Method Article

과도한 그루밍 표현형 평가를 위한 Drosophila melanogaster 그루밍 행동의 정량화

DOI:

10.3791/67708

⸱

March 21st, 2025

 , 
1Simmons University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 방법은 특정 그루밍 행동을 위해 Drosophila melanogaster 에서 얻은 영상의 수동 주석을 포함합니다. 이를 통해 그루밍 횟수와 그루밍에 소요된 전체 시간을 모두 정량화하여 비정형 자가 그루밍 표현형을 평가할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정형화된 그루밍에서 관찰할 수 있는 변화는 모델 유기체에 번역적으로 적용됩니다. 이러한 변화는 인간 행동에서 유사한 편차를 이끌어내는 병리학을 대표합니다. 예를 들어, 과도한 그루밍은 투렛 증후군이나 강박 장애와 같은 상태에 존재하는 강박적이고 강박적인 행동의 대리자로 작용한다. 제시된 그루밍 분석은 Drosophila melanogaster에서 비정상적인 자가 그루밍 표현형을 평가할 수 있도록 합니다. 파리는 10분 동안 기록되며, 이러한 기록은 이전에 정의된 그루밍 행동에 대해 블라인드로 관찰되고 주석이 추가됩니다. 그루밍 시합 빈도와 셀프 그루밍에 참여하는 데 소요된 시간에 대한 정량적 측정은 영상에 수동으로 주석을 달아 얻을 수 있습니다. 이 분석은 상대적으로 저렴하고, 실험실 환경에서 이미 사용할 수 없는 재료가 거의 필요하지 않으며, 그루밍을 관찰하는 것을 목표로 하는 주어진 연구의 특정 요구 사항에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 또한 컴퓨터 과학이 많은 자동화 방법에 비해 분석을 수행하는 데 필요한 기술 수준이 낮기 때문에 이 프로토콜은 소규모 실험실 및 학생에게 적합합니다. 이 분석을 수행하는 데 필요한 단계와 현재 제한 사항에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster 는 행동 및 신경 생물학 연구에서 잘 정립된 모델 유기체로, 유사한 인간 행동을 유도하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 유기체에서 자기 그루밍은 고도로 규제되고 잘 정의된 행동이며, 서로 쉽게 구별되는 고정관념적 패턴을 따른다1. 파리가 나타내는 별도의 그루밍 행동은 일반적으로 해부학적 영역2로 분류할 수 있으며, 가장 쉽게 후방 또는 전방으로 정의할 수 있습니다. 초파리 그루밍은 처음에는 앞쪽 부위에 초점을 맞추고 나중에는 뒤쪽 말단으로 전환됩니다3. 일반적인 조건에서 파리는 청결을 유지하기 위해(예: 먼지 제거) 그루밍 행동을 보이며, 병원성 미생물과 같은 잠재적으로 해로운 외부 자극에 대한 노출에 대한 반응으로 발생한다4.

그루밍 행동의 이상, 특히 자발적인 강박적 그루밍은 다양한 모델 시스템에서 강박 및/또는 강박 행동의 지표로 사용되어 왔습니다. 설치류, 조류, 개와 같은 유기체에서 강박적인 그루밍 행동을 관찰한 중개 연구 결과는 인간에게 유사한 강박 행동을 유발하는 조건에 대한 통찰력을 제공했습니다5. 여기에는 트리코틸로마니아(trichotillomania), 강박 장애(obsessive compulsive disorder), 투렛 증후군(Tourette Syndrome6)과 같은 질환이 포함된다. 과도한 그루밍 행동은 또한 Drosophila melanogaster의 유사한 신경 발달 상태 모델에서 행동 표현형을 평가하는 데 벤치마크로 사용되었습니다. 강박적인 그루밍 행동은 취약한 X 증후군(FSX) 및 관련 자폐 스펙트럼 장애(ASD)의 파리 모델에서 관찰되었습니다. 과도한 자발적 그루밍은 ASD 및 FSX 관련 유전자 FMR1에 대한 ortholog인 dfmr1의 돌연변이에서 발생합니다 7. 또한 이러한 돌연변이에서 후말단과 전방말단 사이의 그루밍 분포에 주목할 만한 변화가 있습니다8. 이러한 변화는 이러한 질환을 가진 일부 환자가 보이는 강박적이고 강박적인 신체 집중 행동을 반영하는 것으로 해석됩니다. 여기에 설명된 그루밍 분석을 사용하여 상업적으로 이용 가능한 GAL4 드라이버와 UAS-RNAi 라인9에 의해 생성된 초파리 유전자 Atg8a의 RNAi 매개 녹다운 후 파리의 그루밍 행동을 관찰했습니다.

