녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 운동성 표현형을 관찰하기 위한 고처리량 방법

Summary

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 다양한 유형의 운동성과 관련된 유전적 요인을 식별하기 위한 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다.

Abstract

운동성 행동은 종종 박테리아가 환경에서 사용할 수 있는 자원을 활용하는 능력에 중요한 역할을 합니다. 이는 다재다능한 병원균인 녹농균( Pseudomonas aeruginosa)의 경우 특히 그러한데, 이 병원균은 표면 집락화, 생물막 형성 및 숙주 방어 회피에 기여하는 중요한 병원성 특성인 군집 형성 및 경련을 포함한 다양한 유형의 운동성을 나타낼 수 있습니다. 이 원고는 녹농균(P. aeruginosa)의 운동성 거동을 연구하기 위한 고처리량 운동성 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 예를 들어, 게놈 전체 돌연변이 라이브러리에서 녹농균 의 여러 균주를 동시에 테스트하여 운동성과 관련된 유전적 요인을 식별하고 분석할 수 있습니다. 이 접근법은 포괄적인 방식으로 운동성을 연구할 수 있는 가능성과 녹농균의 운동성의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 박테리아 종뿐만 아니라 다양한 유형의 운동성 분석을 수용하도록 수정할 수도 있으므로 다양한 맥락에서 박테리아 거동에 대한 이해를 증진할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 놀라운 대사 다양성으로 인해 다양한 환경에 서식할 수 있는 기회주의적 병원체입니다 ^1,2. 이러한 다양성은 플랑크톤 성장 방식에서 생물막으로의 전환에 매우 중요하며, 이는 물에서 인체에 이르기까지 광범위한 틈새에서 번성할 수 있는 능력에 기여합니다 ^3,4,5. 이러한 성장 모드 간의 전환은 수영, 떼 짓기, 경련을 포함한 다양한 유형의 운동성을 사용하여 이러한 환경을 이동할 수 있는 광범위한 능력에 의해 도움이 됩니다 ^1,6. 각 유형의 운동성은 뚜렷한 메커니즘과 세포 구조에 의해 매개되며 녹농균이 환경적 신호에 반응할 수 있도록 합니다 ^7,8. 수영 운동성은 단일 극성 편모에 의해 구동되며 액체 매체를 통해 영양분으로 이동하는 데 사용됩니다(예:⁹). 군집 운동성은 편모와 생물 계면 활성제 생산에 의해 촉진되는 조정 된 이동이며 군체가 반고체 표면에 퍼질 수 있도록합니다^{10 , 11}. 마지막으로, 경련하는 운동성은 편모와 무관합니다. 대신, 경련은 IV형 필리(T4P)에 의해 매개되며 표면^12,13 위로 이동하는 데 사용됩니다. Twitching 운동성은 또한 초기 표면 부착을 제공하여 녹농균의 생물막 형성의 초기 단계에 기여합니다. 초기 부착 후 경련은 박테리아가 표면을 가로질러 이동하여 미세군체를 형성할 수 있도록 하며, 이는 성숙한 생물막으로 발전할 수 있습니다 ^1,4,13.

전통적으로 박테리아 운동성 분석은 부드러운 한천 플레이트에서 또는 현미경 방법을 사용하여 한 번에 한 균주씩 개별적으로 수행됩니다 ^6,14,15. 반고체 매체는 박테리아 운동성 연구에 수년 동안 사용되어 왔습니다. 오늘날에도 이러한 기술은 박테리아의 운동성 표현형을 식별하는 데 여전히 사용됩니다. 예를 들어, 전통적으로 군집 운동성은 0.5%-0.8% 한천 농도¹⁶에서 M9 배지를 포함하는 페트리 접시의 중앙에 2.5μL의 녹농균 배양을 접종하여 관찰됩니다. 경련 운동성은 일반적으로 한천(1%)과 페트리 접시 바닥 사이의 계면 표면에서 박테리아의 확산을 관찰하여 측정합니다. 배양 48 시간 후에 틈새 식민지 확장의 큰 후광이 얻어지는 반면, 경련하지 않는 균주는 그러한 식민지 확장 영역을 생성하지 않습니다^{1 , 17 , 18} .

