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방법 논문

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

2.1K 조회수

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DOI:

10.3791/67716

⸱

2025년 8월 1일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

이 논문에서

요약

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

초록

신장으로의 유전자 전달을 위한 효과적인 생체 내 도구 및 방법의 개발은 신장 질환에 대한 기초 신장 연구 및 유전자 치료를 발전시키는 데 매우 중요합니다. 또한, 첨단 유전자 검사를 통해 단일 유전자 신장 질환에 대한 인식이 높아지면서 치료하기 어려운 유전 신장 질환을 치료하고 심지어 치료할 수 있는 유전자 치료의 잠재력이 강조되고 있습니다. 이와 관련하여 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 생체 내 유전자 전달을 위한 강력한 플랫폼으로 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 그러나 신장의 각 치료적으로 관련된 세포 유형에 대한 AAV 벡터 매개 유전자 전달을 위한 가장 효과적이고 안전한 방법은 아직 완전히 확립되지 않았습니다. 여기에서는 AAV 벡터의 느린 역행 신우(RP) 주입 방법을 자세히 설명하고, 적절하게 선택된 AAV 캡시드와 함께 사용할 때 마우스 신장을 형질도입할 수 있는 높은 잠재력이 입증됩니다. 또한, 이 방법은 표준 염화세슘 초원심분리 정제 AAV(CsCl AAV) 벡터뿐만 아니라 전문적인 AAV 벡터 전문 지식이 필요하지 않은 기술을 사용하여 빠르고 간단하게 준비할 수 있는 원심 한외여과 AAV(CU AAV) 벡터 미니프렙에도 효과적인 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 이 연구는 CsCl 및 CU AAV-KP3 벡터의 느린 RP 주입이 필연적으로 조직 손상으로 이어지는 이전에 보고된 유체역학적 접근법과 달리 명백한 조직 손상 없이 마우스 신장에서 근위 세뇨관의 강력한 형질도입을 초래한다는 것을 보여줍니다. 따라서 이 연구는 선택된 AAV 캡시드 유래 벡터의 느린 역행 RP 주입이 신장으로의 유전자 전달을 위한 효과적이고 안전한 방법임을 강조합니다. 이 방법은 유전자 치료 연구를 포함한 광범위한 신장 연구에 적용할 수 있습니다. CU AAV 벡터 미니프렙을 사용하면 처리량이 크게 증가하고 예비 데이터를 생성하고 중요한 통찰력을 얻는 데 필요한 시간 및 비용 효율성이 향상됩니다.

서론

크고 작은 실험 동물에서 신장에 유전자 전달을 위한 효과적이고 안전한 방법은 기초 신장 연구를 발전시키고 혁신적인 치료 접근법을 탐색할 수 있는 중요한 기회를 제공합니다. 이러한 방법을 확립하는 것은 특히 다양한 신장 질환에 대한 유전자 치료와 관련이 있습니다. 최근 임상 유전자 검사의 발전으로 단일 유전자 신장 질환의 유병률이 이전에 추정된 것보다 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 만성 신장 질환(CKD) 환자의 약 30%에 영향을 미칩니다1. CKD는 진행성 신장 손상을 특징으로 하며, 궁극적으로 진정으로 효과적인 질병 수정 요법 없이 신부전으로 이어집니다. 혈액 투석과 신장 이식은 현재 이용 가능한 치료법입니다. 그러나 CKD 환자의 삶의 질을 크게 손상시키는 한계가 있습니다2. 따라서 유전 질환 치료에 대한 임상적으로 입증된 강력한 접근 방식인 유전자 치료는 CKD로 이어지는 유전 신장 질환을 효과적으로 치료하기 위한 새로운 방법으로 최근 몇 년 동안 큰 주목을 받고 있습니다 3,4,5,6. 이 접근 방식은 질병의 근본 원인을 직접적으로 해결하고 잠재적으로 치료법을 제공할 수 있습니다.

이 분야의 꾸준한 발전에도 불구하고 신장으로의 유전자 전달은 연구 및 치료 환경 모두에서 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 사구체 내피 세포, 사구체 기저막, 족세포 발 돌기로 구성된 사구체 여과 장벽 등 장기의 복잡한 구조와 독특한 생리적 장벽으로 인해 치료 유전자를 가진 신장 세포를 효율적으로 표적으로 삼는 것은 어렵습니다. 직접 신장 피질(RC) 주사 7,8, 신장 동맥(RA) 주사 9,10,11, 신장 정맥(RV) 주사 12,13,14, 신우(RP) 주사 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 및 바이러스 또는 비바이러스 유전자 전달 벡터의 정맥(IV) 주사19,26,27,28,29,30 및 초음파 및 마이크로버블 매개 핵산 전달 31,32. 이러한 접근법은 다양한 형질도입 효율 또는 기능적 결과를 입증했으며, 종종 조정하기 어려운 일관되지 않은 결과를 산출했습니다(참고 문헌 3,33,34,35에서 검토됨). 신장으로의 유전자 전달은 아직 미숙하여 벡터 시스템과 방법론을 직접 비교하는 것이 어렵습니다. 그러나 고농축 제제를 신장에 직접 투여하는 국소 전달 방법은 일반적으로 전신 IV 전달보다 더 나은 결과를 달성했습니다. 또한, 강력한 안전성 프로파일과 입증된 임상 번역 실적을 갖춘 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터36,37이 가장 많이 연구되었으며 신장 유전자 전달을 위한 주요 선택으로 간주됩니다.