이 방법에는 특정 그루밍 동작을 위해 파리를 촬영한 영상에 수동으로 주석을 추가하는 작업이 포함됩니다. 염료와 같은 간접 방법을 사용하는 것과 같은 그루밍 행동을 평가하는 것을 목표로 하는 이전 연구는 그루밍의 효능을 정량화하는 데는 효과적이지만 그루밍 기간이나 빈도10을 측정할 수 없습니다. 그러나 이 분석은 일반적으로 그리고 해부학적 영역별로 Drosophila 그루밍 빈도와 기간을 정량화할 수 있습니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 쉽게 수정할 수 있고 계산 배경이 없는 개인이 수행할 수 있기 때문에 현재 자동화된 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 필요한 장비를 통해 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있으므로 과도한 자가 그루밍 표현형의 존재 여부를 평가하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다( 재료 표 참조). 이를 통해 이 방법은 주로 학부 기관에서 쉽게 접근할 수 있으며 교육 환경이나 교육 실험실에 쉽게 적용할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 촬영 준비

  1. 흰색 표면에 4개의 3웰 접시를 나란히 놓고 각각을 유리 슬라이드로 덮습니다.
  2. 접시 위에 카메라(여기서는 Raspberry Pi 시스템이지만 고화질 비디오가 가능한 모든 카메라로 충분함)를 배치합니다.
    1. 모든 접시가 프레임과 초점에 있는지 확인하십시오.
    2. 접시에 있는 파리의 가시성을 제한하는 슬라이드에 눈부심이 없는지 확인하십시오. 플레이트 위치를 조정하거나 녹음 공간의 조명을 어둡게 하여 눈부심을 제거합니다.
    3. 고해상도(최소 1920 x 1080픽셀)를 사용하여 날아다니는 팔다리를 정확하게 시각화할 수 있습니다.
  3. 녹음이 이루어지는 벤치에 접시와 카메라의 위치를 표시합니다.
    알림: 이렇게 하면 향후 장치 사용 시 2단계에서 소요되는 시간이 제한됩니다. 동시에 동일한 공간에서 분석을 수행하면 의도된 조작을 넘어서는 요인에 따른 동작의 변동성을 제한할 수 있습니다.
  4. 파라필름과 종이 타월로 덮인 얼음 덩어리에 4-9일 된 파리를 감기에 걸고 가볍게 마취합니다(CO2 마취는 행동에 상당한 영향을 미칩니다).
    1. 파리를 블록에 두드리고 마취가 끝나면 페인트 브러시를 사용하여 가능한 한 빨리 파리를 관찰실로 옮깁니다.
      참고: 모든 종류의 마취제에 과도하게 노출되면 파리에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 이 이송은 가능한 한 빨리 이루어져야 합니다.
  5. 각 우물에 파리 한 마리를 놓습니다.
  6. 마취 후 30분 동안 파일이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 합니다. 이 시점 이후에는 스트레스 요인이 추가되면 행동에 영향을 미칠 수 있으므로 파리가 있는 우물을 만지거나 방해하지 마십시오.

