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방법 논문

면역형광에 의한 포유류 세포의 핵 블리빙 및 DNA 누출 검출

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67719

⸱

2025년 1월 17일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

이 논문에서

요약

층병증 장애는 종종 핵막의 변화를 일으켜 핵 누출 및 누출을 유발할 수 있습니다. 이 연구는 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 함께 핵 층을 시각화하는 면역형광 방법을 제시하여 포유류 세포의 핵 구조와 무결성을 평가할 수 있는 수단을 제공합니다.

초록

핵 층(nuclear lamina)은 핵막의 기저에 있는 필라멘트 네트워크로, 층판과 층류 관련 단백질로 구성됩니다. 핵 구조, 핵 기공 위치, 유전자 발현 조절, 염색질 조직, DNA 복제 및 DNA 복구에서 중요한 역할을 합니다. 라민 단백질의 발현 또는 번역 후 처리에 관여하는 유전자의 돌연변이는 층병증(laminopathies)으로 알려진 유전 질환을 유발합니다. 특히, LMNA 또는 ZMPSTE24 유전자의 돌연변이는 완전히 처리된 라민 A에는 없는 파르네실기와 메틸기를 유지하는 불완전하게 처리된 형태의 라민 A의 축적으로 이어질 수 있습니다. 이러한 불완전하게 처리된 lamin A 단백질은 성숙한 lamin A가 있는 핵 lamina 대신 내부 핵막에 국한됩니다. 잘못 국소화된 라민 단백질은 핵 기능과 구조를 심각하게 방해하여 종종 핵 기포를 유발합니다. 심한 경우 핵 파열이 발생하여 구획화가 손실되고 게놈 DNA가 세포질로 누출될 수 있습니다. 비정상적인 핵 구조 및 구획화 손실은 고정된 세포의 간접 면역형광(IF)을 통해 확인할 수 있습니다. 이 연구는 라민 단백질과 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대한 특정 항체를 사용하여 핵막과 DNA를 동시에 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 핵 구조 무결성과 핵 DNA가 세포질로 누출될 가능성을 신속하게 평가할 수 있습니다.

서론

핵 얇은 판은 핵막의 기초가 되는 필라멘트 네트워크이며 얇은 판이라고 하는 단백질로 구성됩니다. 핵층은 핵 구조, 핵공의 위치, 유전자 발현 조절, 염색질 조직, DNA 복제 및 DNA 복구에 필수적인 역할을 합니다 1,2,3. 라민 단백질의 발현에 중요한 역할을 하는 유전자의 돌연변이는 층병증(laminopathies)이라고 하는 유전적 질환을 유발한다3.

제한적 피부병증(RD)은 주로 ZMPSTE24 유전자4에 조기 종결 코돈을 생성하는 복합 이형접합 돌연변이에 의해 유발되는 심각한 층병증 질환으로, 금속프로테아제 ZMPSTE24의 부재를 초래합니다. 이 층병증은 자궁 내 성장 지연, 단단하고 경직된 피부, 작은 입, 얇은 모발, 뼈 광물화 결함을 특징으로 한다1. RD 환자는 일반적으로 폐부전으로 인해 생후 첫 주를 넘기지 못한다1. 비정형 허친슨-길포드 조로증 증후군(AT-HGPS)과 하악 이형성증 B형(MAD-B)으로 알려진 두 가지 다른 층병증 장애는 ZMPSTE24 발현 감소를 수반하고 수명 감소와 관련이 있으며 조기 노화 장애와 유사성을 보인다5. 이러한 층병증에 영향을 받는 ZMPSTE24 프로테아제는 핵 층의 중요한 구성 요소인 lamin A의 번역 후 변형에 필수적입니다. ZMPSTE24 결핍은 prelamin A2로 알려진 불완전하게 처리된 farnesylated 형태의 lamin A의 축적을 초래합니다.

