방법 논문

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

DOI:

10.3791/67780

⸱

2024년 12월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 나노섬유막 기반 2층 시스템에서 섬유아세포로 배양된 상피 세포가 어떻게 막에 안정적으로 부착하고 성장할 수 있는지 보여줍니다.

초록

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상피 세포 배양에서 기술적 장애물에는 역분화(dedifferentiation)와 기능 상실이 포함됩니다. 생체 모방 3차원(3D) 세포 배양 방법은 세포 배양 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 본 연구는 3D 환경에서 섬유아세포를 배양하여 상피세포를 조직과 같은 층으로 배양하기 위한 첨단 2층 배양 시스템을 소개합니다. 폴리비닐 알코올(PVA) 및 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 나노섬유막(NM)을 전기방사를 통해 제조하고 각각 상피 세포 및 섬유아세포 배양을 위한 생리학적으로 관련된 세포 외 매트릭스로 활용했습니다. 상부 삽입 웰에서는 폐 상피 세포를 PVA NM에서 배양하고, 하부 챔버에서는 섬유아세포를 PCL NM에서 배양했습니다. 이 구성은 세포와 세포의 직접적인 접촉을 없애고 용해성 인자에 의해 매개되는 부분비 신호전달의 검사를 용이하게 합니다. 컨포칼 현미경은 상피 세포의 조나 폐색을 포함한 세포 내 단백질의 분포, 성장 패턴 및 발현을 분석하는 데 사용되었습니다. Z-스태킹 기술을 통해 상세한 3D 재구성이 가능하여 상피층 내의 밀접한 접합부와 공간 조직의 무결성에 대한 정확한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 주사 전자 현미경(SEM)은 나노 섬유막에서 세포 유형의 형태학적 특성을 평가했습니다. SEM 이미징은 복잡한 세포 표면 구조와 나노 섬유와의 상호 작용을 밝혀 세포 구조 및 나노 섬유 구조와의 세포 상호 작용에 대한 포괄적인 관점을 제공했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석은 시간 경과에 따른 상피 세포 및 섬유아세포 성장 속도를 측정하는 간단한 방법입니다. 그것은 이러한 세포를 공동 배양하는 증식 행동과 잠재적인 시너지 효과를 제공합니다. 이러한 결과는 섬유아세포와 상피세포의 동시 배양을 위한 간단한 삽입 공동 배양 시스템의 효과를 강조하며, 이는 상피 조직 재생, 내피 세포, 면역 및 기타 기질 세포가 있는 종양 미세환경, 독성 분석 및 약물 활성 테스트를 포함한 다양한 생리학적 및 약리학적 맥락에서 중요합니다.

서론

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수십 년 동안 고전적인 2차원(2D) 단층 배양은 감염, 약리학 및 독성학을 이해하는 데 필수적이었습니다 1,2. 그러나 조직 미세환경의 복잡성, 다중 구성 간의 동적 상호 작용 및 3차원(3D) 아키텍처를 고려하는 것이 중요합니다. 따라서, 2D 세포 배양은 조직과 같은 구조를 모방하는 데 한계가 있습니다 3,4. 예를 들어, 생체 미세환경에서 세포 분화, 증식 및 세포 기능에 필수적인 세포 간 및 세포 간 기질(ECM) 신호전달이 부족합니다. 이러한 이유로 3D 세포 배양 시스템이 개발되었습니다5. 3D 배양의 세포는 성장하여 주변 세포외 기질과 3차원으로 상호 작용합니다. 또한, 단순한 단일 세포 유형 in vitro 모델과 in vivo6에서 발생하는 동적 세포 상호 작용 사이의 격차를 해소하기 위해 두 가지 이상의 세포 유형으로 구성된 3D 공동 배양 접근 방식이 개발되었습니다. 3D 공동 배양 시스템은 세포-세포 통신 및 세포-세포외 기질(ECM) 상호 작용 연구에서 인기를 얻었습니다 7,8,9,10. 현재의 3D 공동배양 시스템은 여러 가지 형태를 가지고 있으며 직접 및 간접 공동배양으로 구분할 수 있습니다 8,9. 직접 공동 배양에서 배양된 세포의 다양한 세포 기능은 부분비 효과보다는 직접 접촉에 의해 주로 영향을 받을 수 있습니다. 이에 비해 간접 공동 배양은 장벽 또는 층을 사용하여 서로 다른 세포 유형을 분리함으로써 부분비 상호 작용을 조사하는 데 더 큰 이점이 있습니다.

