방법 논문

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

DOI:

10.3791/67759

⸱

2025년 3월 7일

 ,  , 
1Department of Applied Biomedical Science, Faculty of Health Sciences, University of Malta, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta, 3Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 수정 후 3-7일 후에 제브라피시 유충에 대한 약물 스크리닝 절차와 형태학적 평가를 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제브라피시는 인간 중개 연구, 소분자 및 환경 오염 물질의 독성 테스트, 치료 약물 발견 및 기타 생물 의학 연구 응용 분야에서 저명한 모델 유기체가 되었습니다. 제시된 프로토콜은 초기 단계의 제브라피시 유충(수정 후 3-7일, dpf)의 약물 스크리닝 및 독성 테스트에 대한 명확한 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다. 제브라피시 유충의 독성 테스트를 설명하는 여러 방법론이 발표되었지만, 노출 기간, 배지 변화 속도 및 형태 점수 등에 대한 표준화된 프로토콜이 부족합니다. 우리는 실험을 수행하기 위한 이상적인 유충 연령, 해당 연령에 가장 적합한 플레이트 크기, 테스트 화합물의 낭비를 제한하면서 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 배지 변화율, 통계적 방식으로 쉽게 정량화할 수 있는 형태학 채점 시스템을 실험적으로 결정했습니다. 이 원고는 3-7 dpf 사이의 제브라피시 유충에 대한 독성 테스트 프로토콜을 자세히 설명하고 있으며, 약물 독성 테스트의 격차를 목표로 하고 어류 배아 급성 독성 테스트와 유사한 표준화된 방법을 향한 첫 번째 단계를 밟는 것을 목표로 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제브라피시(Danio rerio)는 최근 강력한 척추동물 모델 유기체로 부상하여 생물의학 연구를 발전시키기 위한 연구에서 점점 더 인기를 얻고 있습니다1. 인간 단백질 코딩 유전자의 약 70%는 적어도 하나의 제브라피시 ortholog를 가지고 있으며, 인간 질병을 유발하는 유전자의 ~82%는 제브라피시2에서 적어도 하나의 상동 유전자를 가지고 있습니다. 유사한 기본 장기 패턴 및 형태와 결합된 유전자 보존은 제브라피시를 인간 질병 연구를 위한 흥미로운 모델로 만들어 약물 개발에 중요한 분자 수준 1,2,3에서 종 간 비교를 가능하게 합니다.

제브라피쉬는 수정 후 10시간(hpf)에서 꼬리 새싹이 형성되고 16hpf에서 첫 번째 소마이트가 나타나면서 빠르게 발달합니다. 배아는 수정 후 ~2-3일(dpf)에 융모막에서 나옵니다. 4 dpf가 되면 소화관이 완전히 발달하고 5 dpf가 되면 부레가 팽창하여 자유롭게 수영하고 먹이를 사냥할 수 있습니다. 5 dpf까지 먹이를 줄 수 있는 능력에도 불구하고, 먹이를 먹지 않은 유충은 최소 7 dpf까지 난황 유래 영양소만으로 생존할 수 있어 오염을 유발하고 약물 검사, 독성학 및 행동 검사를 방해할 수 있는 외부 먹이의 필요성을 피할 수 있습니다4. 7 dpf까지 유충은 또한 심장과 혈관 구조, 근육 및 뼈를 포함한 몇 가지 기초적인 장기 시스템을 가진 완전한 신체 계획을 개발합니다 5,6. 또한 제브라피시 배아는 체외에서 수정되어 외부에서 발달하며, 생애 초기 단계에서 광학적으로 투명하여 유전자 편집 및 소분자 스크리닝에 쉽게 접근할 수 있습니다3. 또한 크기가 작고 생산율이 높기 때문에 더 많은 복제물을 포함할 수 있어 통계적 검정력이 높아질 뿐만 아니라 멀티웰 플레이트를 사용할 수 있어 약물 부피를 절약하고 처리량을 늘릴 수 있습니다.

