Method Article

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

DOI:

10.3791/67716

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

Abstract

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신장으로의 유전자 전달을 위한 효과적인 생체 내 도구 및 방법의 개발은 신장 질환에 대한 기초 신장 연구 및 유전자 치료를 발전시키는 데 매우 중요합니다. 또한, 첨단 유전자 검사를 통해 단일 유전자 신장 질환에 대한 인식이 높아지면서 치료하기 어려운 유전 신장 질환을 치료하고 심지어 치료할 수 있는 유전자 치료의 잠재력이 강조되고 있습니다. 이와 관련하여 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 생체 내 유전자 전달을 위한 강력한 플랫폼으로 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 그러나 신장의 각 치료적으로 관련된 세포 유형에 대한 AAV 벡터 매개 유전자 전달을 위한 가장 효과적이고 안전한 방법은 아직 완전히 확립되지 않았습니다. 여기에서는 AAV 벡터의 느린 역행 신우(RP) 주입 방법을 자세히 설명하고, 적절하게 선택된 AAV 캡시드와 함께 사용할 때 마우스 신장을 형질도입할 수 있는 높은 잠재력이 입증됩니다. 또한, 이 방법은 표준 염화세슘 초원심분리 정제 AAV(CsCl AAV) 벡터뿐만 아니라 전문적인 AAV 벡터 전문 지식이 필요하지 않은 기술을 사용하여 빠르고 간단하게 준비할 수 있는 원심 한외여과 AAV(CU AAV) 벡터 미니프렙에도 효과적인 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 이 연구는 CsCl 및 CU AAV-KP3 벡터의 느린 RP 주입이 필연적으로 조직 손상으로 이어지는 이전에 보고된 유체역학적 접근법과 달리 명백한 조직 손상 없이 마우스 신장에서 근위 세뇨관의 강력한 형질도입을 초래한다는 것을 보여줍니다. 따라서 이 연구는 선택된 AAV 캡시드 유래 벡터의 느린 역행 RP 주입이 신장으로의 유전자 전달을 위한 효과적이고 안전한 방법임을 강조합니다. 이 방법은 유전자 치료 연구를 포함한 광범위한 신장 연구에 적용할 수 있습니다. CU AAV 벡터 미니프렙을 사용하면 처리량이 크게 증가하고 예비 데이터를 생성하고 중요한 통찰력을 얻는 데 필요한 시간 및 비용 효율성이 향상됩니다.

Introduction

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크고 작은 실험 동물에서 신장에 유전자 전달을 위한 효과적이고 안전한 방법은 기초 신장 연구를 발전시키고 혁신적인 치료 접근법을 탐색할 수 있는 중요한 기회를 제공합니다. 이러한 방법을 확립하는 것은 특히 다양한 신장 질환에 대한 유전자 치료와 관련이 있습니다. 최근 임상 유전자 검사의 발전으로 단일 유전자 신장 질환의 유병률이 이전에 추정된 것보다 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 만성 신장 질환(CKD) 환자의 약 30%에 영향을 미칩니다1. CKD는 진행성 신장 손상을 특징으로 하며, 궁극적으로 진정으로 효과적인 질병 수정 요법 없이 신부전으로 이어집니다. 혈액 투석과 신장 이식은 현재 이용 가능한 치료법입니다. 그러나 CKD 환자의 삶의 질을 크게 손상시키는 한계가 있습니다2. 따라서 유전 질환 치료에 대한 임상적으로 입증된 강력한 접근 방식인 유전자 치료는 CKD로 이어지는 유전 신장 질환을 효과적으로 치료하기 위한 새로운 방법으로 최근 몇 년 동안 큰 주목을 받고 있습니다 3,4,5,6.

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Protocol

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여기에 설명된 모든 동물 실험은 오레곤 보건 과학 대학(OHSU)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 OHSU의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 8주 된 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 아데노바이러스가 없는 플라스미드 형질감염에 의한 AAV 벡터 생산

  1. 5% 이산화탄소(CO2)가 함유된 37°C 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 믹스 및 1mM L-글루타민이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)-고포도당(4.5g/L)에서 인간 배아 신장(HEK) 293 세포를 배양합니다.
  2. -2일(형질감염 전 48시간)에, 단계 1.1에 설명된 바와 같이 40mL의 배양 배지에 T225 플라스크당 4 x 106 HEK 293 세포를 플레이트합니다. 이는 0일차에 ~95% 합류에 도달합니다.
    알림: 배양 척도는 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. AAV 미니프립....

