방법 논문

증발 광 산란 검출기와 결합된 액체 크로마토그래피를 통한 지질 나노입자 RNA 전달 시스템의 4가지 구성 요소 결정

DOI:

10.3791/67711

⸱

2025년 5월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

이 논문에서

요약

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여기에서는 증발 광 산란 검출기(ELSD)와 결합된 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 지질 나노입자(LNP) RNA 전달 시스템의 4가지 구성 요소에 대한 정량 분석 방법을 확립합니다. 이 방법은 분리가 우수하고 감도가 높으며 효율이 높습니다.

초록

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이 기사에서는 지질 나노 입자(LNP) 성분을 분석하는 방법을 제시합니다. RNA 기반 약물의 핵심 매개체 역할을 하는 LNP는 주로 콜레스테롤, 변형이 있는 PEG, 이온화 가능한 지질 및 보조 지질로 구성됩니다. 이러한 성분은 극성이 약하여 머무름이 강하고 역상 크로마토그래피를 사용한 분리가 어려울 뿐만 아니라 뚜렷한 자외선 흡수 특성이 부족합니다. 이 문제를 해결하기 위해 액체 크로마토그래피 시스템과 ELSD(Evaporative Light-Scattering Detector)를 결합했습니다. 크로마토그래피 컬럼의 유형을 체계적으로 조정하고 이동상의 그래디언트 용리 프로그램을 최적화함으로써 4가지 중요한 구성 요소의 빠르고 완전한 baseline 분리가 이루어졌습니다. 최신 ELSD 기술을 활용하여 검출 감도를 크게 향상시키고 방법의 선형 범위를 확장했습니다. 실험 결과에 따르면 5μg/mL에서 250μg/mL의 농도 범위 내에서 LNP의 4가지 성분은 모두 0.999 이상의 상관 계수로 우수한 선형성을 나타내고 정확도는 94.2%에서 108.0% 사이였습니다. 정밀 실험에서 10μg/mL 표준물질에 대한 머무름 시간과 피크 면적의 상대 표준 편차는 각각 0.1% 및 2% 미만이었습니다. 이 방법을 사용하여 서로 다른 LNP 샘플을 분석할 때 모든 구성 요소가 성공적으로 분리되고 해당 함량이 정확하게 정량화되어 이 분석 접근 방식의 강력한 적응성을 강조합니다.

서론

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지질 나노 입자 (LNP)는 가장 진보 된 비 바이러스 유전자 전달 시스템 중 하나이며, 주로 안티 센스 올리고 뉴클레오티드, 작은 간섭 뉴클레오티드, mRNA 등과 같은 핵산 약물의 전달에 사용됩니다 1,2,3. LNP는 일반적으로 이온화 지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형 지질, 인지질 및 콜레스테롤의 4가지 구성 요소로 구성됩니다. 핵심 구성 요소는 이온화 가능한 지질이며, 이는 핵산 약물 전달의 효율성에 결정적인 요소입니다. 다른 세 가지 구성 요소는 LNP의 안정성을 높이고 면역 체계의 인식을 감소시킬 수 있습니다 4,5,6.

LNP에서 4가지 성분의 다양한 비율은 나노 입자의 자체 조립 과정에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 활성 제약 성분(API)의 캡슐화 효율, 전달 효능 및 생체 내 방출 속도 7,8,9와 같은 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 LNP 성분에 대한 정량적 분석 방법을 확립하는 것이 필수적이며, 이를 통해 최적의 LNP 전달 시스템10,11의 합성을 촉진할 수 있습니다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 제약 분석에 널리 사용되는 현대 분석 기술이며 높은 효율성, 감도 및 자동화 기능으로 높이 평가됩니다. HPLC는 기존 자외선(UV) 검출기뿐만 아니라 굴절률 검출기(RID), 증발 광 산란 검출기(ELSD), 하전 에어로졸 검출기(CAD) 및 고선택성 무선 주파수(RF) 검출기와 같은 범용 검출기를 포함한 다양한 검출기를 포함합니다12.

뚜렷한 UV 흡수 그룹이 없어 UV 검출기에서 반응을 얻지 못하는 LNP의 4가지 구성 요소를 분석하는 경우 범용 검출기의 사용을 고려했습니다. RID는 이러한 옵션 중 하나이지만 기울기 분석에 적합하지 않으며 다른 두 범용 검출기에 비해 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 따라서12로 선택되지 않았습니다. 또한 CAD 검출기는 높은 감도를 자랑하지만 엄청난 비용으로 인해 매력이 떨어집니다12.

결과적으로, ELSD 검출기가 선택되었다. 이 검출기는 고유한 이득 모드 옵션인 '와이드' 모드를 특징으로 하며, 이를 통해 고농도 및 미량 성분을 동시에 분석할 수 있어 감도를 향상시키고 선형 범위를 확장할 수 있습니다.

