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방법 논문

미세 입자상 물질에 노출된 제브라피시 배아에서 다환 방향족 탄화수소를 검출하기 위한 변형된 QuEChERS-HPLC 방법

1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

2025년 6월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

당사는 제브라피시 배아에서 16 PAH의 내부 수준을 평가하기 위해 수정된 QuEChERS-HPLC 방법을 개발했습니다.

초록

공기역학적 직경이 2.5μm 이하인 미세먼지(PM2.5)에 대한 산모의 노출은 인간의 자연 유산 및 다양한 선천성 질환과 관련이 있습니다. 그러나 근본적인 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 제브라피시 배아는 PM2.5 의 발달 독성을 연구하는 데 널리 사용되지만 PM2.5의 주요 독성 성분인 다환 방향족 탄화수소(PAH)의 내부 수준을 측정하는 것은 어려운 일입니다. 이 연구에서는 미국 환경보호국(EPA) 우선 오염 물질 목록에 등재된 16개 PAH의 내부 수준을 평가하기 위해 QuEChERS-HPLC(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) 고성능 액체 크로마토그래피(QuEChERS-HPLC) 방법을 개발했습니다. 제브라피시 배아를 수정 후 2-72시간 동안에 PM2.5 로부터 추출 가능한 유기물(EOM)로 처리하였다. 시료 전처리에는 QuEChERS 분석법이 사용되었고, PAH의 정성 및 정량 분석에는 HPLC-FLD/DAD(형광 검출기 및 다이오드 어레이 검출기가 있는 HPLC)가 사용되었습니다. PM2.5에 노출된 제브라피시 배아에서 6개의 PAH(Phenanthrene, Anthracene, Fluorene, Acenaphthene, Fluoranthene, Pyrene)를 성공적으로 검출했습니다. 이 방법은 PM2.5 유도 발달 독성의 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다.

서론

공기역학적 직경이 2.5μm 이하인 미세 입자상 물질(PM2.5). 주요 환경 위험 요소입니다. PM2.5는 크기가 작기 때문에 순환계에 들어가 모체-태아 장벽을 통과할 수 있습니다. 역학 연구는 산모가 PM2.5에 노출되는 것을 자연 유산 및 다양한 선천성 질환과 연관시켰다 1,2,3,4. 그러나 PM2.5의 배아 독성의 기본 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. PM2.5의 주요 독성 성분인 PAH는 돌연변이 유발 및 발암 특성으로 인해 인간에게 매우 독성이 높습니다 5,6. 수백 개의 PAH 중 16개는 미국 환경 보호국(EPA)에 의해 우선 순위가 높은 오염 물질로 지정되었습니다.

제브라피쉬(Danio rerio)는 인간과의 유전적 유사성, 빠른 발달, 높은 번식률 및 유지 관리 용이성으로 인해 강력한 척추동물 모델 유기체입니다. 제브라피시 배아의 투명성으로 인해 현미경으로 전신을 직접 관찰할 수 있어 상세한 연구가 가능합니다. 용해된 PAH는 확산7에 의해 제브라피시 배아에 들어갈 수 있습니다. 많은 연구에서 제브라피시 배아를 사용하여 PM2.5의 추출물 유기물(EOM)의 독성 효과와 메커니즘을 조사했습니다 8,9,10,11. 그러나 이러한 연구의 대부분은 EOM에서 16개의 우선 순위 PAH만 특성화했으며, 제브라피시 배아12에서 PAH의 내부 수준을 검출하지 못했습니다. 이러한 어려움은 제브라피시 배아의 크기가 작고 배아 기질의 복잡성 때문일 수 있습니다.

QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) 분석법은 식품 및 환경 시료의 잔류 농약, 동물용 의약품 및 기타 오염 물질을 분석하는 데 사용되는 혁신적인 시료 전처리 기법입니다13,14. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 결합할 경우 이 방법은 제브라피시15에서 살충제를 검출하는 데 사용되었습니다. 두 개 이상의 벤젠 고리를 포함하는 PAH는 강력한 형광 특성을 가지고 있어 형광 검출기를 사용한 검출에 특히 적합합니다. 이 연구에서는 EOM에 노출된 제브라피시 배아의 16개 PAH 수준을 평가하기 위해 수정된 QuEChERS-HPLC 방법을 개발했습니다.

