우리는 구조화된 조명 현미경에서 형광 쌍극자를 실시간으로 관찰할 수 있는 오픈 소스 Micro-Manager 플러그인을 개발했습니다. 플러그인은 2D 및 3D 쌍극자 방향 관찰을 모두 지원합니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 편광 현미경(FPM)은 형광단의 위치와 쌍극자 방향을 이미지화할 수 있습니다. 초고해상도 형광 편광 현미경 검사법의 성과에도 불구하고 획득 후 분석에 대한 의존도는 실시간 관찰을 방해합니다. 편광 구조 조명 현미경(pSIM)은 빠른 이미징 속도로 형광 쌍극자의 초고해상도 이미징을 제공하며 라이브 셀 응용 분야에 적합합니다. 우리는 편광 이미지의 실시간 재구성과 형광 쌍극자의 표시를 위한 오픈 소스 구현을 개발했습니다. 또한 3D 방향 매핑(3DOM)을 달성하기 위해 이 방법을 확장하여 복잡한 생물학 연구에 대한 유용성을 확대했습니다. 또한 편광 이미징에서 기존 SIM 현미경을 확장하는 방법에 대한 자세한 소개를 제시하고 현미경을 제어하기 위한 Micro-Manager 2.0의 자세한 구성 가이드를 제공하여 편광 이미징을 실시간으로 미리 볼 수 있도록 했습니다. 또한 pSIM과 3DOM을 모두 포함하는 전체 재구성을 위한 MATLAB 코드를 제공했습니다. 이 포괄적인 가이드는 초보자가 작업을 빠르게 마스터하고 쉽게 시작할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다.
서론
형광 편광 현미경(FPM)은 형광단의 위치와 쌍극자 방향을 동시에 이미징하는 강력한 기술로 부상하여 생물학적 이미징에 대한 심오한 통찰력을 제공합니다 1,2. FPM은 생체 분자의 방향 관찰을 용이하게 함으로써 액틴 3,4,5, 미세소관5, 셉틴6, DNA 필라멘트 7-9, 핵공 복합체10 및 막 단백질11과 같은 거대 분자의 복잡한 배열을 밝힙니다. 고속, 비침습적 및 라이브 셀 호환 기능을 통해 높은 시간 분해능11,12로 분자 회전 역학을 추적할 수 있습니다.....
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프로토콜
1. 편광 이미징을 위한 기존 구조화 조명 현미경 확장
- SIM 현미경을 준비합니다.
참고: 우리는 독자가 현미경 설정에 대한 특정 기초를 가지고 있으며 이미 구조화 광학 현미경을 소유하고 있다고 가정합니다. 관련 경험이 부족한 경우 SIM 현미경16을 구축하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하는 이 문서를 참조하십시오. "HWP+WQP+LCVR"의 편광 제어 장치는 pSIM work5 또는 pizza half wave plate17의 피자 와류 파동 플레이트로 교체할 수 있습니다. - SLM(spatial light modulator)에 서로 다른 패턴을 로드하여 세 스트라이프 방향의 편광 소광비를 측정합니다. 대물렌즈 바로 뒤에 편광판을 놓고 회전시키고 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. pSIM의 경우 파동판을 회전하여 소광비 10> 세 방향의 S-편광을 유지합니다.
- 3DOM의 경우 HWP2를 회전하여 6개 방향의 p-편광을 유지합니다. SIM 공간 마스크를 3DOM 공간 마스크로 교체하여 6개 방향의....
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결과
pSIM 방법은 s-편광 레이저 빔을 사용한 간섭을 기반으로 SIM 현미경에서 수행할 수 있습니다. S-편광 간섭은 가장 널리 사용되는 SIM 유형이며 고대비 조명 스트립을 생성합니다. 현미경 설정의 아카데믹 프로토타입은 pSIM5의 원래 작업에 포함되어 있습니다. 그림 1에서 간략하게 소개된 SLM(spatial light modulator)은 ±1 차수의 회절 빔을 생성하고 피자 반파 플레이트는 3방향의 S-편광을 유지합니다. 다른 SIM 대안은 격자를 사용하여 회절 빔을 생성하거나 다른 편광 변조 방법을 사용하여 s-편광을 유지할 수 있지만, 이러한 현미경은 편광 이미징을 위해 확장할 수도 있습니다.
3DOM 현미경은 두 가지 차이점이 있는 유사한 광학 이미징 시.......
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토론
이 연구에서는 pSIM과 3DOM의 두 가지 편광 이미징 기술을 실시간으로 미리 볼 수 있는 플러그인을 개발했습니다. 두 기술 모두 기존 SIM 시스템에서 약간의 수정으로 수행할 수 있습니다. pSIM 및 3DOM 현미경을 설치하고 Micro-Manager를 설정하여 현미경을 제어하고 실시간 편광 결과를 얻는 방법을 시연하는 자세한 단계를 제공했습니다. 실험 결과에는 pSIM으로 이미징된 액틴 필라멘트와 3DOM으로 이미징된 λ-DNA가 포함됩니다. phalloidin 쌍극자의 방향은 actin 필라멘트의 방향과 대략 평행한 반면, STOYOX Orange fluorophores의 방향은 DNA 축에 수직입니다. 구조화 조명 현미경 검사는 또한 골지체, 미세소관 네트워크(microtubule network) 18 및 소포체(endoplasmic reticulum) 19의 높은 시공간 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFC3401100)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100nm 형광 구슬 | Invitrogen | F8801 | |
| 4% 포름알데히드 용액 | Invitrogen | R37814 | |
| 카메라 | 투센 | Dhyana 400BSI V3 | https://www.tucsen.com/download-software/ |
| 의치 기본 재료(유형 I 열 경화형, 액체)New | Century Dental | N/A | |
| Dulbecco' 의 변형된 독수리' s Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Eclipse TE2000 도립 현미경 | Nikon | TE2000 E | |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 10099141C | |
| MATLAB R2019b | MathWorks | 버전 R2019b | |
| https://ww2.mathworks.cn/downloads/ MetroCon V4.0 | Kopin | 버전 4.0 | 공간 광 변조기 소프트웨어 |
| 마이크로 매니저 2.0 | μ &뮤; anager | 버전 2.0 | 다운로드 Micro-Manager 최신 릴리즈 |
| MS-2000 XYZ Automated Stage | Applied Scientific Instrumentation | MIM3 | https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/ |
| myDAQ | National Instruments | 781325-01 | 소프트웨어 및 드라이버 다운로드 - NI |
| OBIS 561 nm LS 20 mW Laser | Coherent | 1325777 | |
| Phalloidin-AF568 | Invitrogen | A12380 | |
| 인산 완충 식염수 | Corning | 21-040-CV | |
| 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 | Solarbio | M9810 | |
| ProLong Diamond | Invitrogen | P36980 | |
| 공간 광 변조기 | Kopin | SXGA-12 | |
| SYTOX 오렌지 핵산 염색 | 인비트로젠 | S11368 | |
| 트리톤 X-100 | 인비트로젠 | HFH10 | |
| 트립신 | 깁코 | 25200056 | |
| λ-DNA | 인비트로젠 | S11368 |
참고문헌
- Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
- Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....
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