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그림 1: 일반 vs. RD 세포. 정상 세포의 Lamin A 처리 경로(왼쪽)와 RD 또는 ZMPSTE 결핍 세포의 변형된 lamin A 처리(오른쪽). 파르네실(Fa) 및 메틸(Me) 그룹이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1에서 볼 수 있듯이 일반 라민 A 공정에서 파르네실(지질) 그룹이 C-말단 근처의 시스테인 잔기에 부착된 후 3개의 C 말단 아미노산의 단백질 분해 절단이 발생합니다 3,6. 그런 다음 시스테인 잔류물이 메틸화됩니다. 이 두 가지 변형은 prelamin A가 내부 핵막2를 표적으로 할 수 있도록 합니다. 그런 다음 ZMPSTE24는 farnesyl 및 methyl group과 함께 마지막 15 개의 C 말단 아미노산을 제거하여 핵 lamina 6,7,8로 전달되는 성숙한 Lamin A 단백질을 생성하는 절단 반응을 수행합니다. RD, AT-HGPS 및 MAD-B에서는 ZMPSTE24 금속단백분해효소가 부족하거나 완전히 기능하지 않기 때문에 처리의 최종 단계가 효과적으로 발생하지 않습니다 8,9. 그 결과 프레알라민 A가 축적되며, 이는 영구적으로 파르네실화되고메틸화되어 9. 이러한 후자의 그룹은 그림 1에서 볼 수 있듯이 prelamin A가 핵 lamina에 국한하는 대신 내부 핵막에 달라 붙게합니다. 따라서 ZMPSTE 결핍은 핵 구조10,11,12,13,14,15와 함께 다양한 핵 기능에 지대한 영향을 미칩니다. 이러한 핵 구조의 변화에는 핵 블리빙(nuclear blebring) 및 핵 파열(nuclear rufturing)이 포함될 수 있으며, 이로 인해 DNA가 사이토졸로 누출되고 세포질이 핵으로 유입될 수 있습니다. 비정상적인 모양의 핵은 실제로 판병증 장애의 특징이며, 결함 있는 prelamin A 처리에 의해 유발되는 수많은 다른 표현형과 함께16,17. 핵층의 결함은 핵 단백질의 품질 관리 및 핵질에서 DNA 복구 단백질의 국소화 오류를 포함하여 여러 가지 해로운 영향을 미치며, 이는 차례로 핵 기능에 수많은 결함을 초래합니다18. 층병증의 이러한 특징을 식별하고 모니터링하는 데 도움이 될 수 있는 간단한 기술을 보유하여 층병증 표현형을 개선하기 위한 치료 접근법 개발에 대한 연구를 촉진하는 것이 중요합니다. 층병증이 있는 마우스의 경우, 핵 기포의 제거는 층병증 표현형의 일반화된 제거와 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다16. 인간 세포의 핵 무결성을 모니터링할 수 있는 기술은 질병 표현형을 제거하거나 크게 개선하기 위한 잠재적 치료법에 대한 연구를 향상시킬 수 있습니다.

간접 면역형광(IF)은 1차 비표지 항체와 1차 항체를 인식하여 관심 표적을 검출하는 형광단 표지 2차 항체를 모두 사용하는 민감하고 널리 사용되는 기술입니다19. IF 방법은 특정 세포 내 구성 요소 및 구조를 시각화하기 위한 강력한 수단을 제공할 수 있습니다. 또한 하나 이상의 2차 항체 분자가 1차 항체와 상호 작용하여 신호19의 증폭을 초래할 수 있습니다. 간접 IF는 2차 항체가19종 내에서 보존된 1차 항체의 Fc 도메인에 대해 발생하기 때문에 상대적으로 적은 2차 항체 세트로 여러 1차 항체를 검출할 수 있는 다목적 기술입니다.

이 논문에서는 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 lamin B1에 대한 항체를 사용하여 DNA와 핵 층을 각각 검출하여 ZMPSTE24이 결핍된 세포의 핵 블리빙 및 DNA 누출을 평가하는 간접(IF) 방법을 설명합니다. 이 접근법의 유용성을 입증하기 위해 ZMPSTE24 발현이 넉아웃된 HeLa 세포주와 ZMPSTE24 발현하는 HeLa 세포주에 이 절차를 적용하고 두 세포주에 대한 결과를 비교했습니다.