생체 적합성 및 생분해성 물질을 사용하여 ECM을 모방한 생체 모방 골격을 제작하기 위해 다양한 재료와 방법이 활용됩니다10. 나노 섬유 스캐폴드 구조는 생물학적 조직에서 네이티브 ECM의 구성을 모방하여 세포 배양을 위한 3D 아키텍처를 제공합니다11,12. 전기 방사 나노 섬유막 (NM)은 다양한 유형의 세포13 , 14 , 15 의 직접 및 간접 공동 배양에 사용되었습니다.

상피 세포는 주요 장기의 물리적 장벽을 형성하는 반면, 섬유아세포는 ECM 리모델링을 매개하고 주변 상피를 조절하는 우세한 기질 세포입니다 6,16,17. 상피 세포와 섬유아세포는 세포 표면의 인테그린 수용체를 통해 각각 기저막의 라미닌 및 간질 기질의 피브로넥틴과 상호 작용합니다18. 상피 세포는 직경이 150 - 250 nm이고 미세 기공을 가진 폴리(비닐 알코올) (PVA) NM에서 배양될 때 세포 응집체와 스페로이드 대신 다층을 형성하며 성장 패턴은 상피 조직에 있는 세포의 성장 패턴과 유사합니다19. 이에 비해 400-1,500nm 직경과 10-50μm 미세공을 가진 폴리(카프로락톤)(PCL) NM은 배양된 섬유아세포의 성장을 위한 간질 매트릭스와 유사한 공간적 차원을 제공합니다13,14. PVA 및 PCL 멤브레인은 생체 적합성으로 인해 조직 공학에서 일반적으로 사용되는 폴리머입니다20,21.

본 연구에서는 다공성 전기방사 NM을 사용하여 상피세포를 3D 구조 내에서 조직과 같은 층 및 섬유아세포로 배양하는 첨단 2층 배양 시스템을 소개합니다. 프로토콜은 나노섬유 제조, 섬유 포스트 가교 및 품질 평가, 멤브레인 부착 배양 웰 준비, 세포 파종 및 3D 공동 배양, 3D 배양 세포의 5가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 물에 안정한 PVA 나노섬유 제작

  1. 0.02g의 폴리(아크릴산)(PAA)와 1g의 PVA의 무게를 잰 다음 마그네틱 바가 들어 있는 깨끗한 유리병에 넣습니다. 병에 증류수 7.8mL를 넣고 병을 플레이트 교반기에 놓고 온도를 84°C, 속도를 500rpm, 시간을 12시간으로 설정합니다.
  2. 0.2mL의 글루타르알데히드(GA)를 추가하기 전에 병을 실온으로 식히십시오. 접시 교반기에 병을 놓고 속도를 500rpm, 시간을 30분, 온도를 실온으로 설정합니다.
  3. 전기 방사를 위해 5mL 주사기를 사용하고, 배럴에서 플런저를 분리하고, 배럴 내부와 플런저 끝부분의 작은 플라스틱 파편을 청소합니다.
  4. 바늘을 사용하여 액체 흐름을 차단한 다음 PVA 용액을 각 배럴에 붓습니다(용량: 각 2.5-3mL). 플런저를 조립한 다음 바늘을 제거합니다.
    참고: 용액에 거품이 있을 수 있으므로 거품이 사라질 때까지 기다립니다. 10-30분 정도 걸립니다.
  5. 새로운 27G 금속 바늘을 조립한 다음 전기 방사기에 넣습니다.
  6. 수집기를 호일로 잘 감쌉니다.
  7. 인젝터 패널을 원래 위치로 되돌립니다. 기계에 대해 다음 설정을 사용하십시오: (각 펌프) 주입량: 2mL, 주입 속도: 6μL/분, 롤러 속도: 100rpm, 팁에서 수집기까지의 거리: 14cm. 각 펌프의 액체 흐름을 확인하십시오.
  8. 약 12kV의 전위로 기계를 가동하십시오.
  9. 습도가 처음에는 40 - 50%이고 프로세스 끝에는 25 - 30%인지 확인하십시오. 습도가 낮아지면 가습기를 사용하고 전기방사 전날 기계 내부에 증류수가 담긴 접시를 넣어 습도를 높이십시오.
    참고: 이것은 PVA 나노섬유의 성공적인 제조에 중요한 요소입니다.
  10. 흐름을 정기적으로 확인하십시오. 바늘이 막히면 기계를 일시적으로 정지하십시오. 실험실용 물티슈를 사용하여 방울을 제거하고 새 방울이 나타날 때까지 기다립니다. 그렇지 않은 경우 바늘을 교체 한 다음 기계를 계속 실행하십시오.
  11. PVA 나노섬유 제조 공정은 완료하는 데 ~6시간이 걸립니다. 전기 방사 공정이 끝나면 수집기에서 섬유 매트가 포함된 호일을 분리하고 나노 섬유 매트를 진공 상태에서 건조제에 보관합니다.