동물 모델에서 새로운 소분자를 스크리닝하는 것은 유익한 효과 또는 부작용을 모두 생성하는 약물의 능력을 결정하는 데 중요하며, 따라서 추가 테스트에 실행 가능한 화합물과 활성을 변경하기 위해 수정이 필요할 수 있는 화합물을 식별하는 데 중요합니다. 약물 스크리닝 과정의 일환으로 표적 화합물의 치사 농도 50(LC50)을 식별해야 합니다. 이는 예비 독성 테스트의 일환으로 실험 동물의 50%에서 사망을 유발하는 작업 농도를 제공합니다.

수정 후 최대 96시간(hpf)까지의 제브라피시 배아의 독성 테스트를 위한 표준화된 프로토콜, 즉 어류 배아 급성 독성(FET) 테스트(TG236)7가 있습니다. FET 테스트에서 새로 수정된 난자는 최대 96시간 동안 5가지 농도의 화학 물질에 노출되고 치사율의 징후, 즉 (i) 난자 응고, (ii) 소마이트 형성 부족, (iii) 난황낭에서 꼬리 새싹 분리 부족 및 (iv) 심장 박동 부족. 이 테스트를 통해 급성 독성 및 LC50을 측정할 수 있습니다. 또한 스크리닝(24웰 플레이트), 테스트 챔버 내 계란 분포, 하우징 조건 등에 사용할 테스트 챔버 크기에 대해 조언하여 유효하고 재현 가능한 결과를 보장합니다7.

FET 테스트는 배아 단계에서 독성 테스트에 적합하지만 4dpf를 넘지 않습니다. 이 시점쯤에서 발생하기 시작하는 표현형(예: notochord6의 광물화)의 경우, 약물 스크리닝은 이러한 조직의 형태학적 평가를 가능하게 하기 위해 4 dpf 이상으로 진행되어야 합니다. 또한, 관심 표현형이 발생하기 최소 하루 전에 약물 노출을 시작할 것을 권장합니다. 우리가 아는 한, 초기 단계의 제브라피시 유충, 특히 3에서 7dpf 사이의 제브라피쉬에서 약물 스크리닝을 위한 FET와 유사한 표준화된 프로토콜은 존재하지 않습니다. 4 dpf를 초과하는 제브라피시 유충의 약물 실험에 대한 여러 연구가 발표되었지만, 테스트 챔버의 크기, 생물학적 및 기술적 복제 수, 배지 변화 속도, 노출 기간 및 평가된 형태학적 결함 8,9,10,11,12,13을 포함하여 사용된 방법론에는 일관성이 부족합니다 . 이러한 이유로 우리는 표준화된 독성 테스트를 위한 검증된 프로토콜을 개발한 후 3-7 dpf에서 제브라피시 유충의 형태학적 변화를 육안으로 관찰했습니다. 제안된 프로토콜은 이후 행동 분석, 유전자 발현 프로파일링 및 조직형태 측정법과 같은 다른 다운스트림 표현형 분석에 활용될 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제브라피쉬는 EU 지침 2010/63/EU에 따라 취급되었습니다. 모든 실험은 몰타 대학교의 FREC(Faculty Research Ethics Committee)와 JFARSS(Joint FREC Animal Research Sectoral Subcommittee)의 승인을 받았습니다. 제안된 프로토콜의 순서도는 그림 1에서 찾을 수 있습니다.

