간질의 예기치 않은 돌연사(SUDEP)의 메커니즘은 이해가 부족하고 현재 모델에서 해석하기 어렵습니다. 형질전환 토끼는 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리는 사망으로 이어질 수 있는 심각한 사건을 평가하기 위해 형질전환 토끼 키트에서 장기적이고 지속적인 뇌파 및 심전도 기록 방법을 설명합니다.
방법 논문
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간질의 예기치 않은 돌연사(SUDEP)의 메커니즘은 이해가 부족하고 현재 모델에서 해석하기 어렵습니다. 형질전환 토끼는 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리는 사망으로 이어질 수 있는 심각한 사건을 평가하기 위해 형질전환 토끼 키트에서 장기적이고 지속적인 뇌파 및 심전도 기록 방법을 설명합니다.
이온 채널 유전자의 병원성 변이체는 간질의 높은 돌연사(SUDEP)와 관련이 있습니다. SUDEP의 기전은 잘 알려져 있지 않지만, 발작 외에도 자율신경 기능 장애 및 심장 부정맥이 포함될 수 있습니다. 일부 이온 채널 유전자는 뇌와 심장 모두에서 발현되어 간질 및 심장 부정맥과 관련된 이온 채널 병증이 있는 환자에서 SUDEP의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 간질 변이체를 발현하는 형질전환 토끼는 SUDEP의 복잡한 생리학을 연구하기 위한 전체 유기체를 제공합니다. 중요한 것은 토끼가 쥐 모델보다 인간의 심장 생리학을 더 밀접하게 복제한다는 것입니다. 그러나 토끼 모델은 침습적 모니터링 절차를 거칠 때 추가적인 건강 및 마취 고려 사항이 있습니다. 당사는 신생아 토끼 키트에 장기 동시 뇌파(EEG) 및 심전도(ECG) 모니터링을 위한 원격 측정 장치를 외과적으로 이식하는 새로운 방법을 개발했습니다. 여기에서는 P14(체중 범위 175-250g) 키트에 원격 측정 장치를 이식하는 수술 방법을 시연하고 수술 접근 방식, 적절한 마취 및 모니터링, 수술 후 관리에 세심한 주의를 기울여 합병증 발생률을 낮추는 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 유전적 또는 후천성 간질의 토끼 모델에서 심장 부정맥, 발작 및 잠재적 SUDEP의 발병의 중요한 시점 동안 신경 및 심장 전기 생리학을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다.
간질로 인한 예기치 않은 돌연사(SUDEP)는 간질 환자의 주요 사망 원인입니다. SUDEP의 기전은 잘 알려져 있지 않지만, 발작 외에도 자율신경 기능 장애, 무호흡증, 심장 부정맥 등이 있을 수 있다 1,2,3,4,5,6,7. 채널병증 관련 유전성 간질이 있는 환자는 SUDEP 발병률이 가장 높습니다. 예를 들어, SUDEP는 생후 1년에 발병하는 유전적 간질인 드라벳 증후군(Dravet syndrome)의 원인이 되는 유전자인 전위의존성 나트륨 채널 유전자 SCN1A8의 변이를 가진 환자의 최대 20%에서 발생합니다. 많은 간질 관련 이온 채널 유전자가 뇌와 심장 모두에서 발현되며, 실험실 및 임상 데이터에 따르면 채널병증 관련 유전 간질환자에서 심장 부정맥이 존재할 수 있으며, 7, 9,10,11,12 발작으로 인한 치명적인 심장 부정맥 또는 발작 및 부정맥의 동시 발생으로 인해 SUDEP의 위험이 증가할 수 있습니다. 실험실 환경에서 SUDEP를 평가하는 데는 많은 어려움이 있습니다. 심장의 관점에서 볼 때, 생쥐의 심장 활동 전위는 인간과 매우 다르며13 인간 iPSC-심장 근세포 모델14은 전체 유기체의 복잡성을 복제할 수 없습니다. 유전적 간질의 형질전환 토끼 모델은 토끼 심장 생리학이 인간의 심장 생리학을 더 밀접하게 복제하기 때문에 SUDEP를 연구하기 위한 이상적인 시스템을 제공합니다 13,15 동시에 복잡한 병태 생리학을 연구하기 위한 전체 유기체를 제공합니다. SUDEP는 첫 번째 발작이 일어날수록 발생할 수 있으므로, 발작과 심장 부정맥의 발병을 이해하는 것은 초기부터 이러한 동물 모델을 평가하는 것이 필수적입니다. 신생아 기간 동안의 비디오 녹화는 토끼 새끼가 아직 둥지에 있는 경우가 많기 때문에 어렵습니다. 키트가 댐에 있는 동안에는 기존 유선 시스템을 사용한 연속 뇌파(EEG) 또는 심전도(ECG) 기록이 불가능합니다. 간헐적 기록은 SUDEP와 관련된 드문 터미널 이벤트를 캡처하지 않을 수 있습니다. 따라서 우리는 토끼 키트에서 장기적이고 연속적인 동시 EEG 및 ECG 기록을 제공하기 위해 무선 이식형 원격 측정 모니터링으로 전환했습니다.