일반적인 AAV 혈청형 및 조작된 캡시드는 마우스에서 IV 주사 후 신장에서 중간엽 및 중간엽 세포의 효과적인 형질도입을 입증했습니다 28,30,38. 특히, 최근 연구에서는 AAV9의 IV 투여가 신증후군 및 알포트 증후군의 마우스 모델에서 족세포를 효과적으로 형질도입할 수 있지만 이러한 효과는 건강한 신장에서는 관찰되지 않음38,39 그리고 조작된 AAV2 캡시드의 IV 투여는 마우스의 건강한 신장과 염증이 있는 신장 모두에서 사구체 내피 세포를 독점적으로 표적으로 삼을 수 있습니다40. 역사적으로 세뇨관은 IV 경로를 통해 형질전달하는 것이 어려웠습니다. 그러나 AAV-KP141과 같은 선택된 AAV 캡시드의 RP 주입이 벤치마크 AAV9 캡시드38로 달성한 것보다 훨씬 더 높은 수준에서 근위 세뇨관의 형질도입을 달성할 수 있다는 것이 최근에 발견되었습니다. 추가 개선이 필요하지만 이러한 발전은 기초 신장 연구 및 유전자 치료를 위한 새로운 길을 열어 이전에는 달성할 수 없었던 기회를 제공합니다.

본 기사에서 AAV 벡터의 느린 역행 RP 주사는 마우스 신장으로의 유전자 전달을 위한 효과적이고 안전한 방법으로 자세히 설명되어 있습니다38. 이 기술의 대표적인 예로서, AAV-KP3는 마우스에서 RP 주입 후 AAV9에 비해 향상된 신장 형질도입을 나타낸 6개의 캡시드(즉, AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 및 AAV2.7m844) 중 하나라는 발견에 기초하여 모범적인 캡시드로 선택되었다. 특히, 느린 역행 RP 주사 신장 조직은 이전에 보고된 유체역학적 접근법으로 치료된 조직과 달리 명백한 조직 손상을 보이지 않았습니다23,24. 또한, 빠르고 간단한 원심 한외여과에 의해 조잡하게 정제된 AAV 미니프립 벡터(45)(즉, CU AAV 벡터)는 동일한 벡터 게놈 역가로 투여될 때 표준 염화세슘(CsCl) 구배 초원심분리(즉, CsCl AAV 벡터)에 의해 정제된 AAV 벡터 제제에 의해 달성할 수 있는 것의 약 70%의 신장 형질도입 수준을 달성하였다. 따라서 여기에 제시된 방법과 관찰은 생쥐와 잠재적으로 더 큰 동물의 신장으로의 유전자 전달을 향상시키려는 연구자에게 가치 있고 실용적인 자원을 제공합니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 실험은 오레곤 보건 과학 대학(OHSU)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 OHSU의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 8주 된 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 아데노바이러스가 없는 플라스미드 형질감염에 의한 AAV 벡터 생산

  1. 5% 이산화탄소(CO2)가 함유된 37°C 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 믹스 및 1mM L-글루타민이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)-고포도당(4.5g/L)에서 인간 배아 신장(HEK) 293 세포를 배양합니다.
  2. -2일(형질감염 전 48시간)에, 단계 1.1에 설명된 바와 같이 40mL의 배양 배지에 T225 플라스크당 4 x 106 HEK 293 세포를 플레이트합니다. 이는 0일차에 ~95% 합류에 도달합니다.
    알림: 배양 척도는 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. AAV 미니프립(2단계)의 경우, 정제 공정에서 일반적으로 약 50%의 물질 손실이 발생한다는 점을 고려하여 목표 역가 및 벡터 농도에 따라 적절한 수의 플라스크를 준비합니다. 50μL 벡터 용액에서 3 x 1011 vg/마우스의 용량으로 마우스의 RP 주입을 위한 >6 x10 12 vg/mL의 AAV9 및 AAV-KP3 벡터를 달성하려면 최소 2개의 플라스크가 권장됩니다. CsCl 밀도 구배 정제 AAV 벡터(CsCl AAV)와 같은 대규모 AAV 벡터 생산의 경우 일반적으로 25개 이상의 플라스크가 사용됩니다.
  3. 0일차: 플라스미드 DNA 형질감염
    1. 형질감염 준비
      1. 셀이 ~95% 컨플루션에 도달했는지 확인합니다.
      2. 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 믹스 및 1mM L-글루타민을 보충하지만 FBS(즉, 무혈청 배지)를 사용하지 않은 DMEM을 37°C 수조에서 예열합니다.
      3. 선형 폴리에틸레니민(PEI) 용액이 실온에 도달하도록 합니다.
    2. 플라스미드 DNA 혼합물의 제조
      1. 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 CaCl2 또는 MgCl2 가 없는 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 플라스미드(pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap 및 pHelper 각 15μg)를 혼합합니다. DNA의 총량은 45μg/플라스크입니다.
        참고: 플라스미드 DNA 용액 부피가 최소인 경우 무시할 수 있습니다. 그러나 총 용액 부피가 ≥225μL인 경우 부피 조정이 권장됩니다. 이 연구에 사용된 플라스미드의 서열은 보충 파일 1에서 사용할 수 있습니다.
    3. PEI 형질감염
      1. 90μL의 PEI 용액(1mg/mL)을 1mL의 PBS에 첨가하고 50mL 폴리프로필렌 튜브에서 PBS-플라스미드 DNA 혼합물(위와 같이 준비됨)과 혼합합니다. 최종 부피는 약 2mL(배양 배지의 5% 부피)입니다.
      2. 튜브를 5초 동안 소용돌이치고 원심분리기로 튜브를 잠시 회전시켜 액체를 튜브 바닥으로 모아줍니다.
    4. 플라스미드 DNA-PEI 복합체를 형성하기 위해 실온에서 15분 동안 보관합니다.
    5. 15분 배양이 완료되면 단계 1.3.1.2에서 준비된 예열된 무혈청 배지 40mL를 플라스미드 DNA-PEI 복합체에 첨가합니다. 부피는 약 42mL입니다.
    6. T225 플라스크의 배양 배지를 단계 1.3.4에 설명된 무혈청 배지를 포함하는 플라스미드 DNA-PEI 복합체로 교체합니다.
    7. 5일째에 수확할 때까지 이 형질감염 배지에서 세포를 유지합니다(배지 교체가 필요하지 않음).
    8. 2일째에 플라스미드 형질감염 효율을 평가하기 위해 역형광 현미경에서 형광 단백질(예: pAAV-CAG-tdTomato)을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 세포를 관찰합니다.
      참고: 위에서 설명한 조건은 일반적으로 형질감염 효율이 70%를 초과합니다. 일부 형태학적 변화(예: 세포 신장)가 관찰될 수 있는데, 이는 아마도 무혈청 환경으로 인한 것일 수 있습니다.
    9. 3일에서 5일째, 형질감염된 세포를 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서 계속 배양합니다.
    10. 5일째에 세포와 바이러스 함유 배지를 모두 50mL 폴리프로필렌 튜브에 수집합니다.
    11. 샘플을 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