2. 파리 기록

  1. 30분 동안 적응한 후 카메라를 사용하여 파리를 기록합니다.
  2. 동작 데이터 수집을 위해 PiSpy11 을 통해 실행되는 Raspberry Pi 카메라를 사용합니다.
    참고: 이 소프트웨어는 무료이며 GitHub(https://github.com/gpask/PiSpy)에서 사용할 수 있으며 Pi 시스템은 $300 미만으로 쉽게 설정할 수 있습니다. 이미 사용 가능한 경우 다른 카메라도 영상을 녹화하기에 충분합니다
  3. 다음 명령 흐름을 사용하여 Pi를 사용하여 녹음을 시작합니다.
    1. 터미널을 열고 cd PiSpy를 입력합니다. 그런 다음 python3 PiSpy.py 를 입력하고 원하는 녹화 길이를 입력한 다음 원하는 프레임 속도를 입력합니다. 원하는 해상도를 선택하고 빠른 캡처를 클릭합니다.
    2. 카메라 미리보기 기능을 사용하여 파리의 초점이 맞고 충분히 보이는지 확인합니다.
  4. 권장 프레임 속도 인 24fps로 10 분 동안 파리를 기록하고 파일을 저장하십시오 (PiSpy는 자동으로 비디오 폴더에 저장합니다).

3. 비디오 분석(그림 2)

  1. 비디오를 분석하려면 파일을 Elan 6.8 소프트웨어12로 가져옵니다.
    참고: 이 소프트웨어는 원래 비디오의 자세한 주석과 그루밍 행동에 대한 심층 분석을 위해 심리 언어학적 수지를 위해 개발되었습니다
  2. 아래 그림과 같이 각 행을 할당하여 개인의 영상에 수동으로 주석을 추가합니다.
    1. 다음 명령 흐름을 사용하여 이 작업을 수행합니다. Tier > Add New Tier > Type Location in the dish on Tier Name > Add.
  3. 연구의 필요에 따라 다양한 특정 행동(전방 및 후방 그루밍, 걷기, 수면 및 서기)을 기록하고 정량화합니다.
    1. 아래 단계에 따라 주석을 달아보세요.
      1. 주석을 달 계층을 두 번 클릭합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택한 티어를 따라 커서를 드래그하여 단일 그루밍 시합이 진행되는 동안 수행합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 New Annotation 을 선택한 다음 새로 강조 표시된 기간을 두 번 클릭합니다. 해당 시점에 나타난 행동에 대한 약어를 입력합니다.
    2. 비디오를 천천히 관찰하고 마우스로 문지르고 주석을 달아보세요. 동작의 잘못된 식별을 방지하기 위해 주석을 다는 동안 단일 플라이 웰을 확대합니다. 여기에는 파리로 유리 가장자리를 두드리거나 다리를 움직이는 것이 포함될 수 있으며, 이는 처음에는 그루밍처럼 보일 수 있습니다.
  4. 비디오에 완전히 주석이 추가되면 각 동작에 대한 분석을 얻습니다. 이 기능을 사용하려면 비디오 전체에서 동일한 약어 또는 주석이 사용되어야 합니다.
    참고: Elan 6.8은 동작이 발생하는 횟수, 동작의 총 지속 시간 및 각 동작에 소요된 평균 시간을 제공합니다.
    1. 그루밍 시합을 2초 동안 중단 없는 그루밍으로 정의합니다. 관찰된 각 동작을 다음과 같이 식별합니다. 분석법을 수행하기 전에 해부학적 영역에 대한 매개변수를 정의합니다.
      1. 전방 그루밍(Anterior grooming): 파리체의 앞쪽 부위에서 수행되는 그루밍을 전방 그루밍으로 식별합니다.
        참고: 이 행동은 거의 항상 파리의 앞 두 다리로 머리나 주둥이와 같은 앞쪽 부분을 문지르는 동작을 포함합니다.
      2. 후방 그루밍(Posterior grooming): 플라이 바디의 전후 끝에서 수행되는 그루밍을 후방 그루밍으로 식별합니다.
        참고: 또한 날개는 단순화를 위해 뒤쪽 영역에 포함되었습니다. 이 행동은 거의 항상 중앙과 가장 뒤쪽의 다리 세트를 즉석에서 문지르는 동작을 포함합니다. 뒤쪽 그루밍이 일어나고 있다는 좋은 지표는 그림 2D에 묘사된 것처럼 언뜻 보기에 파리가 가장 뒤쪽 다리가 없는 것처럼 보일 수 있다는 것입니다.