이 논문은 ELSD와 결합된 HPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피 컬럼의 최적화, 이동상의 그래디언트 용리 및 기타 조건을 통해 LNP의 4가지 구성 요소에 대한 효율적인 분리 및 정량 분석을 달성합니다13.

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프로토콜

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1. 악기 준비

  1. 기기 설정
    1. ELSD와 결합된 HPLC 시스템을 설정합니다.
  2. 컬럼 설치
    1. 크로마토그래피 컬럼(C4-300, 150mm × 4.6mm I.D., 5μm)을 컬럼의 화살표 방향으로 한쪽 끝은 자동 시료 주입기 배출구에 연결하고 다른 쪽 끝은 ELSD 주입구에 연결하여 설치합니다.
  3. 이동상 준비
    1. 이동상을 준비합니다: A상, 10mM TEAA 수용액(pH = 7.0) 및 B상, 10mM TEAA 메탄올 용액(pH = 7.0).
    2. A 상을 준비하려면 트리 에틸 아민 1.01g의 무게를 정확하게 측정하고 물 1000mL에 용해시킨 후 잘 섞은 후 아세트산으로 pH를 7.0으로 조정하십시오.
    3. B 상을 준비하려면 1.01g의 트리 에틸 아민을 1000mL의 메탄올에 용해시키고 혼합하여 아세트산으로 pH를 7.0으로 조정한다.
  4. 분석법 편집
    1. LC-ELSD의 각 모듈에 대한 전원 스위치를 켜고 LabSolutions 소프트웨어를 실행합니다. 그런 다음 실시간 분석 창을 엽니다.
    2. 파일을 클릭하고 새로 만들기를 선택하여 새 메서드 파일을 만듭니다. Method에서 LC Stop Time을 15로 수정하고 Apply to all Acquisition Time을 클릭합니다.
    3. 그런 다음 Pump 를 클릭하여 펌프 매개변수를 수정합니다. 분석 모드를 Binary High-Pressure Gradient (B.GE)로 선택하고 유속을 1.0mL/분으로 설정합니다.
    4. 그런 다음 초기 펌프 B 농도(%B)를 80%로 설정하고 이동상 구배를 수정합니다. 3분에서 %B는 80%, 4분에서 %B는 5.5분에서 12분으로 85%, %B는 100%, 12.1분, %B는 80%로 돌아갑니다.
    5. 그런 다음 컬럼 오븐 을 클릭하고 오븐 온도를 55°C로 설정합니다. 마지막으로 ELSD 를 클릭하여 드리프트 튜브 온도를 40°C로 수정합니다. 메서드를 저장합니다.
      참고: 매개변수의 요약은 표 1에 나와 있습니다.
  5. 기기를 시작하고 평형을 이룹니다.
    1. Download and Startup을 클릭하여 기기를 시작하고 평형을 이룹니다.

2. 표준 용액 및 시료 준비

  1. 표준 용액 준비
    1. 4가지 LNP 성분 표준 물질 중 10.0mg을 개별적으로 정확하게 칭량하고 1mL의 메탄올에 용해시킨 다음 완전히 용해될 때까지 와류를 일으켜 각 성분에 대해 10mg/mL 농도의 원액을 얻습니다.
    2. 피펫을 사용하여 4가지 원액 각각을 100μL씩 시료 바이알에 정확하게 전달한 다음 600μL의 메탄올을 첨가합니다. 철저히 혼합하여 1000 μg/mL 농도의 혼합 중간 용액 1을 준비합니다.
    3. 4가지 원액 각각을 20μL씩 시료 바이알에 정확하게 전달한 다음 920μL의 메탄올을 첨가합니다. 완전히 혼합하여 200 μg / mL 농도의 혼합 중간 용액 2를 준비합니다.
    4. 다음으로, 표 2에 따라 연속 희석하여 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL 및 250 μg/mL 농도의 일련의 표준 용액을 준비합니다.
  2. 시료 준비
    1. 피펫을 사용하여 100μL의 시료를 시료 바이알에 정확하게 전달한 다음 900μL의 메탄올을 첨가하고 잘 혼합합니다. 이 시점에서 샘플의 LNP 농도가 10배 희석되고 LNP가 핵산 약물에서 해리되었는지 확인합니다.

3. 데이터 수집

  1. 표준 용액과 시료 용액을 액체 크로마토그래프의 자동시료주입기에 넣습니다.
  2. 실시간 분석 창의 보조 도구 모음에서 실시간 배치를 클릭합니다. 그런 다음 파일 메뉴에서 새로 만들기를 클릭하여 새 배치 테이블을 만듭니다.
  3. 배치 테이블에서 Vial#, Tray Name, Data 파일, 표준물질 및 샘플 용액의 주입 부피를 입력하고 1.4단계에서 저장한 Method 파일을 선택합니다. 파일 메뉴에서 배치 파일 저장을 클릭하여 배치 파일을 저장합니다.
  4. 액체 크로마토그래프 압력과 크로마토그램의 기준선이 안정될 때까지 기다립니다. 그런 다음 어시스턴트 도구 모음에서 Start Realtime Batch 를 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다.