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프로토콜

시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재료 준비

  1. 커버슬립에 셀을 도금하기 전에 최소 10개의 22mm x 22mm 정사각형 유리 커버슬립과 집게를 고압멸균합니다.

2. 솔루션 준비

  1. 보충 배지: 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린 100units/mL 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM) 500mL를 준비합니다.
  2. 항체 희석 완충액(ADB): 소 혈청 알부민(BSA) 2g과 생선 젤라틴 1g을 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 80mL에 용해시킵니다. BSA와 생선 젤라틴이 용해되면 PBS와 함께 100mL로 가져옵니다.
  3. PBS-Tween 1개(PBS-T): PBS 500mL와 트윈 0.5mL를 준비합니다. Tween이 용액에 쉽게 섞일 수 있을 때까지 37°C 수조에 넣습니다.

3. 원하는 세포 성장

참고: HeLa 세포는 이 프로토콜에서 T75 플라스크 내에서 합류하도록 성장했습니다.

  1. 6개의 커버슬립에 70% 에탄올을 뿌리고 보푸라기가 없는 물티슈로 자연 건조시킵니다. 집게를 사용하여 웰당 하나의 커버슬립을 멸균 6웰 플레이트에 커버슬립을 놓습니다.
  2. 6-well 플레이트의 각 well에 2mL의 보충된 DMEM을 추가합니다.
  3. 세포에서 배지를 흡인하고 플라스크에 PBS 15mL를 첨가하여 부드럽게 소용돌이치며 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 트립신-EDTA(트립신) 2mL를 추가합니다.
    1. 세포를 트립신으로 코팅하고 플라스크를 37°C 및 5% CO2 가습 인큐베이터에 2분 동안 다시 넣어 플라스크에서 세포가 분리되도록 합니다.
  4. 보충된 DMEM 8mL를 플라스크에 첨가하여 트립신화된 세포를 수집합니다. 응집된 세포를 분리하기 위해 몇 번 위아래로 피펫팅합니다. 플라스크에 세포 현탁액을 모아 15mL 폴리스티렌 튜브에 넣습니다.
  5. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
  6. 500,000개의 세포를 한 방울씩 6-well 플레이트의 각 커버슬립에 직접 추가합니다. 가습 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2 에서 밤새 세포가 자랄 수 있도록 합니다.

4. 세포 정착 및 투과성

  1. 사용 전에 4% 포름알데히드 용액을 신선하게 준비하십시오: 37.5% 포름알데히드 용액 2mL를 PBS 18mL에 첨가합니다. 철저히 섞는다.
  2. 투과화 용액을 사용하기 전에 신선하게 준비하십시오: 100μL의 Triton-X를 20mL의 PBS에 첨가합니다. Triton-X가 용액에 용해될 때까지 37°C 수조에서 몇 분 동안 배양합니다. 철저히 섞는다.
  3. 플레이트의 우물에서 매체를 흡입하십시오. PBS 2mL로 세포를 한 번 세척합니다. 웰에서 모든 PBS를 흡인합니다.
  4. 각 웰에 2mL의 4% 포름알데히드 용액을 추가합니다. 실온(RT)에서 10분 동안 그대로 두십시오. 웰에서 4% 포름알데히드를 완전히 흡인합니다.
  5. PBS 2mL로 세포를 3회 세척합니다. 각 세척 후 우물에서 PBS를 완전히 제거하십시오.
  6. 각 웰에 투과화 용액 2mL를 추가합니다. RT에서 10분 동안 그대로 두십시오. 투과화 용액을 완전히 흡인합니다.
  7. PBS 2mL로 세포를 3회 세척합니다. 처음 두 번 세척 후 PBS를 완전히 흡입하고 세 번째 세척 후 PBS를 웰에 남겨둡니다.
    참고: 이 단계 후 몇 주 동안 4°C의 마지막 PBS 세척에 셀을 보관할 수 있으며, 액체 증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라핀 필름으로 밀봉할 수 있습니다. 절차를 계속할 수 있는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.

