Calendula officinalis L.의 성장 및 꽃 발달 중 플라보노이드 함량.

약용 식물의 2차 대사 산물에 대한 관심이 높아지는 것은 제약, 치료, 화장품 및 기타 산업에서의 다양한 응용 분야에 의해 주도됩니다. 그 중 금잔화(Calendula officinalis L.)는^{지중해 지역1} 이 원산지인 국화과(Asteraceae)의 한해살이 초본 식물로, 전 세계적으로 널리 재배되고 있으며, 관상용, 의약용, 산업용, 조리용^{2 등 다양한} 용도의 꽃으로 인해 인정을 받고 있다. 현재 영국은 세계 최대의 C. officinalis³ 생산국입니다.

꽃 머리는 플라보노이드, 카로티노이드, 테르페노이드, 에센셜 오일, 탄닌, 쿠마린, 탄수화물 및 지방산 3,4,5,6과 같은 생체 활성 화합물을 함유하고 있기 때문에 이 식물에서 가장 많이 활용되는 기관입니다. 이러한 천연 화합물은 항염증, 항산화, 항균 및 상처 치유 효과를 포함한 약리학적 특성에 기여합니다⁷. 역사적으로 일반적으로 냄비 금잔화로 알려진 C. officinalis는 아유르베다와 동종요법과 같은 전통 의학 시스템에서 피부 상처와 위장 장애에서 생리 불순 및 염증성 질환에 이르기까지 다양한 질병을 완화하는 데 사용되어 왔다⁸. 현대의 응용 분야는 제약, 식품 및 화장품 산업으로 확장되며, 금잔화 추출물은 크림, 세럼, 팅크 및 약물 전달 시스템에 통합됩니다⁹. 광범위한 연구에도 불구하고 C. officinalis의 치료 잠재력을 완전히 활용하는 데는 여전히 어려움이 있습니다. 환경 및 재배 요인으로 인한 생체 활성 화합물 농도의 가변성은 표준화된 추출 및 제형 공정의 필요성을 강조합니다. 플라보노이드의 생물학적 활성과 식물 조직에서의 식별은 품질 관리의 필수적인 측면입니다^10,11.

멕시코에서는 냄비 금잔화 재배가 성장 과정과 꽃 발달에 대한 자세한 이해 없이 이루어지는 경우가 많아 생리학적 성능, 수확량 및 생체 활성 화합물과 농업 요인 간의 상관 관계가 제한됩니다. 식물 조직에서 플라보노이드의 농도와 분포는 성장 및 재배 조건의 영향을 받으므로 이 종의 생리학적 및 발달 과정을 연구하는 것이 중요합니다.

이 연구는 주요 꽃 발달 사건을 식별하기 위해 C. officinalis의 식물 및 생식 기관에서 바이오매스 분포 및 싱크-소스 관계를 분석하고, 여기에서 제안된 미세 분광 광도법을 통해 꽃 머리의 총 플라보노이드 농도를 정량화하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구 결과는 농업 관행을 최적화하고 이 식물에서 파생된 제품의 품질을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

1. 일반 재료 및 방법

1. 꽃의 시작을 감지하기 위한 현장 실험
   1. 필드 조건에서 실험을 설정합니다. 153m2의 면적에 걸쳐 금잔화 묘목을 이식하고 평방 미터당 식물의 심기 밀도를 가지며 60cm 간격을 둡니다.
   2. 16/8000 게이지로 국부적인 점적 관개 시스템 구축 참고: 이 실험에 사용된 종자 로트는 단일 유전자형에서 수확된 다음 이전의 세 가지 재배 주기에 걸쳐 대량 선택 육종 방법으로 선택되었습니다. 온화한 기후의 경우 파종 시기는 봄철에 가장 좋으며 묘목이 준비되면 약 2개월 후에 이식하는 것이 가장 좋습니다. 관개는 일주일에 한 번 권장됩니다. 해충과 질병을 피해야 하며, 작물의 필요에 따라 농업 관리를 수행해야 합니다.
2. 이식 후 14일부터 격일로 선택한 식물에서 샘플을 수집합니다. 꽃차례 primordium 출현 날짜를 결정하기 위해 입체 현미경 (약 40X)에서 정점 분열체를 찾으십시오.
   참고: 샘플의 절반 이상에서 꽃 분열체(FM)가 나타나면 이 날짜를 FM의 적절한 나이로 기록할 수 있습니다. 꽃의 시작을 관찰하기 위한 실험 단위는 단일 식물에 5개의 분열체가 있고 8개의 복제(식물)가 있었습니다. 성장 및 화훼 발달 분석
   1. 꽃봉오리가 열릴 때 정점 capitulum을 수집합니다.
      참고: 결찰 꽃이 보이는지 확인하십시오.
   2. 마지막 7개의 꽃 단계 동안 꽃 기관 채취를 수행한다¹² (그림 1).
      참고 : 이 실험에서는 각 현상 학적 단계에서 8 개의 다른 식물에서 5 개의 capitulums가 사용되었습니다. 모든 경우에, 꽃은 식물의 정점 부분에서 수집되었습니다.
   3. 생물학적 주기를 통해 6회에 걸쳐 전체 식물을 샘플링합니다.
   4. 수집된 샘플을 48시간 동안 건조시킵니다. 식물 및 생식 기관의 건조 중량을 측정합니다.
      알림: 공기 순환 오븐에서 40°C에서 건조하는 것이 좋습니다.
   5. 식물생기관과 생식기관 모두에 대한 싱크 강도(Sink Strength, SS)와 싱크 활동(Sink Activity, SA)을 계산한다¹³.
      참고: SS 및 SA의 경우 각각 절대 성장률(AGR) 및 상대 성장률(RGR)에 해당하는 공식을 사용합니다.
   6. 스프레드시트를 사용하여 성장 곡선을 그립니다.