1. 난자 생산, 채취 및 유지 관리

  1. 그 전날, 마지막 먹이를 먹은 지 적어도 한 시간 후에 물고기를 번식 탱크에 설치하고 수컷과 암컷을 분리하는 칸막이를 설치하십시오. 더 나은 난자 생산 결과를 얻으려면 암컷과 수컷의 비율을 더 높게 사용하십시오. 14시간 10분 라이트/다크 사이클이 있고 주변 온도가 27-28°C인 방에 물고기를 놓습니다.
    참고: 1L 번식 탱크에는 성인 물고기 3마리를 수용할 수 있는 반면 1.7L 번식 탱크에는 성인 물고기 5마리를 수용할 수 있습니다.
  2. 다음날 아침, 빛이 시작되면 번식 탱크의 물을 교체하고 칸막이를 제거하십시오. 번식 탱크가 쉽게 기울어지지 않는 경우 짝짓기를 촉진하기 위해 얕은 물을 사용할 수 있도록 경사진 위치에 놓으십시오. 알 생산 및 짝짓기 활동이 느린 경우 45분마다 번식 탱크의 물을 교체하십시오. 최대 3시간 동안 또는 필요에 따라 물고기가 짝짓기를 하도록 두십시오.
  3. 짝짓기가 완료되면 난자를 낳지 않은 암컷을 부드럽게 짜서 장기적인 난자 결합을 방지합니다. 물고기를 각각의 수조에 다시 넣으십시오.
  4. 메쉬 여과기를 사용하여 번식 탱크에 있는 알을 모으고 배아 물(E3)로 헹구고 E3가 있는 페트리 접시에 넣습니다. E3를 준비하려면 16.67mL의 60x E3(300mM NaCl, 10mM KCl, 20mM CaCl2.2H 2O, 20mM MgSO4.7H 2O)를 0.01% 메틸렌 블루 1mL 및 982mL의 탈이온수와 혼합합니다. 수정되지 않은 난자나 찌꺼기를 제거하십시오. 50mm x 100mm 페트리 접시당 계란 15개, 150mm x 15mm 페트리 접시당 120개의 계란으로 페트리 접시가 붐비지 않는지 확인하십시오.
  5. 알을 28.5°C로 설정하고 14시간 10분 주야간 주기가 있는 인큐베이터에 보관하십시오. 1dpf에서 E3를 새로 고치고 생존 불가능한 난자를 제거하여 곰팡이 성장을 제한합니다.

2. 시험판 준비

  1. 3 dpf에서 100 μL 부피로 설정된 1,000 μL 마이크로피펫을 사용하여 건강해 보이는 부화한 배아 1개를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
    참고: 부화하지 않은 배아는 다양한 화합물 흡수를 초래할 수 있으므로 사용해서는 안 됩니다. 건강해 보이는 배아를 사용하는 것도 테스트 중 편향을 제한합니다. 피펫 팁의 크기로 인해 물리적 손상 없이 제브라피시 배아를 쉽게 채취할 수 있습니다. 또한, 마이크로피펫은 이송 피펫과 달리 웰로 분배되는 부피를 더 잘 제어할 수 있습니다.
  2. 12웰 플레이트에서 별도의 웰(여기서는 100μM에서 6.25μM의 농도 범위에서 Bosutinib)에서 각 테스트 화학 물질에 대해 원하는 농도를 준비합니다. 각 웰에 마이크로피펫을 사용하여 필요한 양의 테스트 화학 물질을 추가하고 E3를 사용하여 최대 2.4mL를 만듭니다.
    알림: 관련 테스트 화학 물질에 사용할 적절한 농도를 결정하기 위해 문헌 검색을 수행해야 합니다. 사용할 수 있는 정보가 없는 경우 적절한 농도 범위가 결정될 때까지 여러 농도를 시험할 수 있습니다. 최소 5가지 농도를 사용해야 하며, 가장 높은 농도는 100% 폐사를 유발하고 가장 낮은 농도는 관찰할 수 있는 영향을 미치지 않는다7.
  3. 원료 시험 화학물질을 용해시키는 데 사용되는 용매에 따라 차량 제어 장치를 준비합니다.
    참고: 많은 테스트 화합물은 수용성이 아니므로 수용액을 생성하기 위해 에탄올 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 특정 용매("비히클")에 용해해야 합니다. DMSO는 차량 제어로 사용될 때 1%의 농도를 초과하지 않아야 하며, 이는 제브라피시14에서 안전한 것으로 밝혀진 농도입니다.
  4. 200μL 마이크로피펫을 사용하여 96웰 플레이트에 있는 E3 용액을 제거하고 테스트 중인 해당 배지 100μL로 교체합니다. 농도당 총 24마리의 유충을 테스트하십시오. 단일 또는 8채널 200μL 마이크로피펫을 사용하여 테스트 화학물질을 해당 테스트 플레이트 웰로 옮깁니다. 대조군(예: E3, 화학 비행체, 포지티브 대조군 등)을 포함합니다.
    참고: 플레이트 설정은 최대 4개의 서로 다른 테스트 화학 물질 또는 동일한 화학 물질의 4가지 다른 농도를 수용합니다. 대조군과 함께 동일한 화학 물질(예: Bosutinib)의 5가지 농도를 조사하기 위해 설정된 테스트 플레이트의 예가 그림 1에 나와 있습니다.
  5. 노출 후 24시간 이내에 형태학적 스코어링(섹션 3에 설명된 대로)과 절반 매체 변경을 수행하여 50μL의 배지를 제거하고 새로 준비된 배지로 교체합니다. 그 과정에서 죽은 유충을 제거하고 기록하십시오. 유충을 28.5 ° C로 설정하고 14 시간 : 10 시간 낮 / 밤 주기가 장착 된 인큐베이터에 보관하십시오. 7dpf까지 이 과정을 반복합니다.