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Results

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최근 연구에서는 RP 주사 후 AAV9에 비해 신장 형질도입의 현저한 향상을 나타내는 AAV 캡시드의 작은 하위 집합을 확인했습니다38. 확인된 하위 집합은 DNA 섞음에 의해 생성된 키메라 AAV 캡시드인 AAV-KP3를 포함한다41. 따라서 본 연구에서는 AAV9를 벤치마크로 삼아 RP 주사를 위해 AAV-KP3를 선택하였다. AAV9-CAG-td토마토 벡터(AAV9) 및 AAV-KP3-CAG-td토마토 벡터(KP3)는 아데노바이러스가 없는 플라스미드 형질감염 방법으로 HEK293 세포에서 생산되었고 100kDa 분자량 컷오프 필터(CU AAV)를 사용한 CsCl 밀도 구배 초원심분리(CsCl AAV) 또는 원심 한외여과(CU)로 정제되었습니다. CsCl AAV를 제조하는 절차는 이전에 설명되어 있습니다47.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 마우스 신장으로의 유전자 전달을 위한 국소 투여 방법으로서 AAV 벡터의 느린 역행 RP 주사에 대해 자세히 설명했습니다. RP 주사를 안전하게 수행하기 위한 중요한 단계 중 하나는 주사된 신장의 실질 손상을 방지하기 위해 AAV 벡터의 주입 속도를 조정하는 것입니다. 유체역학적 신우 주사에 대한 이전 보고서에서 100μL의 플라스미드 DNA 용액을 단 3초이내에 마우스 신장에 주입했습니다. 이 빠른 주입은 효과적인 DNA 형질감염을 위해 일시적인 세포막 투과성을 증가시키는 데 필수적이지만 조직 손상을 초래할 수 있습니다24. 이러한 위험을 완화하기 위해 주사기 펌프를 사용하여 50μL/min의 제어된 속도로 RP 를 통해 벡터를 천천히 주입했습니다. 이 절차는 RP 주사 신장의 조직 손상을 성공적으로 예방할 수 있습니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H.N.은 Takara Bio Inc. 및 Capsigen Inc.의 라이선스를 받은 AAV 관련 기술의 로열티를 받고, 생명공학 회사의 컨설턴트로 활동하며, Capsigen Inc.의 공동 창립자이며, Capsigen Inc. 및 Sphere Gene Therapeutics의 주식을 보유하고 있습니다.

