전 세계 인구의 거의 50%를 감염시키는 주요 병원체입니다². 대부분의 감염은 환자가 어린 시절에 건강한 보인자로 남아 있을 때 발생하며, 나중에 성인이 되어서도 증상이 나타납니다. 이 질환은 만성 위염, 위 및 십이지장 궤양, 위암, 위 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종과 관련이 있는 것으로 보고되었다³. 헬리코박터 파일로리균 감염의 발현 차이는 별개의 박테리아 균주의 병원성 요소뿐만 아니라 숙주의 특성과 식이 패턴에 기인할 수 있다⁴. 연구에 따르면 흡연과 음주를 하는 남성은 헬리코박터 파일로리 감염에 걸릴 위험이 더 높다고 합니다⁵. 위암과 전암성 병변을 예방하기 위한 헬리코박터 파일로리균 제거의 효능은....

프로토콜

본 연구는 중국 광저우시 남방의과대학 광동성 인민병원 윤리위원회가 수립한 윤리적 고찰에 따라 진행되었다(승인번호: KY2024-1115-01). 18세에서 60세 사이의 환자가 이 연구에 등록되었습니다. 이 연구에서 참가자는 테스트 전 2주 이내에 최근에 항생제, 항균 약초 요법, 양성자 펌프 억제제(PPI) 또는 H₂ 수용체 길항제를 복용한 경우 제외되었습니다. 또한, 지난 3개월 이내에 항-H. 파일로리 요법을 받은 사람 또는 심각한 심장, 간 또는 신장 문제, 심각한 신경병증 또는 정신 질환이 있는 사람은 참여 대상이 아니었습니다. 위장관 천공, 고령, 불안정한 활력 징후 등과 같은 위내시경 검사에 대한 금기 사항이 있는 사람은 제외되었습니다. 이 연구는 또한 임산부나 모유 수유 중인 여성을 포함하지 않았다. 피험자의 사전 동의서에는 주로 다음과 같은 내용이 포함됩니다: (1) 연구 배경 및 목적; (2) 이 연구 프로젝트에 참여하기에 부적합한 사람은 누구입니까? (3) 연구 참여를 위한 요건은 무엇입니까? (4) 연구 참여의 가능한 이점 (5) 가능한 부작용, 위험 및 불편함; (6) 개인 정보 보호; (7) 주체의 권리; (8) 주체 선언; (9) 연구자 진술서 등

결과

qPCR을 통한 위 조직의 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 평가
H. pylori를 확인하기 위한 qPCR 분석은 ureA 유전자를 표적으로 하여 수행했으며, 항생제 내성은 23S rRNA 및 gyrA 유전자의 특정 돌연변이를 검사하여 확인했습니다(표 1). 세 그룹 모두에서 CT 값으로 표시되는 품질 보증 데이터는 허용 가능한 한계 내에 있었으며, 이는 테스트 당시 샘플이 표준 상태였음을 의미하며, 따라서 결과의 신뢰성을 보장합니다. 이 연구를 위해 실험 설계의 신뢰성을 확인하기 위해 다양한 결과를 가진 5개의 샘플(A, B, C, E, F로 표시)을 선택했습니다(그림 2). 헬리코박터 파일로리균에 대해 양성 반응을 보인 샘플 "A"는 헬리코박터 파일로.......

토론

RUT, UBT, 조직학, 배양 및 혈청학과 같은 전통적인 검사는 H. pylori 의 검출을 위해 활용됩니다. 각 진단적 접근법은 뚜렷한 이점을 제공하며 임상적 맥락에 따라 특정 문제에 직면해 있다¹⁷. 위 점막 생검에서 H. pylori 를 배양하는 것은 종종 진단의 기준으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 노동 집약적이며 기술적 문제, 배양에 필요한 조건 및 낮은 박테리아 농도의 가능성으로 인해 정확도가 제한됩니다. 반면, 조직병리학적 검사는 높은 수준의 민감도와 특이도를 자랑하며, 박테리아 농도와 염색 방법의 선택은 조직학적 평가에 직접적인 영향을 미칠 수 있다¹⁸. 헬리코박터 파일로리(H. pylori)에 대한 기존 검출 방법의 한계와 비교했을 때, 분자 진단 접근법은 배양 방법을 효율적으로 우회하고 검출 시간을 크게 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
목욕 인큐베이터	ALLSHENG	MK2000-2	항온 환경 제공
생물 안전 캐비닛	Haier	HR1500-B2
원심분리기	Thermo Fisher Scientific	THERMO ST16R	튜브 벽의 잔류 액체를 원심분리기합니다.
첼렉스-100	시그마	C7901	수지
위내시경 생검 겸자	Boston Scientific Corporation		위 점막 샘플링
헬리코박터 파일로리 23S rRNA 유전자 및 gyrA 유전자 돌연변이 검출 키트	Jiangsu Mole Bioscience	CFDA 20223400137 <	em>H. 파일로리 및 약물 내성 유전자(clarithromycin 및 quinolone)에 대한 qPCR 검출 키트핵
산 추출 시약	Jiangsu Mole Bioscience	SEDA 20150076	DNA 추출용
SDS 소프트웨어	Applied Biosystems	7300/7500	데이터 분석
Thermocylcer	Thermo Fisher Scientific	ABI 7500	H. pylori 및 약물 내성 유전자(clarithromycin 및 quinolones)의 qPCR 검출용Vortex
mixer	JOANLAB	VM-5005	혼합 시약용