보다 최근에는 트랜스포손 돌연변이 유발 접근법이 녹농균(P. aeruginosa)에서 운동성 또는 생물막 형성에 관여하는 새로운 유전자를 발견했습니다 19,20,21. 예를 들어, 경련 운동성과 관련된 새로운 유전자는 녹농균(P. aeruginosa)의 고밀도 전이(transposon) 돌연변이 라이브러리를 사용하여 발견되었다 ¹⁹. 기능적 유전체학에서 또 다른 유용한 도구는 정렬된 돌연변이 컬렉션(ordered mutant collection)을 사용하는 것입니다^22,23. 대장균(Escherichia coli)의 모든 비필수 유전자에 대한 단일 유전자 결실을 포함하는 Keio 컬렉션(²⁴)은 아마도 가장 잘 알려진 돌연변이 컬렉션일 것이며, 다른 배지(²⁵)에서의 성장에서부터 세포 형태학^{(cell morphology)26} 등에 이르기까지 다양한 표현형에 영향을 미치는 유전자를 정의하는 데 사용되어 왔다. 이러한 컬렉션은 Salmonella enterica serovar Typhimurium²⁷, Bacillus subtilis²⁸, P. aeruginosa²⁹ 및 기타 많은 종에 대해서도 사용할 수 있습니다. 이러한 컬렉션은 또한 게놈 전체 방식으로 운동성을 연구하는 데 매우 적합하여 녹농균의 운동성을 연구하기 위한 고처리량 방법의 개발로 이어졌습니다. 여기서, 이 방법은 고밀도 플레이트에서 경련 및 군집 운동성에 대한 녹농균의 돌연변이의 기여도를 평가하여 테스트되었습니다. 이 고처리량 방법은 다양한 운동성 표현형에 사용할 수 있으며 다른 박테리아의 운동성을 연구하는 데에도 적합합니다.

Protocol

참고: 이 절차의 일반적인 작업 흐름은 그림 1에 요약되어 있습니다.

그림 1: 실험 워크플로우. (1) 실험에서 관심 있는 운동성 유형에 따라 필요한 양의 운동성 매체를 준비합니다. (2) 수동 또는 자동 복제기 시스템을 사용하여 플레이트의 모든 웰에 걸쳐 정밀하고 균일한 접종에 중점을 두고 돌연변이 컬렉션의 P. aeruginosa transposon 삽입 돌연변이 라이브러리에 대한 소스 스톡 플레이트를 적절한 밀도로 준비합니다. (3) 돌연변이 컬렉션의 소스 플레이트에서 운동성 플레이트로 샘플을 옮깁니다. (4) 배양 후 운동성 표현형을 관찰 및 분석하고 고품질 이미지를 사용하여 관심 운동성에 관여하는 유전자를 식별합니다. (5) 고처리량 운동성 실험을 통해 식별된 유효 물질을 검증하기 위해 기존 운동성 분석을 수행합니다. BioRender로 제작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스웜 플레이트 - M9 미디어	트위칭 플레이트 - LB 미디어	소스 플레이트 - LB 매체
200mL의 5x M9 염 용액	NaCl 10 g	NaCl 10 g
20% 포도당 10mL	트립톤 10 g	트립톤 10 g
카사미노산 25 mL	효모 추출물 5 g	효모 추출물 5 g
1M MgSO4 1mL	한천 10 g	한천 15g
1% 한천 500mL	1L에 dH2O 첨가	1L에 dH2O 첨가
1L에 dH2O 첨가		겐타마이신(최종 농도 15μg/mL)

표 1: 분석에 사용된 다양한 플레이트에 대한 배지 조성.

1. 배양 배지 플레이트 준비

참고: 재료 표를 참조하여 재고 용액 및 보관 조건을 준비하십시오. 플레이트는 평평한 표면에 채워야 합니다. 건조할 때 플레이트는 표면이 평평해야 합니다(즉, 쌓이지 않아야 함). 이렇게 하면 플레이트의 배양 배지가 균일하게 건조됩니다. 일반적인 설치 공간을 가진 모든 uniwell 플레이트가 작동할 수 있지만, Singer Instruments Plus 플레이트 또는 VWR 단일 웰 비처리 조직 배양 플레이트와 같이 내부 치수가 더 큰(내부 벽 없음) 플레이트는 플레이트당 더 높은 밀도의 콜로니로 작업하는 데 도움이 됩니다.

1. 표 1의 레시피에 따라 실험을 위한 적절한 양의 배지를 준비합니다. 한천이 응고되는 것을 방지하기 위해 매체를 ~45 °C-50 °C로 유지하십시오.
   1. 소스 플레이트의 경우 전체 PA14 라이브러리-59 x 25 mL =~ 1500 mL를 복제하는 데 필요한 1.5% 한천과 15 μg/mL의 겐타마이신을 포함하는 59 LB(용해성 국물) 플레이트를 준비합니다. LB 1.5% 한천 및 15μg/mL 겐타마이신의 또 다른 15개 플레이트를 준비하여 라이브러리를 384 밀도 형식(15 x 25mL = ~400mL)으로 업스케일링합니다.
   2. 트위칭 플레이트: 96 밀도 형식으로 작업하는 경우 59개의 트위칭 플레이트(LB 1% 한천)를 준비합니다. 384 밀도 형식으로 작업하는 경우 15개의 트위칭 플레이트를 준비합니다.
   3. 군집 플레이트: 15개(384 밀도 형식) 또는 59개(96 밀도 형식) 군집 플레이트(M9-포도당 0.5% 한천) 준비
2. 접시에서 뚜껑을 열고 접시당 25mL의 미디어를 붓습니다. 플레이트의 모든 모서리를 한 번에 하나씩 부드럽게 들어 올려 플레이트 전체에 미디어를 고르게 분배합니다. 이 흔들기 동작을 2x-3x 반복합니다. 접시에 뚜껑을 다시 끼웁니다.
3. 플레이트를 굳히고 실온(RT)에서 밤새 건조시킵니다. 플레이트를 즉시 사용하지 않을 경우 밀폐 백에 넣어 건조한 곳에 보관하십시오. 3주 동안 보관할 수 있습니다.