2. AAV 벡터의 원심 한외여과(CU) 정제(AAV miniprep)

  1. 1.3.11단계의 냉동 샘플을 37°C 수조에서 해동합니다.
  2. DNA 도트 블롯 분석(분획 1로 사용)을 위해 1mL의 조 용해물을 따로 보관합니다.
  3. 80μL의 1M 염화마그네슘(MgCl2, 최종 농도 2mM), 160μL의 0.1M 수산화나트륨(NaOH, 최종 농도 0.4mM) 및 16μL의 Serratia marcescens endonuclease(최종 농도 100단위/mL)를 50mL 튜브에 첨가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 15분마다 샘플을 소용돌이치게 합니다.
  4. Serratia marcescens 엔도뉴클레아제 처리된 샘플을 250mL 원심분리기 병에 수집하고 4°C에서 10,000 x g 으로 30분 동안 원심분리합니다.
  5. 50mL 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 50mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
  6. 0.45μm PVDF 주사기 필터를 사용하여 상청액을 여과하여 잔해물을 제거합니다. DNA 도트 블롯 분석(분획 2로 사용)을 위해 0.45μm-여과된 샘플 1mL를 따로 보관합니다.
  7. 100 kDa 분자량 차단(MWCO) 원심 한외여과 튜브에 분자 등급 물 10 mL를 넣고 4°C에서 2,000 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 제거합니다.
  8. PBS 내 5% 소르비톨 15mL를 원심 한외여과 튜브에 넣고 4°C에서 2,000 x g 으로 10분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 제거합니다.
  9. 단계 2.6에 설명된 대로 0.45μm-여과된 샘플을 최대 15mL까지 추가하고 약 500μL의 목표 부피에 도달할 때까지 농축을 위해 4°C에서 15분 동안 2,000 x g 에서 원심분리합니다. DNA 도트 블롯 분석(분획 3으로 사용)을 위해 1mL의 플로우 스루를 따로 보관합니다.
    참고: 각 원심분리 전에 피펫으로 잔류물을 재현탁하여 농도 구배를 방해하십시오. 피펫 팁으로 멤브레인을 만지지 마십시오. 15분 원심분리 후에도 목표 부피에 도달하지 못하면 튜브의 남은 부피에 따라 지속 시간을 조정하여 필요에 따라 원심분리를 연장합니다.
  10. 전체 샘플이 여과되어 약 500μL의 목표 부피에 도달할 때까지 2.9단계를 반복합니다. DNA 도트 블롯 분석(분획 4 및 분획 5로 사용)을 위해 2.10단계의 첫 번째 및 두 번째 반복에서 유동 1mL를 따로 보관합니다.
    알림: 단일 원심 한외여과 튜브를 사용하여 두 개 이상의 플라스크에서 얻은 샘플을 처리할 수 있습니다.
  11. PBS에 5% 소르비톨 15mL를 첨가하고 약 500μL의 목표 부피에 도달할 때까지 4°C에서 2,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. DNA 도트 블롯 분석(분획 6으로 사용)을 위해 1mL의 플로우 스루를 따로 보관합니다.
  12. 2.11단계(분수 7로 사용)를 반복합니다.
    참고: 다운스트림 실험에 더 높은 AAV 역가가 필요한 경우 최종 표적 부피를 150μL로 더 줄일 수 있습니다.
  13. 한외여과된 AAV 벡터를 O-링이 있는 2mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. DNA 도트 블롯 분석(분획 8로 사용)을 위해 한외여과된 AAV 벡터 10μL를 따로 보관합니다.
  14. 앞서 설명한 바와 같이 DNA 도트 블롯 분석법에 의해 AAV 역가를 결정합니다46.
    참고: CU 정제 벡터(CU AAV)는 CsCl 정제 벡터(CsCl AAV)에 비해 더 높은 수준의 빈 캡시드 오염 및 숙주 세포 유래 불순물을 함유합니다. 이러한 요인은 형질도입 효율성과 면역 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 데이터 해석 시 신중한 고려가 필요합니다.