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프로토콜

1. 샘플 처리

  1. PM2.5 컬렉션
    1. 47mm 석영 멤브레인 필터에서 PM2.5 를 수집합니다.
      참고: PM2.5 는 중국 쑤저우 시내에서 수집되었습니다.
  2. EOM 추출
    1. 필터를 조각으로 자르고 150mL의 아세토니트릴이 든 원뿔형 유리 플라스크에 넣습니다.
    2. 플라스크를 35°C에서 1시간 동안 초음파화하고 추출물을 4개의 50mL 튜브로 옮깁니다.
    3. 7,000 × g 에서 20분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 회전 증발기로 옮기고 약 5mL로 농축합니다.
    4. 35°C 수조에서 질소 흐름으로 건조될 때까지 증발하고 잔류물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시킵니다.
  3. 제브라피시 배아 처리
    1. 제브라피시를 28°C에서 14시간 조명과 10시간 어두운 주기로 재순환 수계에 유지합니다16.
    2. 수정란(그룹당 200개의 배아)을 모아 재순환 급수 시스템에서 30mL의 물과 함께 유리 페트리 접시(소다석회 유리, 80 x 15mm)로 옮깁니다.
    3. 수정 2시간 후(hpf)에 200개의 배아가 들어 있는 유리 페트리 접시에 30μL의 EOM(10mg/mL)을 추가합니다. 처리되지 않은 그룹은 빈 컨트롤 역할을 합니다.
      참고: EOM의 최종 농도는 심장 기형 비율에 따라 10mg/L입니다(보충 그림 S1).
    4. 접시를 28 ° C 인큐베이터에 넣으십시오.

2. QuEChERS 시료 전처리

  1. 인큐베이터에서 72hpf 속도의 배아가 있는 접시를 꺼냅니다. 배아를 순수한 물로 3번 씻습니다.
  2. 배아를 1.5mL 튜브(다른 그룹에 따라)로 옮기고 과도한 물을 제거합니다.
  3. 튜브를 -80°C 냉동고에 30분 동안 넣어 배아17 을 동결건조하고 동결건조합니다. 그런 다음 유리 막대를 사용하여 배아를 갈아줍니다.
  4. 스파이크 회수를 테스트하기 위해 DMSO 대조군에 25μL의 16PAH 혼합 표준 용액(2.0μg/mL)을 추가합니다.
  5. 1mL의 n-헥산과 볼텍스를 30초 동안 첨가한 다음 35°C에서 30분 동안 초음파처리합니다.
  6. 7,000 ×g에서 5 분 동안 원 심분리기를 가열하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
  7. 2.5단계와 2.6단계를 반복합니다.
  8. 수집된 상등액을 35°C 수조에서 질소 흐름으로 건조되도록 증발시킵니다.
  9. 아세토니트릴 1mL를 넣고 30초 동안 와동을 일으킵니다.
  10. 10mg의 1차 2차 아민(PSA), 45mg의 황산마그네슘, 15mg의 C18 패킹을 추가한 다음 30초 동안 와류를 추가합니다.
  11. 7,000 ×g에서 5 분 동안 원 심분리기를 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
  12. 2.9단계를 반복하고 7,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
  13. 질소 하에서 상등액을 0.5mL로 증발시킵니다.
  14. 0.22μm 미세 다공성 멤브레인을 통해 필터링합니다.

3. HPLC를 사용한 PAH 측정

  1. 아세토니트릴과 16 PAH 혼합 표준물질에 대한 일련의 작업 용액(1 - 500ng/mL 범위)을 준비하고 아세토니트릴/물을 이동상으로 사용하여 액체 크로마토그래프에 주입합니다.
    1. 20 μL를 주입하고 다음 용출 절차를 사용하십시오 : 0-18.5 분, 40 % 아세토 니트릴에서 100 % 아세토 니트릴로; 18.5-28분, 100% 아세토니트릴; 28-29.5 분, 100 %에서 40 % 아세토 니트릴; 정지 시간: 32분; 컬럼 온도: 25 °C; 유속: 1.8mL/분 x축에 표준 작업 용액의 질량 농도가 있고 y축에 해당 피크 면적이 있는 표준 곡선을 5ng/mL에서 500ng/mL 범위까지 포함하는 표준 곡선을 그릴 수 있습니다.
      참고: PAH의 여기/방출 파장은 보충 표 S1에서 확인할 수 있습니다.
  2. 정제된 샘플(단계 2.14)을 형광 검출기(FLD) 및 다이오드 어레이 검출기(DAD)를 사용하여 액체 크로마토그래프에 주입합니다.
  3. 머무름 시간을 비교하여 PAH의 존재를 식별하고 관련 피크 면적을 측정합니다.
    참고: PAH의 질량 농도는 3.1.1단계에서 이전에 생성된 표준 곡선을 사용하여 측정되었습니다.
  4. 시료의 측정된 질량 농도를 기준으로 16 PAH의 내부 농도를 계산합니다.