3. 형태학적 평가

  1. 실체 현미경을 사용하여 적절한 배율로 개별 테스트 유충을 관찰합니다.
    참고: 평가할 수 있는 형태학적 결함의 예는 표 1에 나와 있습니다.
  2. 두 명의 독립적인 채점자가 형태를 평가하고, 두 채점자 사이에 의견이 일치하지 않는 경우 세 번째 채점자와 상의합니다.
  3. 이진 방법(즉, 존재/부재)을 사용하여 형태학에 점수를 매기며, 여기서 '없음'은 정규 형태학('0'으로 점수가 매겨짐)을 나타내고 '현재'는 형태학적 이상이 있음을 나타냅니다('1'로 점수가 매겨짐). 그림 2 는 약물 노출 2일 후 5dpf의 제브라피쉬의 예를 보여주며, 여기에는 영향을 받지 않은 제브라피쉬(그림 2A), 경미한 심낭 부종이 있는 제브라피시(그림 2B), 난황 출혈 및 난황 확장을 동반한 중증 심낭 부종(그림 2C), 색소 침착 감소로 인한 발달 지연, 수영 방광 및 총 길이(그림 2D), 부풀어 오른 노른자 및 꼬인 꼬리 지느러미(그림 2E)가 포함됩니다. 꼬리지느러미가 없음(그림 2F), 구부러진 노토코드(그림 2G), 절단(그림 2H) 및 괴사를 동반한 사망(그림 2I). 모든 비정상적인 표현형을 '1'로, 영향을 받지 않은 제브라피시를 '0'으로 점수를 매깁니다.

4. LC50 결정

  1. 형태학 평가 후 농도에 대한 7 dpf의 누적 사망률을 표시합니다. 그림 3에 예제가 나와 있습니다. 농도 곡선을 사용하여 50%의 폐사율을 유발하는 농도를 추정합니다.
  2. LC50 농도가 추정되면 96웰 플레이트에 있는 24개의 복제 유충을 이 단일 추정 LC50 농도에 노출시켜 위에서 설명한 실험을 반복합니다.

5. 기술적 복제물

  1. 동일한 화학 물질의 선택된 5가지 농도를 사용하여 전체 절차를 두 번에 걸쳐 최소 두 번 더 반복하여 결과를 재현할 수 있는지 확인합니다.