2. 총 플라보노이드의 정량화¹⁴

1. 식물 재료를 40°C의 강제 공기 오븐에서 48시간 동안 건조시킵니다.
2. 건조된 재료를 종이 봉지에 보관하십시오. 실온(RT)에서 어두운 곳에 보관하십시오.
3. 액체 질소를 사용하여 식물 재료를 얼려 분쇄를 준비합니다.
4. 균일한 질감이 될 때까지 도자기 모르타르에서 얼어붙은 재료를 갈아냅니다.
   알림: 액체 질소는 식물 재료와 접촉하면 튀를 수 있으므로 취급할 때 주의하십시오.
5. 시료 준비: 각 시료에서 25mg의 미분된 건조 물질의 무게를 잰다. 500μL의 80% 메탄올을 추가합니다.
6. 플라보노이드 추출 : 혼합물을 70 °C의 초음파에서 1 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 731g 에서 13분¹⁵초 동안 원심분리합니다.
7. 부분 표본 준비: 얻어진 추출물 150μL를 취하고 80% 메탄올 37μL를 첨가합니다.
8. 추출물 50μL, 100μL 10% 염화알루미늄 및 100μL 1M 아세트산 칼륨을 혼합합니다. 증류수를 넣어 총 부피를 5mL로 만듭니다.
9. 용액을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
10. . 분광 광도계를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정했습니다.
11. 검량선 생성: 2.7mg의 퀘르세틴을 80% 메탄올 10mL에 용해시켜 원액을 준비합니다. 이 재고에서 50, 100,175, 250 및 350μL 범위의 5가지 퀘르세틴 용액을 준비하고 10mL로 희석합니다.
12. 보정 샘플 준비: 각 퀘르세틴 용액(500μL)에 대해 100μL 10% 염화알루미늄과 100μL 1M 칼륨 아세테이트, 80% 메탄올 1.5mL 및 증류수 2.8mL를 추가합니다.
13. 용액을 실온에서 40분 동안 그대로 두십시오.
14. 분광 광도계로 415 nm에서 교정 샘플의 흡광도를 측정합니다. 흡광도 값을 기록하여 검량선을 구성합니다.
    참고: 광선 꽃, 관형 꽃 및 전체 꽃 머리의 총 플라보노이드 농도를 비교하십시오. 이 실험은 처리당 5회 반복하는 완전히 무작위 실험 설계를 사용했습니다. 반응 변수는 플라보노이드의 농도였습니다. 치료 수단은 Tukey 테스트와 비교되었습니다(SAS Institute, 2003).

C. officinalis의 성장은 식물과 그 기관 전체에 걸쳐 S자 바이오매스 축적 역학을 나타냈습니다. 이 관찰은 일관되게 S자 성장 곡선을 보여주는 다른 저자의 보고서와 일치합니다. 공중 기관 중 줄기가 가장 많은 바이오매스를 축적했습니다(그림 3). 모든 공중 기관의 초기 성장은 느렸으며, 개화와 새싹 발달은 41일째에 시작되었다. 이 식물은 69일째에 최대 바이오매스에 도달했으며 식물당 평균 76g에 도달했습니다.

주요 식물의 장기에 대한 sink Sink Strength(SS)의 동역학 거동은 수분부터 이식 후 최대 77일까지 평가되었습니다(그림 3). 결과는 꽃 머리가 발달하는 동안 식물 기관(뿌리, 줄기, 잎)이 계속 자라는 것을 보여줍니다. 따라서 식물 기관과 생식 기관 사이에 영양분에 대한 경쟁이 있었습니다. 식물 기관은 꽃 머리보다 훨씬 더 높은 SS를 보여주었습니다. 식물기관은 50일째에 최대 SS(2.2g/일)에 도달한 반면, 생식기관은 62일째에 가장 높은 성장률(0.64g/일)에 도달했다.
화분 금잔화 식물과 그 기관(그림 4)의 상대 성장률(RGR)은 작물이 성숙함에 따라 감소했습니다. 이러한 감소는 식물의 분열 조직의 비례적 감소에 기인합니다. 가장 빠른 성장률(0.137g/g/일)을 보인 생식기관에서 48일째에 최대 RGR 값이 관찰된 반면, 식물기관은 훨씬 이른 21일째에 가장 빠른 성장률(0.16g/g/일)을 보였습니다. 생식 기관은 44일째 이후에야 식물 기관을 능가할 수 있었다. 이날부터 식물은 잎을 생성하기 위한 분열 활동을 점진적으로 줄이면서 생식 분열 분열의 활동을 증가시켰습니다.