2. P. aeruginosa transposon 돌연변이 라이브러리의 소스 플레이트 준비

참고: 소스 플레이트는 나중에 운동성 플레이트를 접종하는 데 사용되는 PA14 라이브러리의 사본을 포함하는 LBA-겐타마이신 플레이트를 말합니다. P. aeruginosa transposon 돌연변이 라이브러리(PA14 라이브러리)는 59개의 냉동 96웰 플레이트²⁹ 세트입니다. 각 형식에 대한 소스 플레이트를 준비하는 단계는 아래에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 Rotor+ 복제기에 액세스할 수 없는 실험실에 적용할 수 있습니다. 연구원들은 1일차( 재료 표 참조) 동안 PA14 라이브러리의 냉동 플레이트를 복제하기 위해 여기에서 사용되는 스프링 장착 96핀 복제기 또는 기타 96핀 복제기와 같은 수동 복제기를 사용하여 동일한 실험 절차를 성공적으로 수행할 수 있습니다. 수동 복제기는 멸균해야 하며 매번 사용할 때마다 냉각시켜야 합니다.

1. 1일차: 59개의 프로즌 96웰 플레이트에서 소스 플레이트로 PA14 라이브러리 복제
   1. 스프링이 장착된 96핀 복제기를 최대 온도의 핫 플레이트에 8분 동안 올려 놓고 멸균합니다. 살균 후에는 박테리아가 죽지 않도록 복제기를 충분히 식히십시오(~10분).
   2. 소스 플레이트 하나를 잡습니다. 멸균 96핀 리플리케이터를 사용하여 리플리케이터 핀을 하나의 96웰 플레이트에 조심스럽게 담근 다음 세포를 소스 플레이트의 표면으로 직접 옮깁니다. PA14 라이브러리의 59개의 모든 동결 96웰 플레이트가 소스 플레이트에 복제될 때까지 반복합니다.
   3. 96 밀도 소스 플레이트를 37 ° C에서 16-18 시간 동안 배양합니다.
      참고: 96 밀도 형식으로 방법을 사용하는 경우 이러한 소스 플레이트를 사용하여 운동성 플레이트를 접종할 수 있습니다.
2. 2일차: 96 밀도 형식에서 384 밀도 형식으로 업스케일링
   참고: 2일차는 96 밀도에서 작업하는 경우 건너뛸 수 있습니다.
   1. 배양 후에는 플레이트(쌓이지 않고 표면에 평평함)를 실온(~1h)에서 식히십시오. 뚜껑에 결로 현상이 있는 경우 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 결로를 제거하여 물방울이 플레이트에 떨어지는 것을 방지하여 군체 간 교차 오염을 유발할 수 있습니다.
   2. 정확한 콜로니 전송을 보장하기 위해 다음 매개 변수로 복제기를 구성합니다. 리플리케이터를 켭 니다. Select an operate mode(운영 모드 선택) 섹션에서 Select and Run Stored Programs(저장된 프로그램 선택 및 실행)를 선택합니다.
   3. Select source plates(소스 플레이트 선택) 섹션에서 PlusPlate 96 Agar를 선택합니다. Select target plates 섹션에서 PlusPlate 384 Agar를 선택합니다. 패드 선택 섹션에서 Short Pin 96을 선택합니다.
   4. Replicate program options(프로그램 복제 옵션) 섹션에서 General(일반 )을 선택하고 Recycle > None(없음)을 클릭합니다.
   5. Source 섹션에서 Offset 을 선택하고 Random > Default Radius를 클릭합니다. 대상 섹션에서 고정 을 선택하고 압력을 20%로 조정합니다. 다른 모든 설정은 기본값으로 둡니다.
   6. Short Pin RePads 96을 해당 구획에 삽입합니다.
   7. 소스 플레이트와 타겟 플레이트를 복제기의 지정된 플랫폼에 배치합니다. 96밀도 소스 플레이트(플레이트 1, 2, 3, 4)와 새 빈 소스 플레이트(LBA 플레이트)를 플랫폼에 놓습니다. 선택한 매개변수를 사용하여 미생물 어레이 피닝 로봇은 96 밀도 플레이트에서 새로운 384 밀도 플레이트로 콜로니를 전송합니다. 실행을 누릅니다.
   8. 플랫폼의 모든 플레이트(다음 4개의 96 밀도 소스 플레이트와 새로운 빈 소스 플레이트)를 변경하고 모든 플레이트가 업스케일링될 때까지 반복합니다. 마지막 플레이트 세트의 경우 플레이트 57, 58, 59 및 1을 사용합니다. 각 384 밀도 플레이트는 4개의 96 밀도 플레이트에서 교대로 생성되는 콜로니로 구성됩니다( 그림 2 참조). 384 밀도의 LBA 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
      참고: 그런 다음 이러한 384 밀도 소스 플레이트를 사용하여 384 밀도에서 프로토콜을 수행하기 위해 운동성 플레이트를 접종할 수 있습니다. 배양 후 모든 단계에서 플레이트는 최대 3주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