결과

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이상은 7dpf까지 실험 타임라인에 걸쳐 개별적으로 또는 누적적으로 볼 수 있습니다. 이상별 최대 형태 점수는 사용된 유충 수의 백분율로 형태학적 이상을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 7일차에 scorer 1과 2의 심낭부종 형태 점수가 각각 19와 20이고, 가능한 점수 24점 중, 즉 24마리의 유충 중 19마리 또는 20마리의 유충이 심낭부종을 보이는 경우, 백분율 점수는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.

figure-results-1

보충표 S1 은 만성 골수성 백혈병의 치료를 위해 지시된 티로신 키나아제 억제제인 화합물 보수티닙(Bosutinib)에 대한 독성 시험에 따른 4 dpf에서 (두 스코어러의 형태학 점수 결과를) 보여준다15. 5 dpf에서 7 dpf까지 노화된 노출된 물고기에 대해 동일한 형태 점수가 반복됩니다. 화합물은 100 μM에서 6.25 μM의 농도 범위를 사용하여 테스트되었습니다. 서로 다른 시점에서 세 번의 기술적 복제가 수행되었으며, 유충의 50%가 생존하는 농도인 LC50을 결정하기 위해 7 dpf에서 평균 누적 폐사율을 사용했습니다. LC(50 )는 임의의 노출 시점에서 측정될 수 있다. 그러나 7dpf에서 계산하는 것이 좋습니다.

7 dpf에서의 누적 평균 사망률은 그림 3에서 볼 수 있는 LC50 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다. Bosutinib의 경우 LC50 농도는 37.95μM로 추정되었습니다.

참고: 이 추정된 LC50 농도는 이 모델 시스템에 엄격하게 적용되며 추가 다운스트림 표현형 분석 분석에 사용할 수 있습니다.

figure-results-2
그림 1: 3-7 dpf에서 유충에서 제안된 약물 스크리닝의 개략도. 96웰 테스트 플레이트는 화합물 Bosutinib에 대해 100μM에서 6.25μM 범위의 5가지 농도를 조사하기 위해 설정됩니다. 약어 : dpf = 수정 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 2: 다양한 화학 농도에 노출된 5dpf(노출 후 2일)에서 제브라피시 유충에서 관찰된 대표적인 형태학적 결함. (A) (영향받지 않은) 제브라피쉬, (B) 경미한 심낭부종을 보이는 제브라피시 유충, (C) 심한 심낭부종과 난황 출혈을 보이는 제브라피시, (D) 발달 지연, 색소 침착 감소, 작은 수영 방광이 있는 제브라피시, (E) 난황이 부풀어 오르고 꼬리 지느러미가 꼬인 제브라피시, (F) 꼬리 지느러미가 없는 제브라피시, (G) 구부러진 노토코드를 가진 제브라피시, (H) 꼬리가 잘린 제브라피시, (I) 괴사가 있는 죽은 제브라피쉬. 결함은 빨간색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 3: % 폐사율에 대한 농도를 보여주는 LC50 곡선. 테스트된 5가지 농도는 100μM, 50μM, 25μM, 12.5μM 및 6.25μM였으며 사망률은 각각 100%, 100%, 29.2%, 12.5% 및 12.5%였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형태학적 결함묘사
심낭 부종심장이 늘어나고 혈액 순환이 오작동하면서 심장 주위에 체액이 축적됩니다.
심장 박동(분당)분당 비트 수 감소
노른자위심장 결손과 동시에 발생할 수 있는 난황 부종 또는 출혈의 유무
노른자 확장부풀어 오르거나 얇거나 없는 노른자
곡선 노토코드꼬이거나 물결 모양의 노토코드 및/또는 구부러진 꼬리의 존재
부레를 헤엄치다부레의 존재, 부재 또는 부분적 발달
착 색같은 나이의 처리되지 않은 물고기에 비해 멜라닌 세포가 적거나 전혀 없습니다.
괴 사신체의 어느 부위에도 괴사의 존재(경증 또는 중증) 또는 괴사의 부재
개발 지연같은 나이의 야생형 대조군에 비해 개발이 지연되거나 지연되었습니다.
터치에 대한 반응놀람 후 응답이 지연되거나 반응이 없는 경우(예: 피펫 팁 사용)
잘림후방 제브라피시 몸체의 부재(즉, 꼬리의 형성)
지느러미얇은 난황 확장을 동반할 수 있는 꼬리 지느러미의 유무
감소된 본체 축정상으로 보이지만 측정했을 때 길이가 더 짧은 물고기입니다.