4. 데이터 분석

  1. 검량선 설정
    1. LabSolutions 소프트웨어의 브라우저 창을 열고 표준 용액 데이터를 정량적 결과 보기로 끌어 검량 곡선을 설정합니다. 그런 다음 데이터 처리 매개 변수를 수정합니다. Method View(방법 보기)에서 Edit(편집)를 클릭합니다.
    2. 적분 파라미터(Integration Parameters) 창에서 기울기 값을 10000으로 변경합니다. 그런 다음 Identification Parameters(식별 매개변수)에서 식별 방법을 Band(밴드)로 변경하고 Default Bandwidth(기본 대역폭)를 0.1분으로 설정합니다.
    3. 그런 다음 정량적 매개변수를 수정합니다. Quantitative Method 를 External Standard로 변경하고 Calibration Level의 #을 7로 설정합니다. 검량곡선 유형을 Exponentially로 선택합니다. 다음으로 컴파운드를 수정합니다.
    4. 4가지 LNP 성분의 이름과 표준 용액 농도를 입력합니다. peak apex를 두 번 클릭하여 보존 시간을 업데이트합니다. 마지막으로 보기를 클릭하여 데이터 처리 매개 변수의 수정을 완료합니다.
    5. Quantitative Results View(정량 결과 보기)에서 Sample Type(시료 유형)을 표준(Calc. Point)으로 수정합니다. 농도에 따라 표준 용액의 수준을 1-7로 설정하십시오. 검량 곡선이 설정되면 메뉴 표시줄에서 File(파일)을 클릭하고 Method 파일을 저장합니다.
  2. 시료의 정량 분석
    1. 샘플 데이터를 브라우저 창의 정량적 결과 보기로 드래그하면 샘플에 있는 4개의 LNP 구성 요소에 대한 농도 결과가 표시됩니다.

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결과

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이 방법을 사용하여 LNP 표준 용액을 분석한 결과 4가지 성분에 대해 1.5 이상의 분리도를 달성하여 기준선 분리를 실현했습니다. 또한, 그림 1에 표시된 것처럼 고농도 표준 용액에서 잔류물이 관찰되지 않았습니다. 검량선은 5 - 250 μg/mL의 농도 범위 내에서 설정되었으며, 모두 0.999를 초과하는 상관 계수를 나타내어 넓은 선형 범위와 우수한 선형성을 나타냅니다. 검량선은 그림 2에 나와 있습니다.

이 방법의 재현성을 조사하기 위해 10μg/mL 농도의 표준 용액을 6회 반복 주입 및 분석했습니다. 머무름 시간에 대한 상대 표준 편차(RSD)는 0.1% 미만이었고 피크 면적에 대한 RSD는 2% 미만으로 높은 재현성을 보여주었습니다. 해당 크로마토그램은 그림 3에 나와 있습니다.

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토론

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LNP의 4가지 구성 요소는 모두 상대적으로 약한 극성을 나타냅니다. C18 컬럼을 사용하여 분석했을 때, 타겟 화합물은 컬럼 내에서 강력한 머무름을 보여주어 강하게 머무른 성분에 대한 인지질 피크의 확장으로 이어집니다. 또한 고농도 용액을 분석한 후 C18 컬럼 헤드에 잔류물이 축적되어 정량화의 정확성을 떨어뜨릴 수 있습니다. 크로마토그램은 그림 5에 나와 있습니다.

방법을 최적화하기 위해 소수성이 더 약한 C4 컬럼을 대신 선택했습니다. 이 선택은 표적 화합물과 크로마토그래피 컬럼 사이의 상호 작용력을 줄여 분석 시간을 단축하는 것을 목표로 했습니다. 또한 최적화된 방법을 통해 시스템의 고농도 표준물질에서 잔류물이 검출되지 않았습니다. 이 실험에서는 특히 생물학적 샘플에 대한 C4 컬럼이 사용되었습니다. 이 컬럼은 날카롭고 대칭적인 피크 모양을 가진 고분해능 크로...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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실험에 LNP 샘플을 공급해 준 바이오 제약 회사에 감사를 표하고, 크로마토그래피 컬럼을 제공한 Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
밸런스Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdAP135W
ColumnShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO.,LT
LCShimadzu (중국) CO., LTDLC40D XR
메탄올ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
피펫-100 &마이크로; LShimadzu (상해) 세계적인 실험실 소모품 Co., 주식 회사00-NAR-100
피펫 1000 &마이크로; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
차ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
초순수 시스템MilliporeZIQ7000T0C
Vortex MixerANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

참고문헌

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
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  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
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  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
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  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

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