3. AAV 벡터의 CsCl 밀도-구배 정제

  1. 1.3.11단계의 냉동 샘플을 37°C 수조에서 해동합니다.
  2. 4°C에서 10,000 x g 으로 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  3. 상청액을 수집하고 폴리에틸렌 글리콜 8000(PEG, 최종 농도 8%)과 염화나트륨(최종 농도 500mM)을 첨가하여 상청액에 AAV 벡터를 침전시킵니다.
  4. 얼음 위에서 3시간 동안 배양합니다.
  5. AAV를 함유한 펠릿을 얻기 위해 4°C에서 10,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
  6. 상청액을 제거하고 재현탁 완충액 (50mM HEPES, 150mM NaCl, 1% Sarkosyl, pH 8.0) 함유 Sarkosyl 10ml로 펠릿을 재현탁합니다.
  7. 펠릿 현탁액을 15mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 밤새 4°C에서 보관합니다.
  8. 다음날, Serratia marcescens endonuclease(최종 농도 200 단위/mL) 및 MgCl2 (최종 농도 2mM)로 펠릿 현탁액을 처리합니다.
  9. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  10. 4°C에서 10,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
  11. 상청액을 수집하고 염화세슘(CsCl, 굴절률(RI)의 최종 농도 = 1.3710 +/- 0.0005) 및 EDTA(최종 농도 20mM)를 첨가합니다.
  12. 샘플을 29.9mL 초원심분리기 튜브에 넣고 토핑 용액(50mM HEPES, 150mM NaCl, 20mM EDTA, CsCl(RI = 1.3710 +/- 0.0005), pH 8.0)이 가득 찰 때까지 추가합니다.
  13. 12°C에서 41,000 x g 으로 22시간 동안 원심분리합니다.
  14. 초원심분리기 튜브의 바닥과 측면에 구멍을 뚫어 각각 2mL씩 총 15개의 분획물을 수집합니다.
  15. 각 분획의 10μL를 사용하여 RI를 확인하고 DNA 도트 블롯 분석(46)을 수행합니다.
  16. RI 및 DNA 도트 블롯 분석 결과를 기반으로 AAV 벡터를 포함하는 최상의 5개 분획을 결정합니다.
  17. 가장 좋은 5개의 분획(총 약 10mL)을 결합하고 RI를 1.3710 +/- 0.0005로 조정합니다.
  18. 샘플을 11.2mL 초원심분리기 튜브에 넣고 가득 찰 때까지 토핑 용액을 추가합니다.
  19. 12°C에서 65,000 x g 에서 12시간 동안 원심분리합니다.
  20. 11.2mL 초원심분리기 튜브의 바닥과 측면에 구멍을 뚫어 각각 0.5mL씩 총 18개의 분획물을 수집합니다.
  21. 각 분획의 10μL를 사용하여 RI를 확인하고 DNA 도트 블롯 분석(46)을 수행합니다.
  22. RI 및 DNA 도트 블롯 분석 결과를 기반으로 AAV 벡터를 포함하는 최상의 6개 분획을 결정합니다.
  23. 가장 좋은 6개의 분획(총 약 3mL)을 결합하여 투석 카세트에 넣습니다.
  24. 투석 카세트를 1.3L의 투석 완충액(0.001% 비이온성 계면활성제가 보충된 PBS 완충액)에 2시간 동안 교반 막대와 함께 띄워 CsCl을 제거합니다.
  25. 3.24단계를 두 번 반복합니다(총 6시간의 투석).
  26. 완충액 교환을 위해 0.001% 계면활성제가 보충된 PBS 완충액에 500mL의 5% 소르비톨 카세트를 2시간 동안 옮깁니다.
  27. 주사기로 투석 카세트에서 샘플을 수집하고 0.22μm PVDF 주사기 필터를 사용하여 수집된 샘플을 필터링합니다.
  28. 정량적 도트 블롯 분석법에 의해 결정된 AAV 역가46.

4. SDS-PAGE에 의한 AAV 벡터 제제의 품질 평가 후 은 염색

  1. 벡터 전제, CsCl AAV 벡터의 경우 1 x 1010 vg , CU AAV 벡터의 경우 1 x 109 및 1 x10 10 vg 를 총 18 μL(벡터 전제: 6x Laemmli = 15:3)의 6x Laemmli 완충액과 혼합하고 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 열처리된 AAV 벡터 준비물을 7.5% SDS-PAGE 겔에 로드하고 Tris-글리신-SDS 겔 러닝 버퍼를 사용하여 20mA에서 샘플을 전기영동합니다.
  3. 젤 카세트에서 젤을 제거하고 초순수로 헹구고 제조업체의 지침에 따라 은색 염색 키트를 사용하여 염색합니다.
  4. CsCl AAV 벡터가 로드된 겔을 현상 용액에 7분 동안 배양하고, 신호 포화를 피하기 위해 CU AAV 벡터가 로드된 겔을 2분 동안 배양합니다.
    참고: Cu AAV 벡터 제제는 CsCl AAV 벡터에 비해 더 높은 수준의 단백질 불순물을 함유하고 있습니다. 따라서 CsCl AAV 및 CU AAV 벡터가 로드된 겔은 겔 실행 후 분리하고 별도로 은염색하여 염색법의 고감도로 인한 신호 포화를 방지하였다.

5. 웨스턴 블롯에 의한 CU AAV 벡터 제제에서 AAV VP 단백질의 동정

  1. 1 x 109 vg의 CU AAV 벡터 제제를 6x Laemmli 완충액과 총 18 μL(벡터 제제: 6x Laemmli = 15:3)로 혼합하고 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 열처리된 AAV 벡터 준비물을 7.5% SDS-PAGE 겔에 로드하고 Tris-글리신-SDS 겔 러닝 버퍼를 사용하여 20mA에서 샘플을 전기영동합니다.
  3. 반건식 전사 시스템을 사용하여 메탄올에서 활성화된 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 겔의 단백질을 전기전사합니다.
  4. 실온에서 1시간 동안 Tween 20(TBST)이 포함된 1x Tris 완충 식염수에 5% 탈지유로 멤브레인을 차단합니다.
  5. 차단된 멤브레인을 1차 항체 용액(토끼 다클론 항-VP 항체, 1x TBST에서 5% 탈지유로 1:1000으로 희석)과 함께 밤새 4°C에서 배양합니다.
  6. 멤브레인을 1x TBST로 10분, 3회 세척합니다.
  7. 멤브레인을 2차 항체 용액(양 고추냉이 과산화효소와 접합된 염소 항토끼 IgG 항체, 1x TBST에서 5% 탈지유로 1:5000으로 희석)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  8. 멤브레인을 1x TBST로 10분, 3회 세척합니다.
  9. 웨스턴 블롯 이미징 시스템을 사용하여 멤브레인의 신호를 시각화합니다.