그림 2: 96 밀도 플레이트에서 384 밀도 플레이트로 업스케일링. 4개의 96 밀도 소스 플레이트의 콜로니가 전달되어 단일 384 밀도 플레이트로 병합됩니다. 384 밀도 플레이트의 각 사분면은 원래 96웰 플레이트(빨간색, 파란색, 노란색 및 녹색) 중 하나에 해당하여 각 돌연변이의 위치를 보존합니다. BioRender로 제작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. High-throughput 운동성 실험

참고: 프로토콜은 여기에서 384 밀도 형식으로 수행되었지만, 384 대신 96 선택을 사용하여 소스 플레이트에서 운동성 플레이트로 전송하도록 복제기의 매개변수를 수정하여 동일한 프로토콜을 96 밀도 형식으로 조정할 수 있습니다.

1. 배양 후에는 플레이트(쌓이지 않고 표면에 평평함)를 실온(~1h)에서 식히십시오. 뚜껑에 결로 현상이 발생하면 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 물방울이 플레이트에 떨어지지 않도록 하여 콜로니 간 교차 오염을 유발할 수 있습니다.
2. 원하는 분석에 적합한 수의 플레이트(96 밀도 형식의 경우 59개 또는 384 밀도 형식의 경우 15개)를 준비합니다: M9-포도당 0.5% 한천 플레이트는 스벌링, LB 및 트위칭은 1% 한천 플레이트입니다.
3. 정확한 콜로니 전송을 보장하기 위해 다음 매개 변수로 복제기를 구성합니다.
   1. 리플리케이터를 켭 니다. Select an operate mode(운영 모드 선택) 섹션에서 Select and Run Stored Programs(저장된 프로그램 선택 및 실행)를 선택합니다. 소스 플레이트 선택 섹션에서 PlusPlate 384 한천을 선택합니다.
   2. Select target plates 섹션에서 PlusPlate 384 Agar를 선택합니다. 패드 선택 섹션에서 Short Pin 384를 선택합니다. Replicate program options(프로그램 복제 옵션) 섹션에서 General(일반) > Recycle(재활용) > None(없음)을 선택합니다.
   3. Singer Programs(Singer 프로그램)에서 Replicate Many(다수 복제)를 선택합니다.
   4. Source(소스) 섹션에서 Offset > Random > Default Radius(기본 반경)를 선택합니다. 대상 섹션에서 고정 을 선택하고 압력을 2%로 조정합니다. 다른 모든 설정은 기본값으로 둡니다.
4. 짧은 핀 RePads 384를 해당 구획에 삽입합니다.
5. 소스 플레이트와 타겟 플레이트를 복제기의 지정된 플랫폼에 배치합니다. 384 밀도 소스 플레이트와 빈 운동성 플레이트를 플랫폼에 놓습니다. 선택한 매개변수를 사용하여 실행을 누르면 미생물 어레이 피닝 로봇이 384 밀도 소스 플레이트에서 운동 플레이트로 콜로니를 이동합니다. 각 384 밀도 플레이트는 하나의 384 밀도 소스 플레이트의 사본으로 구성됩니다.
6. 전달이 균일하고 모든 콜로니가 운동성 플레이트의 한천 표면에 적절하게 고정되었는지 확인합니다. 접종된 운동성 플레이트를 비닐 봉지에 넣습니다. 플레이트가 들어 있는 백을 37°C로 설정된 인큐베이터에 18시간 동안 조심스럽게 넣습니다.
   알림: 플레이트는 습도를 유지하고 고르지 않은 건조를 방지하기 위해 가방에 넣습니다. 뚜껑이 위를 향하도록 접시를 인큐베이터에 놓습니다.
7. 배양 후 운동성 플레이트에 균일한 군집 성장과 오염이 없는지 확인합니다.
8. 3일차: 운동성 플레이트 이미징
   참고 : Singer Instruments PhenoBooth는 운동성 플레이트의 고해상도 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. 과학용 카메라를 사용하여 23메가픽셀 이미지를 생성합니다. 여기에는 페트리 접시와 직사각형 플레이트에서 서식지의 고해상도 이미지를 캡처하는 5개의 조명 채널이 포함되어 있습니다. 다른 고품질 이미저도 작동합니다.
   1. 배양 기간이 끝나면 운동성 플레이트가 이미징 프로세스를 위한 준비가 됩니다. Phenobooth를 켜고 Phenobooth 소프트웨어에 해당하는 아이콘을 클릭합니다.
   2. 프로젝트 선택 페이지가 열립니다. New Project > Colony Counting을 클릭합니다. 원하는 파일 경로를 선택하여 위치 필드에 이미지를 저장합니다. 해상도 필드에서 5626 x 4220을 선택합니다. 확인을 클릭하면 이제 장치가 사진을 찍을 준비가 되었습니다.
   3. 뚜껑을 제거한 후 중간 면이 위로 향하게 하여 플레이트를 리더기에 삽입합니다. 플레이트가 걸리지 않도록 리더를 닫기 전에 플레이트가 올바른 위치에 있는지 확인하십시오.
   4. Lighting 탭에서 매개변수를 백색광으로 설정합니다. 미리보기를 클릭합니다. PhenoBooth 설정 탭에서 노출 설정을 조정하여 운동성 표현형을 관찰하기 위한 최적의 매개변수를 얻습니다.
   5. Acquire를 클릭합니다. 캡처된 이미지가 화면 왼쪽에 나타납니다. 완료되면 소프트웨어를 닫습니다(캡처된 모든 이미지는 위치 탭에서 이전에 선택한 파일에 저장됩니다).
      참고: Phenobooth는 이미지를 JPEG 형식으로 저장하지만 다운스트림 분석 단계의 경우 이미지는 TIFF, JPEG 또는 PNG 형식일 수 있습니다.