5. 면역형광 염색

  1. 웰에서 모든 PBS를 제거합니다. 각 웰에 2mL의 ADB를 첨가하여 세포를 차단하고 RT에서 30분 동안 흔들어 배양합니다.
  2. 30분의 차단 시간이 끝날 무렵 1차 항체 희석액을 ADB에 혼합합니다(Lamin B1 및 dsDNA 항체 모두에 대해 1:1,000 희석, 표 1). 각 커버슬립에는 75μL가 필요하므로 6개의 커버슬립에 대해 600μL의 ADB, 0.6μL의 Lamin B 1차 항체 및 0.6μL의 dsDNA 항체를 혼합해야 합니다. 철저하게 소용돌이.
  3. 우물에서 ADB를 제거합니다. 평평한 표면에서 처리 중인 모든 커버슬립을 놓을 수 있을 만큼 충분히 큰 파라핀 필름 조각을 테이프로 감습니다.
  4. 각 커버슬립에 대해 75μL의 1차 항체 희석액을 파라핀 필름에 추가하여 ADB에 기포가 피펫으로 주입되지 않도록 합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 커버슬립 셀 쪽을 ADB 방울에 놓습니다.
  5. 웰 플레이트 뚜껑으로 배양 커버슬립을 덮고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 집게를 사용하여 파라핀 필름에서 커버슬립을 제거하고 커버슬립을 셀 면이 위를 향하도록 6웰 플레이트에 다시 넣습니다.
  7. PBS-T 2mL로 커버슬립을 3회 세척하고 매번 3-5분 동안 흔듭니다. 각 세척 후 우물에서 모든 PBS-T를 제거하십시오.
  8. 마지막 세척 중에 2차 항체 희석액을 준비합니다(두 2차 항체에 대해 1:1,000, 표 1). 각 커버슬립에는 75μL가 필요하므로 6개의 커버슬립에 대해 600μL의 ADB와 0.6μL의 2차 Alexa Fluor 태그 항체를 혼합해야 합니다. 철저하게 소용돌이. 2차 항체 희석액을 빛으로부터 최대한 덮으십시오.
항체근원회사참조
dsDNA 마커 항체 (HYB331-01)마우스 단클론 바이러스산타 크루즈사우스캐롤라이나-58749
염소 안티 마우스 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor Plus 488염소써모피셔A32723
염소 안티 마우스 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor Plus 405염소인비트로젠A31553
Lamin B1 다클론 항체토끼프로테인텍12987-1-AP 통신
염소 항토끼 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 594염소인비트로젠A11037

표 1: 항체. 이 프로토콜에 사용되는 모든 항체 목록입니다.

  1. 마지막 세탁에서 모든 PBS-T를 제거합니다. 5단계에서와 같이 파라핀 필름의 2차 항체 희석액에서 커버슬립을 RT에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계와 나머지 모든 단계를 위해 빛으로부터 보호하십시오. 작은 상자를 사용하여 빛을 차단할 수 있습니다. 우물에서 용액을 추가하거나 제거해야 할 때 신속하게 작업하십시오.
  2. 집게를 사용하여 파라핀 필름에서 커버슬립을 제거하고 셀 면이 위로 향하게 하여 커버슬립을 6웰 플레이트에 다시 놓습니다.
  3. PBS-T 2mL로 커버슬립을 3회 세척합니다. 각 세척 후 우물에서 모든 PBS-T를 제거하십시오.
  4. 에탄올 시리즈(70%, 90%, 100%)로 슬라이드를 탈수합니다. 각 웰에 70% 에탄올 2mL를 추가하는 것으로 시작합니다. 1-2분 동안 그대로 두고 우물에서 모든 에탄올을 제거합니다. 나머지 에탄올 백분율로 반복합니다.tages.
  5. 집게를 사용하여 우물에서 커버 슬립을 제거하고 보푸라기가 없는 물티슈에 빛으로부터 보호되어 자연 건조시킵니다.
  6. 커버슬립당 20μL의 장착 매체를 사용하여 커버슬립의 셀 면을 유리 현미경 슬라이드에 아래로 향하게 장착합니다. 밤새 말리고 빛으로부터 보호하십시오.