표 1: 약물 노출 연구 후 관찰할 수 있는 시각적 형태학적 결함 목록.

보충 표 S1: 4 dpf(노출 후 1일)에서 Bosutinib에 대한 대표적인 형태학적 결과. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제브라피시는 약물 검사의 중요한 모델이 되었습니다. 독성 테스트를 수행하기 위한 방법론을 결정하려고 할 때 다른 실험실에서 몇 가지 대조적인 방법을 발견했습니다 8,9,10,11,12,13. 설명된 방법은 다양한 연령, 다양한 실험 일정, 다양한 매체 변화율 및 다양한 형태 점수 시스템의 유충을 사용합니다. 시행착오를 통해 우리는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공하는 설명된 방법론을 확립했습니다.

플레이트 크기 선택
처음에는 유충이 이동하고 성장할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하기 위해 24웰 플레이트에서 실험을 수행했습니다. 플레이트는 웰당 10마리의 유충, 농도당 2개의 웰, 웰당 1mL의 약물 용액으로 배열되었습니다. 이 배열은 재현 가능한 결과를 제공하지 못했으며, 이는 유충이 우물에서 동일한 양의 약물을 흡수하지 않는다는 추론으로 이어졌습니다. 그런 다음 웰당 하나의 유충이 있는 96웰 및 48웰 플레이트를 사용하여 시험을 수행했으며, 이를 통해 96웰 플레이트의 유충은 성장에 문제가 없음을 보여주었습니다. 따라서 더 적은 공간과 약물 부피를 활용하여 96웰 플레이트에서 실험을 계속했습니다.

매일 매체 변경
제브라피쉬는 배지에서 약물을 흡수하기 때문에 배지에서 약물의 농도를 일정하게 유지하려면 어느 정도의 배지 변화가 필요하다는 것을 확인했습니다. 또한 매체 변화는 유정에 축적된 잠재적인 폐기물을 제거하여 독성 환경을 제공하고 편향된 결과를 초래할 수 있습니다. Bosutinib에 대한 임상시험이 수행되었으며, 동일한 약물에 대해 3개의 플레이트를 설정했는데, 하나는 매일 매체 변화가 없고, 다른 하나는 매일 절반의 매체 변화가, 다른 하나는 매일 완전한 배지 변화가 있습니다. 매체 변화가 없는 플레이트는 사망률이 증가한 반면, 절반 및 전체 매체 변화가 있는 플레이트는 7 dpf까지 동일한 결과를 보였습니다. 따라서 매일 절반의 중간 변화를 선택했습니다. 이 선택은 비용이 많이 들고 제한된 테스트 재료의 소비를 줄여 추가 다운스트림 실험에 필요할 수 있습니다.

노출 지속 시간
이 프로토콜에서 선택된 실험 유충의 연령과 약물 노출 기간은 뼈 광물화라는 관심 표현형에 의해 주도되었습니다. 뼈 형성은 ~4 dpf에서 시작되기 때문에 테스트 화학 물질이 뼈 발달 시작에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 3 dpf에서 제브라피시로 시작하기로 결정했습니다. 그 후, 8 dpf 이후부터 높은 수준의 폐사율이 관찰되었기 때문에 결과가 편향될 수 있는 섭식 부족을 고려하여 약물 노출 연구를 7 dpf에서 종료했습니다. 그럼에도 불구하고 기간은 연구의 성격과 관심 표현형에 따라 조정될 수 있습니다.

제한
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 3마리의 dpf 제브라피시를 멀티웰 테스트 플레이트로 옮기는 것은 시간이 많이 걸립니다. 유충을 집어 들지 않고 우물에서 매체를 제거하는 것도 똑같이 힘들다. 배지는 단일 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 천천히 제거하여 이 과정에서 유충이 손상되지 않도록 해야 합니다. 또한, 매일 반 매체를 변경하면 테스트 화합물이 보충되고 우물에서 폐기물이 제거되지만, 노출 5일 동안 우물에서 안정적인 약물 농도가 유지될 수 있음을 보장하지는 않습니다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 각 유충이 흡수하는 약물의 실제 양에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있지만, 이 검사는 더 이상 고처리량 스크리닝 방법으로 적합하지 않습니다.