4. 운동성 표현형 분석

참고: 이미지 분석은 French et ^al.30,31에 자세히 설명된 대로 수행됩니다. 데이터 분석을 수행하기 위한 스크립트는³¹(ImageJ Macro)에서 사용할 수 있습니다.

1. 간단히 말해서, 이미지는 ImageJ³²에서 처리되며, 이는 운동성 플레이트의 각 콜로니에 대한 값을 생성합니다. 먼저, 이미지를 8비트 형식으로 변환하고, threshold 명령을 사용하여 군체와 관련 운동성 영역을 배경에서 분할합니다. 모든 군체 주변에 관심 영역(ROI)을 그리고 운동성 영역을 측정합니다. 이렇게 하면 행별로 구성된 각 유정에 대한 통합 밀도 값이 포함된 테이블이 생성됩니다. 이 테이블은 추가 분석을 위해 CSV 파일로 저장할 수 있습니다.
   1. ImageJ에서 매크로를 실행하고 이미지가 포함된 폴더를 엽니다.
   2. 메시지가 표시되면 미리보기 옵션을 사용하여 플레이트의 각도를 수정하여 플레이트가 직선이 되도록 플레이트의 회전을 조정합니다. 만족스러우면 확인 버튼을 클릭합니다.
   3. 다음으로, 군체 주위로 직사각형을 이동하고 군체가 포함된 플레이트 부분을 자르는 데 사용합니다. 준비가 되면 확인 버튼을 클릭합니다.
   4. 다음 프롬프트는 각 콜로니 주위에 ROI를 그리고 운동성 영역을 측정하는 데 사용되는 그리드를 정의합니다. 적절한 콜로니 밀도를 선택합니다. 필요한 경우 각 원이 군체 주위에 있도록 다양한 매개변수를 조정합니다. 준비가 되면 Okay? 상자를 클릭하고 OK 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 각 콜로니의 운동성 영역이 측정되고 데이터가 포함된 폴더에 CSV 파일이 저장됩니다.
2. 이 CSV 파일을 역시 행별로 구성된 플레이트 범례와 결합하여 해당 돌연변이가 있는 각 운동성 영역을 식별합니다. 더 낮은 통합 밀도 값은 운동성이 없거나 운동성이 감소한 돌연변이에 해당합니다.

5. 유효 물질의 검증을 위한 전통적인 운동성 분석

참고: high-throughput motility 프로토콜에서 영향을 받은 운동성을 가진 돌연변이를 관찰한 후에는 획득한 hit를 개별적으로 검증하는 것이 중요합니다. 개별 운동성 프로토콜은 고처리량 테스트에 사용되는 프로토콜과 다르지만 사용되는 매체는 동일합니다.

1. 스워밍 운동성 분석
   참고: 군집 운동성은 Ha et ^al.16에 의해 자세히 설명된 대로 수행됩니다.
   1. 간단히 말해서 M9(0.5% 한천), 포도당, 카사미노산 및 MgSO₄가 포함된 한천 용액을 고압멸균합니다. 냉각되고 혼합된 한천을 페트리 플레이트(플레이트당 25mL)에 붓습니다.
   2. 2.5μL의 야간 박테리아 배양액을 접종합니다. 37°C에서 18시간 동안 뚜껑이 위를 향하도록 하여 운동성 표현형을 관찰합니다.
2. Twitching 운동성 분석
   참고: 경련 운동성은 Haley et ^al.33,34에 자세히 설명된 대로 수행됩니다.
   1. 간단히 말해서, LB 1% 한천을 오토클레이브합니다( 표 1 참조). 냉각된 혼합 LB 1% 한천을 페트리 플레이트(플레이트당 25mL)에 붓습니다.
   2. 경련하는 플레이트의 바닥에 박테리아를 찔러 넣습니다(한천 1%). 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양한 다음 RT에서 추가로 48시간 동안 배양합니다. 플레이트에서 한천을 제거하고 페트리 접시를 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 경련 영역을 시각화합니다.
   3. 3단계에서 설명한 것과 동일한 매개변수로 PhenoBooth를 사용하여 페트리 접시를 촬영합니다.