6. 이미지 획득

  1. 이미징하기 전에 커버슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 얇게 코팅하십시오(모든 브랜드 또는 유형으로 충분함). 빛으로부터 보호하여 자연 건조하십시오.
    알림: 현미경을 사용하여 이미지화하는 지침은 사용하는 현미경에 따라 다릅니다. 여기에 사용된 현미경의 카메라 해상도는 1280 x 960 픽셀입니다. 비슷하거나 더 나은 해상도로 충분합니다.
  2. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓기 전에 파일 저장 설정을 조정해야 합니다. 현미경을 켜고 USB 드라이브를 삽입합니다. 현미경 설정 내에서 저장 설정을 조정하고 모든 채널(GFP 및 RFP)이 별도로 저장되고 이미지가 USB 드라이브의 올바른 위치로 이동하는지 확인합니다.
    참고: USB 드라이브에 폴더를 만들고 나중에 참조할 수 있도록 각 커버슬립에 고유한 이름을 지정합니다.
  3. 이미징하기 전에 보푸라기가 없는 물티슈에 70% 에탄올을 뿌리고 슬라이드 뒷면을 부드럽게 닦아냅니다. 슬라이드 전면을 부드럽게 청소하여 최소한의 압력이 가해지도록 합니다.
  4. 커버슬립이 아래를 향하도록 현미경에 깨끗한 슬라이드를 놓습니다. 라이트 쉴드 박스로 덮습니다.
  5. 40x 대물 렌즈를 사용하여 적절한 채널(여기에 사용된 lamin B1 항체에 대한 RFP)을 사용하여 현미경 화면에서 핵을 찾습니다. 시작하려면 광도를 약 50%로 조정합니다.
  6. 과포화된 영역을 확인하려면 색상 끄기 옵션을 선택하고 흑백 설정에서 커버슬립 전체에 빨간색 신호가 있는 영역이 없는지 확인합니다. 적색 신호가 많으면 최소한의 적색 신호가 표시될 때까지 광도를 낮추십시오.
    알림: 빨간색 신호는 과포화를 나타냅니다. 핵이 거의 보이지 않는 것처럼 보이면 과포화 없이 적절한 강도가 될 때까지 강도를 10% 증가시킵니다.
  7. 동일한 강도로 다른 모든 커버슬립을 확인하여 과포화되지 않았는지 확인하십시오. 위와 동일한 프로세스를 사용하여 다른 채널의 모든 커버슬립을 확인합니다(여기에 사용된 dsDNA 항체의 경우 GFP).
  8. 각 채널의 광도를 기록합니다. 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 각 채널의 모든 광 강도가 일정하게 유지되도록 합니다.
  9. 각 커버슬립을 개별적으로 이미지화합니다. 첫 번째 채널부터 시작하여 핵에 초점을 맞추고 이미지를 캡처합니다.
  10. 채널을 조심스럽게 전환하고 세포에 다시 초점을 맞춥니다. 초점이 맞으면 이미지를 캡처합니다.
  11. 필요한 채널(GFP 및 RFP)에서 이미지를 캡처한 후 오버레이 를 선택하여 병합된 이미지를 관찰하고 이미지를 촬영할 때 슬라이드가 움직이지 않았는지 확인합니다. 채널이 겹치지 않으면 이미지가 정렬될 때까지 필요한 채널을 다시 실행합니다.
  12. 플래시 드라이브 아이콘을 클릭하여 이미지를 저장합니다. 이미징을 계속하려면 커버슬립의 다른 위치로 이동합니다.
    참고: 동일한 영역이 반복적으로 캡처되지 않도록 매번 커버슬립의 다른 영역이 이미지화되었는지 확인하십시오. 커버슬립의 왼쪽 상단 모서리에서 이미징을 시작하고 "S" 패턴으로 이동하여 중복 없이 완전한 커버리지를 보장하는 것이 좋습니다.