2. PVA 나노섬유막을 염산(HCl) 증기로 처리 및 섬유 품질 평가

참고: PVA NM의 물 안정성은 HCl 증기에 의한 사후 가교 반응 후에도 잘 보존됩니다. 이 공정은 NM의 적절한 두께, 기공 크기 및 거칠기에 최적화되어 있습니다. PVA는 친수성이 매우 높은 폴리머이며 전기 방사 PVA 나노 섬유는 물 접촉 및 습한 조건에서 불안정합니다. PVA NM은 PVA 폴리머 제조 직후 HCl 증기로 처리해야 합니다.

  1. 나노섬유 매트를 트랜스웰 인서트에 대해 원하는 크기의 조각으로 자릅니다.
  2. 1.5mL의 순수 HCl이 들어 있는 작은 접시를 준비합니다. HCl이 들어 있는 접시와 나노섬유 조각을 진공 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다.
    참고 : HCl 증기는 나노 섬유를 방수 상태로 만들기 위해 postcrosslink 제로 사용됩니다.
  3. 진공 펌프에 연결된 밸브를 열고 HCl 연기가 올라갈 때까지 10초 동안 기다린 다음 밸브를 닫습니다. 2분 동안 HCl 흄으로 멤브레인을 처리합니다.
  4. HCl 증기로 처리 한 후 멤브레인에 증류수 (DW)를 몇 방울 떨어 뜨리고 유리 슬라이드에 올려 놓고 호일에서 멤브레인을 제거합니다. 20분 동안 공기 건조한 후 멤브레인이 슬라이드에 자연스럽게 달라붙습니다.
  5. 오토스퍼터 코팅기를 사용하여 탄소 테이프에 얇은 금 층으로 멤브레인을 코팅합니다. 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 얻을 수 있습니다.
  6. PVA NM을 HCl과 가교결합한 후 1x PBS로 3x 세척하고 배양 배지에 담근 후 pH를 확인하여 잔류 HCl이 없는지 확인합니다.

3. PCL 나노섬유 제작 및 나노섬유 품질평가

  1. PCL 1.5g의 무게를 달아 깨끗한 유리병에 넣으십시오. 병에 클로로포름 8.5mL를 넣고 병을 플레이트 교반기에 놓고 실온에서 12시간 동안 PCL을 클로로포름에 녹입니다.
  2. 1.7 및 1.8 단계를 제외하고 1.3-1.9 단계를 반복하고 주입 속도를 8 μL/min으로 설정하고 전압을 17.5 kV로 설정합니다.
    참고: PCL 제작은 완료하는 데 ~3.5시간이 걸립니다.
  3. 멤브레인의 작은 조각을 자르고 5분 동안 자동 스퍼터 프로세스로 조각을 코팅합니다. SEM 이미지를 얻습니다.

4. 트랜스웰(trans-well)에서 두 층의 멤브레인 조립

참고: 이 프로토콜에서는 24웰 플레이트와 해당 인서트 웰을 사용합니다. PVA NM은 인서트 웰에 부착되고 PCL NM은 하단 웰에 부착됩니다.