6. 신우(RP) 주사

  1. 수술 전 설정 및 마취
    1. 0.1g까지 정확한 체중계로 플라스틱 비커에 담긴 각 마우스의 체중을 측정합니다.
    2. 수술 전 진통을 제공하기 위해 체중에 따라 멜록시캄(5mg/kg)을 피하 투여합니다.
    3. AAV 벡터 용액을 PBS의 5% 소르비톨로 6.0 x 1012 vg/mL의 농도로 희석하고 얼음 위에 보관합니다.
      참고: 기밀성 유리 주사기 및 PE-10 폴리에틸렌 튜브의 데드 스페이스를 설명하기 위해 총 주입량(50μL x 주입할 마우스 수)보다 40μL 더 많은 AAV 용액을 준비합니다.
    4. 바늘 홀더를 사용하여 30G 바늘에서 바늘 끝만 구부리고 부러뜨립니다.
    5. 실체 현미경 아래에서 30G 바늘 끝, 15cm의 PE-10 튜브, 30G 바늘 및 기밀 유리 주사기를 끝에서 이 순서대로 연결합니다(그림 1D).
    6. 연결된 기밀 유리 주사기를 주입 주사기 펌프에 놓습니다.
    7. 6.1.3단계에서 준비된 AAV 벡터 용액 90μL를 주입 주사기 펌프를 사용하여 기밀성 유리 주사기에 흡인합니다.
    8. 주사기 펌프의 주입 모드를 다음과 같이 설정합니다: 목표 부피 50μL, 유속 50μL/min.
    9. 마우스가 완전히 마취될 때까지 1.5 내지 3.0 L/min의 유속으로 100% 산소로 전달된 4% 이소플루란으로 채워진 플라스틱 챔버에 마우스를 놓습니다.
    10. 마우스의 주둥이를 1.5% 내지 3.0% 이소플루란 흐름이 있는 비강 원뿔에 넣습니다. 수술 과정 전반에 걸쳐 발가락 꼬집기 반사로 마취 깊이를 모니터링합니다.
    11. 각막 건조를 방지하기 위해 면봉 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 안과용 연고로 눈을 덮습니다.
    12. 끝이 면으로 된 어플리케이터를 사용하여 제모제로 마우스의 왼쪽 뒷면에서 털을 제거합니다.
      참고: 제모 크림은 피부 자극을 방지하기 위해 헹굼을 통해 완전히 제거해야 합니다.
    13. 온열 요법 펌프에 연결된 폐쇄 루프 열 패드에 마우스를 측면 위치에 놓아 체온을 37°C로 유지합니다(접착 테이프로 고정할 필요 없음).
    14. 절개 부위에서 시작하여 면봉 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 세 번 번갈아 가며 면도한 부위를 소독합니다.
    15. 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다.
  2. 왼쪽 신장에 RP 주사
    1. 조직 겸자로 피부를 꼬집고 왼쪽 신장 위치의 늑척추각 수준에서 수술용 가위로 피부층을 약 1cm 절개합니다.
    2. 피부 절개를 한 후 근육층을 같은 길이로 자릅니다.
      참고: 절개 길이가 너무 짧으면 신장이 노출되지 않으며, 대신 크기가 작은 비장이 실수로 노출될 수 있습니다. 반면, 절개 길이가 너무 길면 절개 자체에 의해 신장이 제자리에 유지되지 않고 절개를 통해 계속해서 복부로 미끄러져 들어갑니다.
    3. 신장을 직접 만지지 않고 손가락으로 복부를 부드럽게 눌러 절개 부위를 통해 신장이 노출되도록 합니다(그림 1A).
    4. 신우가 작은 흰색 영역으로 보이도록 주변 지방을 최소한으로 제거합니다.
    5. 먼저 직선형 미세혈관클립으로 요관을 고정한 다음 구부러진 미세혈관클립으로 신동맥과 신정맥을 함께 고정합니다.
      참고: 신장 색상이 짙은 빨간색으로 변하여 신장 안팎으로 혈류가 성공적으로 차단되었음을 확인합니다(그림 1B).
    6. 주사기 펌프에 연결된 30G 바늘을 곡선 겸자로 골반강에 약 3mm 삽입하고 주입 주사기 펌프를 사용하여 1분 동안 50μL/min의 유속으로 50μL의 AAV 벡터 용액 주입을 시작합니다(그림 1C).
    7. 바늘과 클램프를 유지하여 주입된 신장의 AAV 벡터에 대한 노출을 증가시키기 위해 5분 동안 사용합니다.
      참고: 적절한 체류 시간은 AAV 캡시드에 따라 다를 수 있습니다. 5분의 체류 시간은 AAV-KP1 또는 AAV-KP3 벡터로 형질도입하기에 충분한 것으로 나타났습니다.
    8. 5분 배양이 완료되면 클램프를 제거합니다.
      참고: 신장 색상이 즉시 짙은 빨간색에서 핏빛 빨간색으로 변하여 신장의 혈류 회복을 확인합니다.
    9. 주사 바늘을 조심스럽고 천천히 빼내고 동시에 면봉 끝이 있는 어플리케이터를 주사 부위에 압력을 가합니다. 주사 부위에서 출혈이 없는지 확인하십시오. 지혈 패치를 적용할 필요는 없습니다.
    10. 신장을 복막강에 부드럽게 다시 넣습니다.
    11. 6-0 흡수성 봉합사로 근육층을 봉합하고 5-0 모노필라멘트 봉합사로 피부를 봉합합니다.
    12. 체액 지원을 위해 생쥐의 등에 식염수 1mL를 피하 투여합니다.
    13. 사용한 30G 바늘 끝을 새로 준비된 것으로 교체하고, 사용한 30G 바늘은 유해 화학 폐기물 관리에 대한 기관의 지침에 따라 폐기한 다음 주입 주사기 펌프를 사용하여 AAV 벡터 용액 50μL를 로드하여 다음 마우스에 투여합니다.
    14. 6.2.13단계가 필요하지 않은 마지막 마우스를 제외하고 그룹의 모든 마우스에 대해 6.2.12-6.2.13단계를 반복합니다.
    15. 계획된 모든 주사를 완료한 후 유해 화학 폐기물 관리에 대한 기관의 지침에 따라 오염된 바늘과 폴리에틸렌 튜브를 폐기하십시오.
  3. 수술 후 모니터링 및 관리
    1. RP 주사 후 24시간 및 48시간에 수술 후 진통을 위해 멜록시캄(5mg/kg)을 마우스 등에 피하 투여합니다.
    2. RP 주사 후 24시간 동안 체액 지원을 위해 생쥐 등에 식염수 1mL를 피하 투여합니다.
    3. 수술 후 1주일 동안 매일 주사된 마우스의 체중과 일반적인 모양을 모니터링합니다. 체중이 10% 감소하면 일주일 동안 주 3회 생쥐의 등에 식염수 1mL를 피하 투여합니다. 개선이 관찰되지 않으면 영향을 받은 마우스를 안락사시킵니다.