7. 데이터 분석

  1. 이 방법으로 얻은 데이터는 시각적입니다. 이미지에서 DNA 누출 또는 핵 폭발의 징후가 있는지 검사합니다. 블리빙 및 누출의 예는 대표적인 결과 섹션에 나와 있습니다.

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결과

본 연구에서는 이중가닥 DNA(double-stranded DNA)와 함께 핵층을 시각화하는 IF 방법을 소개합니다. IF가 수행되면 캡처된 이미지를 검사하여 핵 블리빙 및 DNA 누출의 징후를 확인할 수 있습니다.

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그림 2: HeLa CT 및 ZMPSTE24 KO 세포 의 핵 블리빙.blebbed nuclei의 빈도를 결정하는 데 사용되는 두 세포주의 대표 이미지. (A) 적색(Alexa Fluor 594 conjugate...

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토론

제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있으며, 가장 중요한 것은 1차 및 2차 항체로 고정된 세포를 처리하는 것입니다. 사용된 현미경 범위 내에서 형광단을 함유한 올바른 2차 항체와 함께 관심 표적에 대해 우수한 품질의 1차 항체를 사용하면 최적의 결과를 얻을 수 있습니다19. 항체의 품질은 결함 있는 항체가 비특이적 표적과 상호 작용하거나 관심 표적을 인식하지 못할 수 있기 때문에 이 기술의 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다19,20. 또한, 신호가 거의 또는 전혀 없는 경우, 1차 및 2차 항체의 희석을 조정하여 백그라운드에서 충분한 신호가 검출되도록 해야 하며, 신호19,20을 과포화시키지 않도록 ...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 ASW에 대한 National Institute on Aging 보조금 R03AG064525의 지원을 받았습니다. 기술 멘토링에 도움을 주신 Jason A. Stewart 박사와 사용된 현미경을 제공해 주신 Hui Chen 실험실에 감사드립니다. 또한 이러한 실험에 사용된 HeLa 세포주에 대해 Fabio Martinon에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
22mm 사각형 유리 커버슬립프로퍼 제조 회사M8710표준 현미경 슬라이드에 고정할 수 있다면 어떤 크기나 모양이든 사용할 수 있습니다.
36.5% 포름알데히드시그마 AldrichF8775고정 시약. 
75cm 2 플라스크Corning430725U세포 배양용. 
소 혈청 알비눔 (BSA)Fisher Scientific9048-46-8항체 희석 완충액. 
1 g/L 포도당, L-글루타민 & 피루브산나트륨이 함유된 DMEMCorning10-014-CV세포 배양용. 
에탄올 (200 Proof)Decon Laboratories2701장착 전 샘플의 탈수를 위해 여러 농도를 만들기 위해 희석합니다. 
EVOS FL 디지털 반전 형광 현미경Fisher Scientific12-563-460이미징. 
Fish GelatinSigma AldrichG7041항체 희석 완충액. 
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01광표백을 방지하기 위한 장착 매체. 
파라필름 (4인치)Fisher Scientific13-374-12사용되는 커버슬립이 맞을 수 있다면 어떤 크기든지 대체할 수 있습니다. 
페니실린-스트렙토마이신Gibco15-140-122세포 배양용. 
인산염 완충 식염수(PBS)N/AN/A조직 배양 및 용액을 위해 실험실에서 제조 및 멸균되었습니다.
프리미엄 태아 소 세럼 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150세포 배양용. 
Superfrost 프리미엄 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-544-7모든 표준 현미경 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 
조직 배양 처리된 6-웰 플랫 바텀 플레이트Falcon353046세포 배양을 위해. 
TritonX-100써모피셔 사이언티픽A16046. AP세탁용.
트립신-EDTA (0.5%)Gibco15-400-054세포 배양용 
Tween 20Fisher Scientific9005-64-5세포 투과 시약. 

참고문헌

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