  1. 나노섬유 매트를 PVA 및 PCL NM의 경우 각각 10mm 및 13mm 직경의 둥근 조각으로 자릅니다.
  2. 폴리디메틸실록산(PDMS) Sylgard 184를 접착제로 사용하여 멤브레인을 인서트와 챔버 웰에 부착합니다. 사용하기 전에 Sylgard 184 Base(파트 A)와 경화제(파트 B)를 플라스틱 컵에 10:1 질량 비율로 혼합하십시오. 깨끗한 유리 슬라이드를 사용하여 전체 혼합물이 기포로 채워질 때까지 2-3분 동안 PDMS 용액을 격렬하게 혼합합니다. 사용하기 전에 거품이 형성되고 10분 동안 사라지게 하십시오. 한편, 슬라이드를 100°C로 예열합니다.
  3. PDMS를 유리 슬라이드에 펴고 인서트의 하단 가장자리를 PDMS에 약간 담그십시오. PDMS가 경화될 수 있도록 인서트를 슬라이드 워머에 거꾸로 잘 유지하십시오(~10-15분). 200μL 팁으로 PDMS가 끈적거리지 않는지 주의 깊게 확인하십시오.
  4. 2.2-2.4단계에 설명된 대로 PVA NM 조각을 처리합니다.
  5. 인서트 웰의 바닥이 멤브레인 피스의 나노 섬유 면을 향하도록 인서트 웰을 PVA NM 피스에 부드럽게 누릅니다. 우물 중앙에 증류수 한 방울을 넣고 집게를 사용하여 호일을 제거합니다. 새 24웰 플레이트에 인서트를 잘 넣고 멤브레인을 건조시킵니다.
  6. PCL NM 조각을 하단 웰에 부착할 때 200μL 팁을 PDMS 혼합물에 담그고 네 모서리와 중앙에 정확하게 점을 찍어야 합니다.
  7. 플레이트를 슬라이드 워머에 놓고 PDMS가 5-7분 동안 경화되어 어셈블리의 품질을 보장합니다.
  8. PCL NM 조각을 PDMS 함유 웰에 넣고 멤브레인의 나노섬유 면을 PDMS에 부착합니다. 작고 깨끗한 브러시를 사용하여 멤브레인 조각의 호일 면을 약간 눌러 완전히 부착합니다. 호일을 쉽게 제거할 수 있도록 웰에 0.2mL의 70% 에탄올을 추가합니다.
  9. 밤새 자외선 아래에서 트랜스 웰 설정에서 인서트와 바닥을 잘 소독하십시오.
    참고: 혼합 PDMS는 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 주의: PCL 나노 섬유막 부착 플레이트는 건조하게 보관할 수 있지만 사용하기 전에 70% 에탄올로 적셔야 합니다.
  10. 다음 날, 3 x 10분 동안 200μL 및 500μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 각각 첨가하여 인서트와 바닥을 잘 세척합니다. 인서트와 바닥 웰을 사용할 준비가 되었습니다.

5. 공동 배양 모델을 위한 두 층의 세포 파종 및 조립

참고: MLE-12 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제와 함께 1x Dulbecco의 DMEM/F12에서 배양되었습니다. NIH3T3 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 사용하여 1x DMEM 고포도당에서 배양되었습니다.

  1. 150mm 배양 접시에 세포를 유지합니다. 70-80% 농도가 되면 10mL의 1x PBS로 세포를 세척하고 37°C에서 3분 동안 예열된 0.05% 트립신/EDTA 용액 2mL로 트립신화합니다.
  2. 접시를 부드럽게 두드려 바닥에서 세포를 제거한 다음 각 유형의 세포에 8mL의 완전 배양 배지를 추가하여 트립신 효소를 중화합니다. 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 400× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. Cell-Tracker로 세포를 염색하여 NM에서 파종된 세포의 분포를 관찰합니다(자세한 내용은 섹션 6 참조).
  3. 세포 펠릿을 5mL의 완전한 DMEM/F12 배지에 재현탁합니다. 세포 수를 결정하고 6 × 106 MLE-12 cells/mL 및 8 × 105 NIH3T3 cells/mL로 조정합니다.
    참고: 완전한 DMEM/F12 배지는 MLE-12 및 NIH3T3 세포와의 공동 배양에 사용됩니다.
  4. 바닥 웰을 500μL의 완전한 DMEM/F12 매체(PCL이 없는 웰)로 채웁니다. PVA 나노섬유막 부착 삽입물을 트랜스웰로 옮기고 50μL의 MLE-12 세포 현탁액을 첨가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 세포를 배양합니다.
  5. 동시에 PCL 나노섬유막이 부착된 바닥 웰에 500μL의 NIH3T3 세포 현탁액을 채우고 37°C 및 5% CO2에서 세포를 배양합니다.
  6. 2시간 후 트랜스웰 설정에서 MLE-12 세포 함유 인서트와 NIH3T3 세포 함유 하단 웰을 조립합니다. 이것은 MLE-12 세포를 상층으로, NIH3T3 세포를 하층으로 하는 공동 배양 모델입니다. 원하는 시간 동안 2층 멤브레인에서 세포를 공동 배양합니다.