7. 조직 채취 및 냉동 절편

  1. 고정 및 냉동 보호 용액의 준비.
    1. 0.2 M 인산염 완충액(총 1 L)
      1. 1L 유리 비커에 800mL의 초순수를 준비합니다.
      2. 6.4g의 인산일염기나트륨(NaH2PO4)과 21.8g의 인산이염기성나트륨(Na2HPO4)을 용액에 첨가합니다.
      3. 염산으로 pH를 7.4로 조정합니다.
      4. 초순수를 1L까지 채웁니다.
      5. 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
    2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액(총 40mL)
      1. 16% PFA 10mL, 7.1.1단계에서 준비된 0.2M 인산염 완충액 20mL, 초순수 10mL를 혼합합니다.
      2. 10mL를 15mL 폴리프로필렌 튜브에 분취합니다.
        참고: 관류 고정에 사용하기 직전에 4% PFA 용액을 만드십시오.
    3. 30% 자당 용액(총 40mL).
      1. PBS 30mL와 자당 12g을 혼합합니다.
      2. 완전히 용해된 후 PBS를 40mL까지 채웁니다.
  2. 관류 고정 및 조직 채취.
    주의 : 관류 고정은 4% PFA 용액이 흡입될 경우 강력한 유해 화학 물질이므로 연기에서 수행해야 합니다.
    1. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 누운 자세로 놓은 후 사지를 부드럽게 꼬집어 반응성이 전혀 없는지 확인합니다.
    2. 마우스가 마취되면 수술용 가위를 사용하여 꼬리 복부에서 검상골까지 절개합니다. 그런 다음 흉골 양쪽을 따라 두 개의 측면 절개를 하고 흉벽을 앞으로 후퇴시켜 심장과 주요 혈관을 노출시킵니다.
    3. 순환계를 감압하기 위해 날카로운 해부 를 통해 우심방을 엽니다. 25G 버터플라이 바늘을 좌심실에 삽입하고 약 10mL/min의 속도로 50mL의 PBS를 주입하여 상행 대동맥 쪽으로 흐름을 유도합니다.
      참고: 혈액은 자가형광을 나타내기 때문에 고품질 면역형광(IF) 이미지를 얻으려면 피혈이 중요합니다. 혈액의 완전한 제거를 보장하기 위해 이 연구에서는 50mL의 PBS를 사용했지만 20-30mL가 일반적으로 사용됩니다.
    4. 7.1.2단계에서 준비한 4% PFA 용액 20mL를 동일한 속도로 주입하여 용액 전환 중에 공기가 유입되지 않도록 합니다.
    5. 조직을 수확하고 고정 후 위해 4% PFA 용액으로 채워진 15mL 폴리프로필렌 튜브에서 밤새 4°C에서 보관합니다. 채취한 조직에서 형광 단백질이 발현되면 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다.
  3. 냉동 임베딩
    1. 냉동 보호를 위해 7.1.3단계에서 준비된 30% 자당 용액으로 채워진 15mL 폴리프로필렌 튜브에 조직을 옮깁니다.
    2. 조직이 튜브 바닥으로 완전히 가라앉을 때까지 4°C를 유지합니다.
    3. 표준 패턴 겸자를 사용하여 조직을 플라스틱 냉동몰드로 옮깁니다.
    4. OCT 화합물을 조직 위에 놓고 조직의 방향이 올바르고 크라이오몰드 바닥과 같은 높이인지 확인합니다.
    5. 상단을 OCT 컴파운드로 채웁니다. 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.
    6. 플라스틱 크라이오몰드를 2-메틸부탄이 들어 있는 극저온 수조에 넣고 얼음통에 으깬 드라이아이스로 식힌 다음 OCT 화합물이 완전히 얼 때까지 (OCT 화합물이 흰색으로 변함).
    7. 티슈 블록은 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
  4. 냉동 절편
    1. 절편하기 전에 냉동 조직 블록을 -20°C의 극저온 고정 장치 마이크로톰으로 옮기고 냉동 조직 블록의 온도가 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
    2. cryostat 마이크로톰을 사용하여 각 냉동 조직 블록을 원하는 두께(일반적으로 5μm)로 절편합니다. 면역형광 염색을 위해 조직 절편을 현미경 유리 슬라이드에 놓습니다.
    3. 절편은 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