결론적으로, 이 방법론은 4dpf 이상의 제브라피시를 사용한 독성 테스트의 격차를 목표로 하며, 야생형, 돌연변이 및 형질전환 제브라피시 계통에 적용할 수 있는 표준화된 프로토콜을 향한 조치를 취하는 것을 목표로 하며, 이는 배아 단계에서 FET와 동등합니다. 이는 초기 단계에서는 불가능할 수 있는 다른 다운스트림 표현형 분석(downstream phenotyping assay)을 위한 길을 열어줍니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 ZeEBRA(R&I-2019-018), 기술 개발 프로그램(TDP) 기금, STRONG(R&I-2024-007L), TDPLite 기금, NASDAC(SINO-MALTA-2022-08), 과학 및 기술 협력 보조금, Go2Market 보조금인 PROPO(R&I-2018-007A) 프로젝트의 지원을 받았으며, 모두 XjenzaMalta가 과학기술재단(Foundation for Science and Technology)을 위해 자금을 지원했습니다. 그림 1 은 BioRender를 사용하여 만든 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브StarlabE1415-1510
10 µ L 마이크로 피펫 (P10)GilsonF144802 
10/20 &마이크로; L 피펫 팁StarlabS1110-3810
1000 µ L 마이크로 피펫 (P1000)GilsonF123602 
1000 &마이크로; L 피펫 팁StarlabS1111-6001
12웰 플레이트StarlabCC7672-7512멸균, 단일 포장, 미처리, 뚜껑
포함 20 µ L 마이크로 피펫 (P20)GilsonF123600 
200 &마이크로; L 마이크로 피펫 (P200)GilsonF123601 
200 &마이크로; L 멀티채널 피펫 GilsonF81024
200 &마이크로; L 피펫 팁StarlabS1113-1006
96-웰 플레이트StarlabCC7672-7596멸균, 단일 포장, 평평한 바닥, 미처리, 뚜껑
포함 내부 그리드 경사진 바닥, 탱크 칸막이 및 뚜껑이 있는 사육 탱크TecniplastZB17BTISLOP, ZB17BTE,  ZB17BTL, ZB17BTD경사진 내부 탱크
메시 여과기//
니트릴 장갑메르카토르//
페트리 접시 StarlabCC7672-3394 / CC7672-3359100 x 20 mm 또는 60 x 15 mm
Leica M205 FCA 형광 실체 현미경Leica10450826
펠티에 냉각 인큐베이터 조명 모듈이있는 2 개의 선반 포함 차가운 흰색MemmertIPP110ecoplus, T8주야간 사이클
Dimethyl Sulfoxide 장착Biochem Chemopharma504341000에 1% 용액을 준비하기 위해
Biochem Chemopharma303080500E3
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트Biochem Chemopharma313060500준비하기 위해
Biochem Chemopharma316030500E3
SCREEN-WELL을 준비하기 위해  Wnt Pathway library (Bosutinib)EnzoBML-2838-0500
염화나트륨Fisher ScientificS/3161/53E3
E3 염화칼슘 디하이드레이트를 준비하기 위해 E3 염화칼륨을

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  4. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  5. Keenan, S. R., Currie, P. D. The developmental phases of zebrafish myogenesis. J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).
  6. Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).
  7. OECD. Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET). , (2013).
  8. Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization. Molecules. 22 (12), 2068(2017).
  9. He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva. Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).
  10. Huang, H. X., et al. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening. Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).
  11. Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish. J Vis Exp. (158), e60996(2020).
  12. Nishimura, Y., et al. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing. Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).
  13. Hayot, G., et al. Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system. J Vis Exp. (203), e66153(2024).
  14. Hoyberghs, J., et al. DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay. Front Toxicol. 3, 804033(2021).
  15. Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia. Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).

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