Results

우리는 이 프로토콜을 사용하여 높은 처리량에서 녹농 균의 운동성에 대한 유전자 불활성화의 효과를 특성화했습니다. 여기에서는 P의 게놈 전체 결실 컬렉션에서 스웜(swarming) 및 경련(twitching) 운동성을 연구하기 위한 사용에 대해 자세히 설명했습니다. 녹농 균 균주 PA14 (PA14 라이브러리). 이 프로토콜은 뛰어난 다양성과 사용 편의성을 제공하여 다른 배양 배지 또는 돌연변이 컬렉션을 사용하는 것과 같은 프로토콜의 여러 단계를 수정할 수 있습니다.

돌연변이체는 운동성 영역에 따라 점수가 매겨졌습니다. 플레이트에 있는 대부분의 돌연변이는 녹농 균의 운동성에 영향을 미치지 않으므로 플레이트의 모든 돌연변이에 대한 운동성 평균은 WT로 간주됩니다. 평균과 크게 다른 운동성 영역을 가진 돌연변이는 운동성에 결함이 있는 것으로 간주됩니다. 테스트된 돌연변이체는 순위가 매겨졌고, 하위 15%는 엄격하게 선택되었습니다. 그런 다음 이러한 돌연변이 중 일부는 기존 분석을 사용하여 확인되었습니다. 평균보다 큰 운동성 표현형을 나타내는 돌연변이는 이 분석에서 확인되지 않았습니다. 이 방법론은 시각화가 더 명확하기 때문에 운동성 표현형이 감소된 돌연변이를 식별하는 데 특히 효과적입니다.

PA14 라이브러리에서 나온 돌연변이의 경련 운동성은 먼저 high-throughput motility protocol을 사용하여 조사되었습니다(그림 3). 그림 3A는 1% 한천(경련 배지)을 포함하는 LB에서 성장한 PA14 라이브러리의 대표적인 384 밀도 플레이트를 보여주며, 경련 운동성을 수행하는 돌연변이는 중앙 군체 주변에 후광을 품고 있는 반면 경련이 감소한 돌연변이는 그렇지 않습니다. 그런 다음 경련 영역(콜로니 + 후광)을 측정하여 플레이트의 각 돌연변이에 대한 경련 운동성을 평가하고 경련 능력에 영향을 받는 돌연변이를 식별할 수 있게 됩니다(그림 3B). 흥미롭게도, 경련이 감소된 돌연변이 중 많은 돌연변이(pilO, pilF 및 pilG)가 경련 운동성에 필수적인 T4P 기계의 생합성에 관여합니다 ^1,13. 이러한 돌연변이는 실제로 전통적인 경련 분석법에서 개별적으로 테스트했을 때 경련 운동성의 감소를 보여주었습니다(그림 3C).

PA14 라이브러리의 돌연변이체로 인한 군집 운동성도 고처리량 운동성 프로토콜을 사용하여 검사되었으며, 이번에는 0.5% 한천을 함유한 M9-포도당 배지를 사용했습니다(그림 4A). 다시 말하지만, 군집은 군체를 둘러싼 후광에 의해 관찰되며, 군집의 전형적인 돌출부가 후광의 가장자리에서 볼 수 있으며, 이는 군집이 실제로 관찰되고 있음을 시사합니다. 그런 다음 동일한 분석을 사용하여 각 돌연변이의 운동성 영역을 측정하고 스워밍(swarming)이 감소한 돌연변이를 검출했습니다(그림 4B). oprC, lipC, pilR 및 PA14_20860와 같은 유전자의 비활성화가 녹농균의 군집 능력을 감소시키는 것이 관찰되었습니다. 이 모든 유전자는^35,36,37 이전에 녹농균(P. aeruginosa)에서 군집 운동성과 관련이 있었습니다. 기존의 군집 분석에서 개별적으로 테스트했을 때 pilC, oprC 및 PA14_20860 돌연변이는 군집 활동을 나타내지 않았습니다(그림 4C).