8. 면역형광염색

  1. 냉동 슬라이드를 실온에서 30분 동안 건조시킵니다.
  2. 액체 차단제 펜으로 절편을 분리하고 실온에서 5분 동안 건조시킵니다.
  3. 150μL의 PBS로 절편을 10분 동안 재수화합니다.
  4. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 섹션당 PBS로 희석한 1% 소 혈청 알부민(BSA) 150μL를 슬라이드에 추가합니다. 차단을 위해 실온에서 45분 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체 용액 150μL(항-윌름스 종양 1(WT1) 항체, 1% BSA로 1:100으로 희석, 항-Na-K-2Cl 공동수송체 2(NKCC2) 항체, 1% BSA로 1:100으로 희석; 또는 항-아쿠아포린 2(AQP2) 항체, 1% BSA로 1:100으로 희석)을 첨가하고 습한 챔버에서 밤새 4°C에서 배양합니다.
  6. 실온에서 PBS로 절편을 5분, 3회 세척합니다.
  7. 2차 항체 150μL(항토끼 IgG Alexa Fluor 647 항체, 1% BSA로 1:500으로 희석) 및 Lotus tetragonolobus lectin(LTL)-플루오레세인(1% BSA로 1:200으로 희석)을 넣고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
  8. 실온에서 5분 동안 PBS로 절편을 세척합니다.
  9. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 핵 염색을 위해 150μL의 Hoechst 33342(PBS로 1:10,000로 희석)를 추가합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  10. 실온에서 5분 동안 PBS로 절편을 세척합니다.
  11. 20μL의 마운팅 매체와 커버 유리로 슬라이드를 마운팅합니다. 이미징이 수행될 때까지 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.

9. 조직에서 DNA 추출

  1. 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 조직에서 DNA 추출( 재료 표 참조).
    1. 조직을 세라믹 비드 튜브로 옮기고 400μL의 DNA 추출 완충액(100mM NaCl, 20mM EDTA, 1% SDS 및 50mM Tris-HCl, pH 8.0)을 추가합니다.
    2. 균질화기를 사용하여 3주기에서 20초 동안 5m/s의 속도 설정으로 조직을 균질화합니다.
    3. 실온에서 2,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
    4. P200 피펫을 사용하여 상청액 200μL를 수집하고 10μL의 Proteinase K 용액(최종 농도 1mg/mL)을 추가합니다.
    5. 15초 동안 와돌이치어 혼합하고 55°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    6. DNA 추출 키트에서 200μL의 용해 완충액을 추가합니다.
    7. 15초 동안 소용돌이치게 혼합하고 55°C에서 15분 동안 배양합니다.
    8. 100% 에탄올 250μL를 첨가합니다.
    9. 15초 동안 와틀을 일으켜 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    10. 용해물을 DNA 추출 스핀 컬럼에 도포합니다.
    11. 실온에서 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    12. 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다. DNA 추출 키트에서 첫 번째 세척 완충액 500μL를 추가합니다.
    13. 실온에서 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    14. 스핀 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다. DNA 추출 키트에서 두 번째 세척 완충액 500μL를 추가합니다.
    15. 실온에서 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    16. 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 100% 에탄올 500μL를 첨가합니다.
    17. 실온에서 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    18. 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣고 실온에서 20,000 x g 으로 3분 동안 원심분리합니다.
      참고: 이 단계는 에탄올이 용출액으로 캐리오버되면 다운스트림 적용을 방해할 수 있으므로 스핀 컬럼 멤브레인의 완전한 건조를 보장합니다.
    19. 스핀 컬럼을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. DNA 추출 키트에서 35μL의 용출 완충액을 스핀 컬럼에 추가합니다.
      참고: 회수된 용출액의 부피는 일반적으로 컬럼에 처음 적용된 용출 완충액의 부피보다 약 5μL 적습니다.
    20. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    21. 실온에서 20,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    22. DNA 농도를 측정합니다.
  2. 정량적 PCR(qPCR)에 의한 벡터 게놈 복제 수 정량화
    1. 9.1단계에서 준비된 추출된 DNA를 분자 등급의 물로 25ng/μL의 농도로 희석합니다.
    2. 벡터 게놈 정량화를 위한 qPCR 프라이머 쌍(이 연구에서는 tdTomato가 사용됨)과 추출된 DNA 샘플에서 이배체 게놈을 정량화하는 데 사용될 마우스 참조 유전자에 대한 qPCR 프라이머 쌍을 설계합니다(마우스 아구티 유전자는 이 연구에서 사용됨).
      참고: 이 연구에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같습니다.
      td토마토 포워드: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      td토마토 리버스: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      마우스 아구티 전방: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      마우스 아구티 리버스: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. 25 μL qPCR 반응의 경우, 9.2.1단계에서 희석된 DNA 샘플 4 μL(25 μL 반응 혼합물에 총 100 ng DNA), 2x qPCR 반응 완충액 12.5 μL, 9.2.2단계에서 준비된 20 μM 순방향 및 역방향 프라이밍 0.5 μL(각 프라이머의 최종 농도 400 nM), 및 7.5μL의 분자 등급 물.
    4. qPCR을 위한 플라스미드 표준물질의 DNA 농도를 4회 측정하고 DNA 농도의 평균값을 결정합니다.
      참고: 본 연구에서는 마우스 아구티 유전자에서 유래한 PCR 표적 서열을 포함하는 슈퍼코일 원형 pAAV-CAG-td토마토 플라스미드 및 슈퍼코일 원형 플라스미드를 각각 벡터 게놈 정량화 및 정규화에 사용했습니다.
    5. 106의 동적 범위를 포괄하는 플라스미드 DNA 표준물질의 일련의 1:10 연속 희석액을 준비합니다.
      참고: 각 샘플과 표준물질은 적어도 이중으로 분석해야 합니다.
    6. 다음과 같은 열 순환 조건을 사용하여 qPCR을 수행합니다: 95°C에서 10분 동안 초기 열 활성화 단계, 95°C에서 15초 동안 35회 변성 및 60°C에서 30초 동안 어닐링/확장.
    7. qPCR 반응을 완료하고 샘플에서 벡터 게놈 및 마우스 참조 유전자의 이중 가닥(ds) 복제 수 값을 얻은 후, 벡터 게놈 및 참조 유전자 모두의 알려진 농도에서 생성된 표준 곡선을 기반으로 ds 벡터 게놈 복제 수를 각 샘플의 참조 유전자 복제 수로 정규화하여 이배체 게놈 등가물당 ds 벡터 게놈 복제 수(ds-vg/dge)를 결정합니다.
      참고: Ds-vg/dge는 100ng의 마우스 게놈 DNA가 16,900개의 이배체(2N) 마우스 세포(즉, 이배체 마우스 세포당 5.92pg의 DNA)를 나타낸다는 다음 근사치에 기초하여 결정될 수 있다.