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Results

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이 분석은 주석이 달린 영상에서 그루밍 행동의 시간과 빈도를 측정하는 정량적 데이터를 생성합니다. 설정 및 동작 정의 방법의 대표적인 이미지는 그림 2에 요약되어 있습니다. 비디오 분석에 의해 도입되는 주관성을 감안할 때 비디오의 모든 주석은 분석을 수행하는 연구자에 대해 블라인드 처리되어야 합니다.

이 방법은 초파리 유전자 Atg8a가 그루밍 행동의 발달에 미치는 역할을 평가하는 데 사용되었습니다. Atg8a는 인간 유전자 GABARAP과 상동성이며, 일부 투렛 증후군(TS) 환자에서 발현이 감소한 것으로 나타났습니다9. TS는 틱으로 알려진 비자발적 움직임과 발성을 특징으로 하는 상태로, 일반적으로 강박적/강박적 행동을 유발하는 다른 상태와 동반됩니다13. 우리는 이러한 발현...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전반적으로 이 쉽게 실행할 수 있고 비용 효율적인 분석법은 Drosophila melanogaster 그루밍 행동의 강력한 특성화를 가능하게 합니다. 이 기술은 이전에 확인된 많은 수의 그루밍 행동의 빈도, 참여에 소요된 시간 및 해부학적 분포에 대한 통찰력을 제공합니다. 그루밍이 발생하거나 진행 중임을 나타내는 좋은 지표는 다리 배치의 변화, 특히 6개의 다리 중 하나를 올리는 것입니다. 다리를 움직인 후의 행동을 구체적으로 기록하면 그루밍 행동을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 일반적인 전체 그루밍에서 파리의 날개, 머리 또는 다리를 대상으로 하는 것과 같은 해부학적 영역에 특정한 고정관념적인 그루밍 행동에 이르기까지 다양한 행동 주석을 허용합니다. 이들 중 어느 것이든 연구의 필요에 맞게 포함하거나 무시할 수 있습니다. 여기에 제공된 대표적인 데이터에서, 우리는 투렛 증후군과 같은 신경 발달 상태와 관련된 강박적/강박적 행동의 대표...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험적 디자인에 대한 피드백을 제공해 준 John Young, 원고 수정을 제공한 Eric Luth, 그림 디자인을 지원해 준 Madeleine Hatfield에게 감사드립니다. 이 연구는 시몬스 대학과 생물학과의 자금 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16GB 마이크로 SD 카드Adafruit1294에 사용
Adafruit3578HDMI 또는 플렉스 케이블로 연결할 수 있는 모든 디스플레이로 충분합니다
Drosophila Atg8a-RNAi UAS 라인Bloomington Stock Center34340대표 데이터에 사용되는 라인
Drosophila Ok6 DriverN/AN/ALine 대표 데이터에 사용
유리 슬라이드Fisher Scientific12-550-A3파리를 격리
Adafruit컴퓨터 과열 방지
렌즈Adafruit4563HD 카메라 전용으로
사용 PiCameraAdafruit4561HD 버전이 여기에 사용되었지만 표준 카메라는 예산 제약 내에서 사용할 수 있습니다
Raspberry pi 4Adafruit4292컴퓨터 PiSpy는
Ribbion 케이블Adafruit1648카메라 및 디스플레이
SB 구성 요소Adafruit4301컴퓨터
스폿 플레이트Fisher ScientificS99406Pyrex 버전은 이미 사용 가능했지만 세포 배양 접시 또는 플라스틱 스폿 플레이트도 충분합니다
각대Best Buy6355959카메라의 서스펜션 및 포지셔닝을 위해 이를 수행할 수 있는 모든 장치로 충분합니다
USB C 전원 공급 장치Adafruit1995컴퓨터에 전원을 공급합니다
OS 디스플레이 도입 방열판 에서 실행됩니다 연결에 사용 Case 보호 . 삼도 충분합니다..

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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