그림 3: high-throughput motility protocol을 사용한 twitching motility의 영향을 받는 돌연변이의 식별. (A) 37°C에서 18시간 동안 배양한 후 PA14 컬렉션에서 384개의 돌연변이를 접종한 Twitching plate의 대표 이미지. (B) 운동성 영역, 즉 박테리아 성장(colony + halo)을 보여주는 LBA 플레이트의 표면을 각 돌연변이에 대해 측정합니다. 녹색: 운동성 영역(motility area)을 기준으로 가장 낮은 15%의 값에서 선택된 돌연변이를 통해 운동성 장애와 관련된 돌연변이를 식별합니다. 인덱스는 플레이트에서 PA14 라이브러리의 돌연변이체 위치를 나타냅니다. 짙은 녹색: 경련 결핍이 확인된 돌연변이. (C) PA14 wt, PA14 ΔpilO, PA14 ΔpilF 및 PA14 ΔpilG 를 Luria-Bertani(LB) 경련판(1% 한천) 중 하나에 찌르고 경련 운동성을 전통적인 경련 분석을 사용하여 평가했습니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양한 다음 23°C에서 추가로 48시간 동안 배양했습니다. 배양 후, 각 페트리 접시에서 한천을 조심스럽게 제거하고 페트리 접시 표면의 기본 경련 영역을 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 시각화했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: high-throughput motility 프로토콜을 사용한 스웜 운동성에 영향을 받는 돌연변이 식별. (A) 37°C에서 18시간 동안 배양한 후 PA14 컬렉션에서 384개의 돌연변이체를 접종한 운동성 플레이트의 대표적인 이미지.(B) 그런 다음 그림 3에 설명된 바와 같이 각 돌연변이에 대해 운동성 영역을 측정합니다. 녹색: 운동성 영역(motility area)을 기준으로 가장 낮은 15%의 값에서 선택된 돌연변이를 통해 운동성 장애와 관련된 돌연변이를 식별합니다. 인덱스는 플레이트에서 PA14 라이브러리의 돌연변이의 위치를 나타냅니다.짙은 녹색: 군집 결핍이 확인된 돌연변이. (C) PA14 wt, PA14 Δ PA14_20860, PA14 ΔoprC 및 PA14 ΔlipC 를 M9 최소 배지 군집 플레이트(0.5% 한천)에 접종했습니다. 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 배양했습니다. 배양 후, 고밀도 수준에서 관찰된 표현형을 확인하기 위해 개별 군집 운동성을 시각화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 설명된 high-throughput motility protocol을 사용하면 많은 콜로니의 운동성 표현형을 정밀하고 재현성있게 처리하고 분석할 수 있습니다. 기존의 수동 방법과 비교하여 이 반자동 접근 방식은 운동성 분석의 확장성과 처리량을 증가시켜 박테리아 운동성의 게놈 전체 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 PA14 라이브러리와 함께 사용하도록 최적화되었지만, 이 분석은 E. coli²⁴ 에 대한 Keio 컬렉션 또는 Salmonella enterica serovar Typhimurium²⁷에 대한 SGD 컬렉션과 같은 주문된 돌연변이 라이브러리와 함께 사용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 돌연변이 라이브러리 대신 균주 라이브러리와 함께 작동하도록 최적화할 수도 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자로부터 분리된 녹농 균 균주 라이브러리의 운동성 표현형을 결정하는 데 유용할 것입니다. 특정 균주 또는 실험 조건에 맞게 프로토콜을 최적화하기 위해 분석법의 수정 및 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 운동성 분석에서 한천의 농도를 조정하면 녹농 균에 대한 다양한 유형의 운동성(군집 및 경련)을 평가할 수 있지만(그림 3, 그림 4), 동일한 프로토콜로 다른 유형의 운동성도 탐색할 수 있습니다.

운동성은 박테리아 세포 생물학의 여러 측면과 관련이 있으며 미생물 발병기전, 항생제 내성 및 생물막 형성에 영향을 미칩니다 1,11,12,38,39,40,41. 녹농균의 운동성은 특히 감염 기간 동안 녹농균의 수명 주기에서 중요한 부분을 차지하지만, 5,38,42,43,44 다른 박테리아의 발병기전도 운동성에 의해 영향을 받습니다 ^41,45. 따라서, 녹농균(P. aeruginosa) 및 기타 박테리아와 같은 병원체에 대한 운동성에 대한 포괄적인 이해는 예를 들어 항균 요법에 대한 새로운 표적을 제공할 수 있습니다⁴⁶. 이 방법의 처리량으로 인해 많은 수의 돌연변이 또는 균주를 병렬로 테스트하여 운동성에 대한 포괄적인 관점을 제공할 수 있습니다.

이와 같은 고처리량 방법은 균주 또는 돌연변이의 운동성 거동을 식별하는 첫 번째 단계이지만, 관찰된 표현형을 특성화하기 위해서는 후속 실험이 중요합니다. 모든 돌연변이에 대한 운동성 영역을 측정하고 비교함으로써 분석은 운동성이 전혀 없는 콜로니, 중간 운동성 및 정상 운동성 표현형을 구별할 수 있으며, 이는 스크린의 평균과 크게 다른 운동성 영역을 가진 돌연변이를 식별함으로써 가능합니다. 그러나 예를 들어 돌연변이의 운동성 결함을 정량적으로 측정하기 위해서는 더 많은 실험이 필요합니다. 또한 이 분석은 실제 환경 조건에서 관찰되는 운동성 거동의 복잡성을 완전히 포착하지 못할 수 있습니다. 쉽게 간과할 수 있는 분석의 중요한 단계 중 하나는 플레이트 준비입니다. 이와 같은 고처리량 분석의 품질은 분석에 사용된 플레이트의 품질과 상관관계가 있습니다. 예를 들어, 플레이트가 수평을 이루지 않으면 일부 핀이 플레이트와 균일하게 접촉하지 않아 각 핀에 의한 접종물의 불균일한 증착으로 이어질 수 있으며, 이는 관찰된 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다.