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결과

EOM 노출, 시료 전처리 및 PAH 검출에 대한 전체 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. HPLC-FLU/DAD의 경우 0.3 - 5.0ng/mL의 검출 범위에서 3:1의 신호 대 잡음비가 허용 가능한 것으로 간주되었습니다. 검출 방법의 한계는 3.0 × 10-4 에서 5.0 × 10-3 ng/organism 사이였습니다. 모든 검량선은 높은 선형성(r2 > 0.999)을 나타냈습니다. 매트릭스 샘플에서 얻은 추출물을 사용하여 측정된 정밀도 값은 5% 미만이었습니다. 급증한 회복률은 82.0%에서 96.3% 사이였습니다(표 1).

표 2 및 보충 그림 S2에서 볼 수 있듯이, 6개의 PAH, 즉 페난트렌(Phenanthrene, Phe), 안트라센(Anthracene, ...

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토론

제브라피시 배아는 발달 독성 연구를 위한 강력한 척추동물 모델이지만, 크기가 작아 PAH와 같은 반휘발성 유기 화합물(SVOC)의 검출이 복잡합니다. 시료 전처리 중에는 제브라피시 배아의 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 샘플의 적절한 세척은 노출 매체에서 샘플 추출물로 화합물이 전달되는 것을 방지하기 위한 핵심 단계입니다. 불완전한 세척은 과대 평가로 이어질 수 있으며, 과도한 세척은 배아 내부의 물질 손실을 유발하여 과소 평가로 이어질 수 있습니다. PAH 추출 중에는 제브라피시 배아에서 발생하는 물과 불순물을 제거해야 합니다.

탈수를 위해 규조토 또는 무수 황산나트륨이 일반적으로 사용됩니다. 그러나 규조토와 무수 황산나트륨 모두에서 미량의 PAH가 검출되었으며 브랜드 간에 약간의 차이가 있었습니다. 따라서 이러한 재료는 사용하기 전에 최소 2시간 동안 450°C에서 구워야 합니다. 샘플을 건조하기 위해 편리한 저온...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 보조금 번호: 81972999)과 쑤저우 과학기술발전계획(Suzhou Science and Technology Development Plan, Basic Research on Medical Applications, SKY2023036 및 SKY2023115)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16 PAH 혼합 표준 용액 o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)110124-0616 PAH 혼합 표준 용액  나프탈렌(Nap), 아세나프틸렌(Acy), 아에이스-나프텐(Ace), 플루오렌(Flo), 페난트렌(Phe), 안트라센(Ant), 플루오란텐(Flu), 피렌(Pyr), 벤조[a] 안트라센(BaA), 크리센(Chr), 벤조[b]플루오란텐(BbF), 벤조[k] 플루오란텐(BkF), 벤조[a] 피렌(BaP), 인데노[1,2,3-cd] 피렌(IcdP), 디벤츠[a, h]안트라센(DahA), 벤조[g,h,i]페릴렌(BghiP).
1260 Infinity II LC 시스템애질런트 테크놀로지스(미국FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
아세토니트릴Scharlab (바르셀로나, 스페인)AC03661000용매
CNWBOND HC-C18 SPE  ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CHINA)SBEQ-CA0801C18 패킹은 친수성과 소수성 사이의 균형이 좋은 역상 패킹으로 극성 및 비극성 유기 화합물을 잘 흡착하고 분리할 수 있습니다.
규조토Agilent Technologies, Inc(미국 산타클라라)12214013유기 불순물의 분리, 정제 및 제거용‌
분산형 SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056샘플 정제
필터ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)SCAA-104유기상 니들 필터 (나일론), 0.22µ m
HexaneScharlab(스페인 바르셀로나)HE02481000용매
MilliporeMerck(미국 뉴저지)초순수 제조
유기 - N-EVAP 질소 증발기유기 (미국 매사추세츠)용매 증발
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific(미국 월섬)심분리
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York, USA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918이 컬럼은 일반적으로 HPLC 시스템에서 PAH를 정확하고 신뢰할 수 있게 분석하는 데 사용됩니다.
산타클라라)원

참고문헌

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