Acknowledgements

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AAV9의 도우미 플라스미드를 제공한 Guangping Gao와 James M. Wilson, AAV-KP3의 도우미 플라스미드를 제공한 Katja Pekrun과 Mark A. Kay에게 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 & μ; m PVDF 주사기 필터밀리포어 시그마SLHVR33RS
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 & nbsp;피셔 사이언티브05-408-129
15 mL 폴리프로필렌 튜브코닝352097
16% 파라포름알데히드 (PFA)전자현미경 과학15710
250 mL 원심분리기 병피셔 사이언티브055641S24
2F 실리콘 튜빙사이 인퓨전 테크놀로지스실-2-50 
25G 버터플라이 바늘메덱스 공급26708
2-메틸부탄밀리포어 시그마MX0760
2개의 qPCR 반응 버퍼피셔 사이언티브43-676-59파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스
30G 바늘벡턴-디킨슨 & 코305106
50 mL 폴리프로필렌 튜브코닝430291
5-0 단섬유 봉합사에티콘Y463G
5 M NaCl론자51202
6-0 흡수성 봉합사에티콘J489G
7.5% 미니-프로테언 TGX 프리캐스트
단백질 젤, 10웰, 30 및 마이크로; L		바이오-래드4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
블롯 이미징 시스템 (Cytiva)		시티바29459405
아미콘 100 kDa MWCO, 15 mL 튜브밀리포어 시그마UFC910024
항아쿠아포린 2(AQP2) 항체앱캠AB199975덕트 세포 수집을 위한 마커
항-Na-K-2Cl 공동수송체 2
(NKCC2) 항체		스트레스마크 바이오사이언스SPC-401두꺼운 상승 사지
세포의 마커
항토끼 IgG 알렉사 플루오르 647
항체		잭슨 면역연구소111-605-144
항윌름스 종양 1(WT1) 항체앱캠AB89901족세포의 마커
벡만 쿨터 옵티실 튜브,
폴리프로필렌, 29.9 mL		피셔 사이언티브NC9691210
벡만 쿨터 옵티실 튜브피셔 사이언티브NC9611575
벤조나제시그마-올드리치1016970001
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치5470
원심 초과여과 튜브밀리포어 시그마UFC9100아미콘 100 kDa MWCO, 15 mL
세라믹 비드 튜브피셔 사이언티브15-340-154
염화세슘시그마-올드리치C3032-1KG
겸자 클램프 부착파인 사이언스 툴즈00071-14
폐쇄 루프 히트 패드스트라이커 메디컬8002-062-012
면끝 어플리케이터청교도806-WC
커버 유리피셔 사이언티브12-541B
크라이오스탯 미크토름태너 사이언티브TN50
곡선형 겸자파인 사이언스 툴즈11052-10
곡선형 마이크로 용기 클립클라이너트-쿠츠65145신장 동맥과 신장< >정맥 클램프
투석 카세트피셔 사이언티브PIA52976
DNA 추출 키트치아겐57704QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트
D-소르비톨시그마-올드리치S6021-1KG
둘벡코의 변형 이글 중간
고포도당		코닝15-013-CVDMEM 고혈당 (4.5 g/L)
EDTA피셔 사이언티브15-575-020
에탄올디콘 연구소2716GEA
태아 소 혈청(FBS)VWR89510-186
가스 밀폐 유리 주사기해밀턴1710 시간철도
글루타알데히드 용액시그마-올드리치G6257
열치료 펌프켄트 사이언티픽HTP-1500
젠장시그마 올드리치H4034-100G
호에슈트 33342인비트로젠H3570
균질기피셔 사이언티브15-340-163
인간 배아 신장(HEK) 293
세포		애질런트240073
아이스 버킷피셔 사이언티브07-210-104
주입 주사기 펌프하버드 장치70-4507
이소플루란피라말 중환자 치료NDC 66794-017-10
L-글루타민피셔 사이언티브25030-081
액체 차단 펜테드 펠라22309
로터스 테트라고놀로부스 렉틴(LTL)-
플루오레세인		벡터 연구소FL-1321-2근위 세뇨관의 마커
염화마그네슘 (MgCl2)밀리포어 시그마M1028
멜록시캄베트원NDC 86136-012-10진통제
현미경 유리 슬라이드피셔 사이언티브12-550-15
장착 매체서던바이오텍0100-01
바늘 홀더파인 사이언스 툴즈12501-13
OCT 복합물사쿠라 파인텍4583
안과 연고보쉬 & 롬NDC 24208-313-34
PE-10 폴리에틸렌 튜브BD427401내경: 0.28 mm
페니실린 & 스트렙토마이신 믹스피셔 사이언티브15140-122
인산염 완충 식염수(PBS)피셔 사이언티브10010-049
플라스틱 크라이오몰드사쿠라 파인텍4566
폴록사머 188 비이온 계면활성제
(10%)		피셔 사이언티브24-040-032
폴리에틸렌 글리콜 8000피셔 사이언티브BP233-1
폴리에틸레니민 (PEI)폴리이언스23966
포비돈 요오딘리카 케미컬 컴퍼니395516
파워 블로터와 대시; 반건식 전< 브르/> 시스템피셔 사이언티브PB0010
단백질분해효소 K 용액피셔 사이언티브25530049
토끼 항항선데노 관련 바이러스
바이러스(AAV), VP1, VP2, VP3		아메리칸 리서치 프로덕츠03-61084
사르코실피셔 사이언티브BP234-500
나사 캡 2 mL 튜브코닝 악시겐SCT-200-SS-O-S
실버 스테인 키트시그마-올드리치PROTSIL1-1KT
염화나트륨(NaCl)피셔 사이언티브S271
인산나트륨 듐 듐 디베이키< 브리> (Na2HPO4)밀리포어 시그마S0876
인산나트륨 모노베이시<브르/> (NaH2PO4)밀리포어 시그마S0751
소르비톨밀리포어 시그마S6021
표준 패턴 겸자파인 사이언스 툴즈11000-12
멸균 수술용 드레이프SAI 주입 기술PSS5-1519
직선 형 마이크로 용기 클립파인 사이언스 툴즈00396-01요관 클램프
자당피셔 사이언티브시즌 5
외과용 가위파인 사이언스 툴즈14058-09
T225 플라스크코닝431082
테크노컷 메스 #11마이코 메디컬 프로비즈 주식회사6008T-11
조직 겸자로보즈 외과 기기RS-5155

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmaco....

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