이 프로토콜의 성공 열쇠는 이러한 취약한 동물에 대한 적절한 마취 및 수술 후 지원입니다. 토끼는 독특한 해부학적, 생리학적 특성으로 인해 개와 고양이(0.17%-0.24%)에 비해 마취로 인한 사망 위험(1.39%-4.8%)이 훨씬 높다16,17. 이러한 마취 위험 증가의 주요 원인으로는 차선의 기도 관리와 급성 수술 후 합병증이 있습니다. 토끼의 삽관이 어려운 데는 혀가 넓고 길고 좁은 입, 입과 후두 사이의 예각, 후두개의 등쪽 변위, 후두 외상에 대한 감수성 증가, 후두 경련 경향 증가 등 여러 요인이 있습니다 18,19,20. 즉각적인 마취 에피소드 후 토끼는 생명을 위협하는 위장 정체 증후군에 걸릴 위험이 있습니다. 이것은 복잡하고 복합적인 문제이며, 마취는 어떤 이유로든 (완화되지 않는 통증, 메스꺼움 등) 시술 후 위 운동을 억제하는 직접적인 약물 효과 및/또는 이차성 거식증을 통해 기여하는 것으로 가정됩니다.21.
토끼 신생아와 유아의 독특한 생리학은 마취 및 수술과 관련된 문제를 복잡하게 만듭니다. 토끼는 생리적 항상성과 특별한 해부학적 고려 사항에 대한 덜 발달된 메커니즘을 가지고 태어났습니다. 대부분의 상용 제품은 네덜란드 벨트 및 뉴질랜드 화이트 크로스 토끼 키트의 작은 혈관 크기, 높은 안정시 심박수 및 색소 피부에 최적화되어 있지 않기 때문에 정맥 주사 및 모니터링이 어렵습니다. 신생아에서 심박출량은 본질적으로 심박수에 의존하며22 일반적으로 신장 또는 간 경로를 통한 약물 제거가 성인에 비해 감소하기 때문에23 적절한 약물 선택 및 복용량에 대한 고려가 중요합니다. 토끼의 마취 사망의 주요 원인은 호흡 억제와 무호흡증에 이차적으로 발생하는 것으로 생각됩니다. 모든 토끼에서 이미 논의된 기도 관리 문제 외에도, 신생아는 저산소혈증과 고탄산증에 직면하여 호흡 욕구가 저하되어 이미 어려운 마취 측면을 더욱 위험하게 만듭니다24.
이 프로토콜에서는 수술 및 마취 생존율이 높은 간질의 신생아 토끼 모델에서 EEG 및 ECG 원격 측정 임플란트(그림 1)에 대한 성공적인 방법을 설명합니다. 이 정보를 통해 다른 연구자들은 간질, 심장 부정맥 및 관련 신경 발달 장애에 대한 연구를 진전시키기 위해 까다로운 신생아 토끼 모델을 해결할 수 있습니다.
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설명된 모든 작업은 승인된 동물 사용 프로토콜의 일부로 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했으며 USDA 동물 복지법 및 NIH 공중 보건 서비스 정책을 포함한 관련 연방법 및 지침을 준수합니다. University of Michigan은 AAALACi 인증 기관입니다.
1. 동물 준비
2. 수술 준비(그림 2)
3. 복부에 임플란트 배치
4. ECG 리드의 배치
5. 등쪽 표면의 준비
6. EEG 리드의 배치
7. 마취 회복
8. 수술 후 관리 및 모니터링
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이 프로젝트의 성공적인 결과를 위해서는 임플란트 절차 및 기록 프로토콜에서 여러 매개변수를 개발해야 했습니다. 16마리의 토끼 키트에 대해 임플란트 수술이 시도되거나 시행되었으며 14마리가 성공적으로 생존했습니다. 그 중 12명은 실험 종점까지 생존했습니다. 수술 중 또는 수술 후 사망의 원인은 실험 종점을 달성하는 데 향후 성공할 수 있도록 하는 절차 수정과 함께 표 1에 강조 표시되어 있습니다. 가장 흔한 수술 합병증은 호흡 억제였으며, 이는 저산소증과 서맥으로 이어졌습니다. 이 프로토콜은 2개의 맥박 산소 측정기와 도플러 모니터를 포함한 여러 모니터링 방식을 포함하도록 수정되었습니다. 이를 통해 수술 절차 중에 하나의 모니터가 고장나거나 헐거워지는 경우 백업 모니터링이 가능합니다. 또한 토끼의 피부 색소는 맥박 산소 측정의 신뢰성을 떨어뜨릴 수 있으므로 신체의 여러 지점에서 모니터링해야 합니다. 유도 및 회복은 일반적으로 마취의 가장 위험한 기간으로 간주되지만, 우리는 시술 전반에 걸쳐 다른 ...
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마취 유도, 모니터링 및 지원에 대해 설명된 프로토콜은 외과적 접근 방식 및 용이성에 대한 연구 요구 사항과 수의학 치료의 황금 표준의 균형을 맞춥니다. 실험실에서 설명된 프로토콜을 표준 절차로 채택하기 전에 등쪽 피하 임플란트 배치, 기관내 튜브 또는 후두 마스크 기도 사용, 심박수 모니터링을 위한 식도 청진기 부착물 사용을 포함하여 몇 가지 다른 잠재적인 개선 사항이 시험되었습니다. 그러나 결국 여러 가지 이유로 모든 것이 버려졌습니다. 원격 측정 배치를 위한 충분한 피하 공간이 있지만, 원격 측정 본체 및 와이어 출구 설계로 인한 데드 스페이스를 닫을 수 없음, 동물 성장을 위해 와이어의 위치 지정 및 코일링의 어려움, ECG를 고정하기 위해 필요한 수술 중 2번의 위치 변경으로 인해 수술 시간이 크게 길어지고 불필요한 물류 문제가 추가되었습니다. 또한, 마스크 마취제의 사용은 일반적으로 권장되지 않지만, 적절한 크기의 LMA가 부족하고 배치 후 기관내관을 고정하...
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저자들은 NIH R61NS130070가 LLI에 자금을 지원한 것에 대해 감사하고 있습니다.
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