전반적으로, 여기에 제시된 고처리량 운동성 프로토콜은 여기에 사용된 PA14 라이브러리와 같은 게놈 전체 돌연변이 라이브러리까지 많은 수의 샘플을 테스트하기 위해 운동성 분석을 업스케일링하는 효율적이고 정확한 방법입니다. 따라서 이 방법은 세균 운동성과 그 유전적 결정 요인에 대한 이해를 진전시키는 데 중요한 도구이며, 이는 세균 발병 기전 연구 또는 항균제에 대한 대안 개발과 같은 다양한 연구 분야에 영향을 미칠 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96개의 웰플레이트   그리고 nbsp;	코닝  그리고 nbsp;	3701 & nbsp;
아가	피셔 사이언티픽   그리고 nbsp;	BP1423-2	최종 농도는 군집 운동성에 대해 각각 0.5%, 운동성 운동성은 1%입니다.
카사미노산  그리고 nbsp;	피셔 사이언티픽   그리고 nbsp;	223050	물 20% 스톡을 준비하세요. 필터는 0.22 & mu로 멸균합니다; m 여과후 4 & 도C로 저장. 최종 농도는 M9 최소 매질에서 0.5%로 설정;
크리스탈 바이올렛	바이오 베이시널  그리고 nbsp;	CB0331	1% 용액을 물에 준비하세요.
D-포도당  그리고 nbsp;	바이오 베이시널  그리고 nbsp;	GB0219	20% 스톡(1.1 M)을 물에 담근 후 오토클레이빙으로 멸균하세요. 최종 농도는 M9 최소 매질에서 0.2% 및 nbsp;
필트로푸르 S 0.2 & nbsp;	사르스테트	83.1826.001
겐타마이신 설페이트  그리고 nbsp;	바이오 베이시널  그리고 nbsp;	GB0217	30mg/ml 육수를 물에 담아 준비하세요. 필터는 0.22 & mu로 멸균합니다; 4 & 도(4 & 도)로 필터 및 저장 C & ndash; 최종 농도는 플레이트 15 및 마이크로; g/mL.. 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;
예방접종 루프와 주사기...	피셔 사이언티픽	22363597
M9 최소 염, 5X	피셔 사이언티픽	248510	1M 스톡을 물에 담근 후 오토클레이브로 멸균하세요. 최종 농도는 M9 최소 매질에 1 mM. 그리고 nbsp;
황산마그네슘(MgSO4)과 nbsp; 그리고 nbsp;	피셔 사이언티픽	M63-500	그리고 nbsp; 1M MgSO4 스톡을 물에 준비하세요. 필터는 0.22 & mu로 멸균합니다; 여과해서 실온에 보관하세요. 최종 농도
PA14 트랜스포존 삽입 돌연변이 라이브러리   그리고 nbsp;		Liberati 외, 2006 (참고문헌 29 참조)	전체 컬렉션을 위한 59장의 96웰 판. 각 웰에는 25% 글리세롤을 가진 단일 돌연변이체가 LB에 포함되어 있습니다.
페트리 접시 92x16mm	사르스테트	82.1473.001
페노부스+	싱어 악기	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	분말 11.3g을 정제수 200mL에 녹입니다. 오토클레이브를 121도에서 사용하세요; C는 15분간 그리고 nbsp;
플라스틱 주사기 10 mL	피셔 사이언티픽	14955459
로터+  그리고 nbsp; 그리고 nbsp;	싱어 악기	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
짧은 핀 리패드 384 밀도	싱어 악기   그리고 nbsp;	REP-004
짧은 핀 리패드 96 밀도   그리고 nbsp;	싱어 악기   그리고 nbsp;	REP-002
염화나트륨(NaCl)과 nbsp; 그리고 nbsp;	피셔 사이언티픽	BP358-212
스프링 장착 96핀 복제기	EnzyScreen  그리고 nbsp;	CR1000
수술용 블레이드 스테인리스 번호 25	피셔 사이언티픽	08-918-5F
트립톤	옥소이드  그리고 nbsp;	LP0042B
유니웰 플레이트	싱어 악기   그리고 nbsp;	플러스플레이트: PLU-003   그리고 nbsp;	판 크기: 54 & 배; 34 & times; 38cm - 내부 벽이 없어 내부 치수가 더 큽니다.
유니웰 플레이트	VWR	단일 웰 조직 배양 플레이트: 75780-348	플러스플레이트와 크기가 같아요.
효모 추출물	피셔 사이언티픽	248510