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결과

최근 연구에서는 RP 주사 후 AAV9에 비해 신장 형질도입의 현저한 향상을 나타내는 AAV 캡시드의 작은 하위 집합을 확인했습니다38. 확인된 하위 집합은 DNA 섞음에 의해 생성된 키메라 AAV 캡시드인 AAV-KP3를 포함한다41. 따라서 본 연구에서는 AAV9를 벤치마크로 삼아 RP 주사를 위해 AAV-KP3를 선택하였다. AAV9-CAG-td토마토 벡터(AAV9) 및 AAV-KP3-CAG-td토마토 벡터(KP3)는 아데노바이러스가 없는 플라스미드 형질감염 방법으로 HEK293 세포에서 생산되었고 100kDa 분자량 컷오프 필터(CU AAV)를 사용한 CsCl 밀도 구배 초원심분리(CsCl AAV) 또는 원심 한외여과(CU)로 정제되었습니다. CsCl AAV를 제조하는 절차는 이전에 설명되어 있습니다47.

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토론

이 보고서는 마우스 신장으로의 유전자 전달을 위한 국소 투여 방법으로서 AAV 벡터의 느린 역행 RP 주사에 대해 자세히 설명했습니다. RP 주사를 안전하게 수행하기 위한 중요한 단계 중 하나는 주사된 신장의 실질 손상을 방지하기 위해 AAV 벡터의 주입 속도를 조정하는 것입니다. 유체역학적 신우 주사에 대한 이전 보고서에서 100μL의 플라스미드 DNA 용액을 단 3초이내에 마우스 신장에 주입했습니다. 이 빠른 주입은 효과적인 DNA 형질감염을 위해 일시적인 세포막 투과성을 증가시키는 데 필수적이지만 조직 손상을 초래할 수 있습니다24. 이러한 위험을 완화하기 위해 주사기 펌프를 사용하여 50μL/min의 제어된 속도로 RP 를 통해 벡터를 천천히 주입했습니다. 이 절차는 RP 주사 신장의 조직 손상을 성공적으로 예방할 수 있습니다.

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공개 사항

H.N.은 Takara Bio Inc. 및 Capsigen Inc.의 라이선스를 받은 AAV 관련 기술의 로열티를 받고, 생명공학 회사의 컨설턴트로 활동하며, Capsigen Inc.의 공동 창립자이며, Capsigen Inc. 및 Sphere Gene Therapeutics의 주식을 보유하고 있습니다.

감사의 글

AAV9의 도우미 플라스미드를 제공한 Guangping Gao와 James M. Wilson, AAV-KP3의 도우미 플라스미드를 제공한 Katja Pekrun과 Mark A. Kay에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 μm PVDF 주사 필터MilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브 Fisher Scientific05-408-129
15 mL 폴리프로필렌 튜브Corning352097
16% 파라포르말데하이드 (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL 원심 분리기 병Fisher Scientific055641S24
2F 실리콘 튜빙Sai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G 나비 바늘Medex Supply26708
2-메틸부탄MilliporeSigmaMX0760
2x qPCR 반응 버퍼Fisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G 바늘Becton-Dickinson & Co305106
50 mL 폴리프로필렌 튜브Corning430291
5-0 모노필라멘트 봉합사EthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 흡수성 봉합사EthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
단백질 겔, 10-웰, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL 튜브Millipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) 항체Abcamab199975수집관 세포 마커
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) 항체		StressMarq BiosciencesSPC-401두꺼운 상행 팔 세포
마커
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
항체		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) 항체Abcamab89901포도상세포 마커
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
폴리프로필렌, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
원심 여과 튜브MilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
세라믹 비드 튜브Fisher Scientific15-340-154
세슘 염화물Sigma-AldrichC3032-1KG
클램프 적용 포셉Fine Science Tools00071-14
폐쇄형 히트 패드Stryker Medical8002-062-012
면봉Puritan806-WC
커버 글래스Fisher Scientific12-541B
Cryostat 마이크로토미Tanner ScientificTN50
곡선 포셉Fine Science Tools11052-10
곡선형 마이크로 혈관 클립Kleinert-Kutz65145신장 동맥 및 신장
정맥 클램프
투석 카세트Fisher ScientificPIA52976
DNA 추출 키트Qiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-소르비톨Sigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
고 포도당		Corning15-013-CVDMEM-고 포도당 (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
에탄올Decon Laboratories2716GEA
태아 우 혈청 (FBS)VWR89510-186
가스 밀폐형 유리 주사기Hamilton1710 TLL
글루타르알데히드 용액Sigma-AldrichG6257
히트 테라피 펌프Kent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
균질화기Fisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
세포		Agilent240073
아이스 버킷Fisher Scientific07-210-104
주입 주사기 펌프Harvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-글루타민Fisher Scientific25030-081
액체 블로커 펜Ted Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-

참고문헌

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
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