꽃 개시는 분열체가 식물성(잎만 생산)에서 생식(꽃 머리로 발전할 꽃 원시성 형성)으로의 전환을 나타냅니다. 형태학적으로 이러한 전이는 빠르게 발생하며 작은 돔 모양의 식물 정점에서 작은 측면 돌출부가 있는 더 크고 뾰족한 생식 정점으로의 변화에 의해 현미경으로 시각적으로 식별할 수 있습니다16. 이러한 분화는 양봉의 조직학적, 생리학적, 생화학적 변화를 수반한다17.

꽃 머리가 의약 및 장식용으로 수확되는 주요 기관인 화분 금잔화 식물의 경우, 멕시코의 중앙 고산 계곡에서 자랄 때 이식 후 5주에 꽃이 피기 시작했습니다(표 1).

총 플라보노이드 농도(케르세틴 등가물로 표현됨)의 차이는 꽃 발달 단계에서 감지되었습니다. 가장 높은 함량은 8 단계와 11 단계 사이에서 관찰되었으며, 꽃받침이 분리 된 새싹에서 꽃 머리가 완전히 열린 것에 해당합니다. 이러한 연구 결과는 치료 목적으로 금잔화 꽃머리를 수확하는 것은 플라보노이드 함량을 최대화하기 위해 이 단계에서 수행되어야 함을 시사합니다. 초기 단계(꽃받침이 결합된 새싹) 또는 후기 단계(노화 꽃머리)에서 플라보노이드 농도는 완전히 열린 꽃머리에 비해 22%에서 27% 낮았습니다.

식물당 플라보노이드 생산량을 고려할 때(표 2), 7단계와 8단계는 꽃 머리에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 산출했습니다. 이 정보는 플라보노이드의 최대 수율뿐만 아니라 정교한 식물 의약품을 위한 표준화를 용이하게 하기 때문에 상업용 냄비 금잔화 생산에 중요합니다.
그림 1: 금잔화의 꽃 발달 단계. 이 그림은 일반적으로 냄비 금잔화로 알려진 Calendula officinalis L.의 꽃 발달 단계를 보여줍니다. 그것은 초기 새싹 단계에서 꽃 머리의 노화 및 과일 (achene) 형성의 시작까지의 진행을 시각적으로 표현합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 달력의 바이오매스 분포 동역학. 이 그림은 시간이 지남에 따라 서로 다른 식물 기관 간에 바이오매스가 어떻게 할당되는지 보여주며, 줄기, 잎, 꽃, 뿌리와 같은 식물의 다양한 부분에서 바이오매스 축적의 변화를 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 주기에 걸쳐 금잔화에서 식물 및 생식 기관의 싱크 강도 역학(SS). 이 그림은 식물의 수명 주기의 시작부터 끝까지 줄기, 잎, 꽃과 같은 식물 기관 간에 싱크 강도가 어떻게 변하는지 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 주기에 따른 금잔화의 식물 및 생식 기관에서 싱크 활동(SA)의 동역학. 이 그림은 자원 수요와 관련된 활동 수준이 줄기, 잎 및 꽃과 같은 다양한 식물 부분에 대해 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 보여줍니다. 그것은 식물이 초기 성장 단계에서 성숙 및 생식 발달로 이동하는 것을 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 카렌듈라의 꽃 발달 중 총 플라보노이드 농도(건조 물질의 mg/g). 이 그림은 서로 다른 발달 단계에서 금잔화 꽃의 건조 물질에 존재하는 플라보노이드의 양을 보여줍니다. 이 메트릭은 꽃이 성숙함에 따라 플라보노이드 함량이 어떻게 진화하는지 배우는 데 도움이 됩니다. 결과는 Tukey의 HSD 검정(p > 0.05) n=5로 비교한 평균입니다. 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 다른 문자는 상당한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 금잔화에서 꽃이 자라는 현상의 순서. 이 표는 금잔화에서 꽃의 발달 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 초기 새싹 형성부터 만개 및 과일(수과) 발달까지의 단계를 설명합니다. *결과는 평균 ± 표준 오차(n = 5)로 표시됩니다. 분산 분석에 따르면 처리 간에 유의한 차이가 있었다(p ≤ 0.05). 다른 문자는 Tukey 평균 테스트( α = 0.05, n = 5) 간에 상당한 차이를 나타냅니다. ND: 감지되지 않습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 꽃 발달 전반에 걸쳐 금잔화 꽃 머리의 총 플라보노이드 함량. 이 표는 플라보노이드 농도가 초기 새싹 형성에서 만개 및 과일(수과) 발달까지 어떻게 변하는지 보여줍니다. 이 데이터는 플라보노이드 함량을 수확하고 최대화하기 위한 최적의 단계를 강조합니다. 플라보노이드 생산량(g/식물) = [꽃기관의 건조 중량(g/식물) × 플라보노이드 농도(mg/g) 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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