6. 세포 분포 분석

  1. 총 2mL의 완전한 DMEM/F12 배지에 5μM의 Cell-Tracker 적색 및 녹색 용액을 준비합니다.
  2. 트립신화 후 MLE-12 세포를 이전에 준비된 Cell-Tracker 적색 용액과 혼합하고 NIH3T3를 Cell-Tracker 녹색 용액과 혼합합니다. 최적의 세포 라벨링을 보장하기 위해 30분 동안 37°C 및 5% CO2 에서 세포를 배양합니다. 샘플에 완전한 DMEM/F12 배지 8mL를 추가하고 400 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    참고: Cell Tracker는 세포 생존율 및 증식에 영향을 미칠 수 없습니다. 따라서 Cell-Tracker 염색 세포는 합류할 때까지 배양할 수 있습니다. 염색된 세포의 형광 강도는 배양 후 4-5일 후에 감소할 수 있습니다.
  3. 5.3-5.6단계를 반복합니다.
  4. 컨포칼 현미경으로 관찰하면서 인서트 웰을 24웰 플레이트에서 12웰 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 이렇게 하면 대물 렌즈와 세포 사이의 거리가 최소화되어 세포 형태를 관찰할 수 있습니다.

7. 3D 공동 배양 세포의 컨포칼 관찰

참고: PVA NM에 대한 상피 세포의 부착은 PCL NM에 대한 섬유아세포의 부착에 비해 약합니다. 피펫 흡인에 의해 오래된 매체를 수동으로 폐기하고 새 매체 또는 용액을 웰 벽에 부드럽게 추가합니다. 염색 과정에서 멤브레인이 건조되지 않도록 하십시오.

참고: 세포 부착은 라미닌을 코팅하거나 PVA 나노섬유에 인테그린 결합 모티프의 펩타이드를 통합함으로써 개선될 수 있습니다19.

  1. 인서트를 새 24웰 플레이트로 옮깁니다. 기존 배지를 버리고 150μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  2. 4% PFA 용액을 제거하고 부착된 세포를 150μL의 1x PBS로 세척합니다.
  3. 차단 및 투과를 위해 1x PBS에 희석된 5% 일반 염소 혈청 150μL와 0.2% Triton X-100을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  4. Alexa Fluor 594-conjugated anti-zona occludens Ab (1:400) 및 Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000)을 항체 희석제 시약에 희석하여 준비합니다. 차단 용액을 제거하고 웰당 150μL의 형광단 용액을 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 항체 용액은 결과의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 최대한 정밀하게 준비하십시오. 빛에 노출되지 않도록 하십시오.
  5. 항체 용액을 버리고 150μL의 1x PBS로 10분 동안 세포를 세척합니다.
  6. 1x PBS (1 : 1,000)에 희석 된 Hoechst 33342 150 μL를 넣고 10 분 동안 배양합니다. 빛에 노출되지 않도록 하십시오.
  7. Hoechst 33342 용액을 제거하고 부착된 세포를 150μL의 1x PBS로 10분 동안 세척합니다.
  8. 깨끗한 유리 슬라이드를 준비하고 정확한 양의 수성 장착 젤을 첨가하십시오. 끝이 뾰족한 집게를 사용하여 주변 가장자리에서 멤브레인을 섬세하게 분리합니다. 마운팅 젤에 멤브레인을 놓고 세포가 포함된 면이 위를 향하도록 합니다. 정확한 양의 마운팅 젤을 넣고 커버 슬라이드로 덮습니다. 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하여 정확하고 완전한 밀봉을 보장합니다.
  9. 다음 이미징 설정을 사용하여 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다. 레이저 출력 제어: 405 Intensity 10; 레이저 출력 제어: 488 강도 10; 레이저 출력 제어: 561 강도 10; 검출기 감도 : 420LP (600 값); 검출기 감도 : 525/50 (700 값); 검출기 감도: 561LP(750 값).

8. 나노 섬유에 대한 세포 부착 분석

  1. 기존 배지를 버리고 150μL의 1x PBS로 세포를 세척합니다.
  2. 실온에서 1시간 동안 1x PBS에 희석된 150μL의 3% GA로 셀을 고정합니다.
  3. 10분 내에 150μL의 1x PBS로 세포를 세척합니다.
  4. 1x PBS에 희석된 1% 사산화오스뮴(OsO4) 150μL를 1시간 동안 첨가하여 세포를 2차적으로 고정합니다.
    주의 : OsO4 와 그 증기는 유해합니다. 흄 후드에 사용해야 합니다.
  5. 용액을 버리고 300μL의 1x PBS로 2 x 10분 동안 세포를 세척합니다.
  6. 각 단계에서 10분 동안 50%, 70%, 90%, 95%에서 100%까지 등급이 매겨진 에탄올로 세포를 탈수합니다. 100분 동안 신선한 100% 에탄올을 추가하여 마지막 탈수 단계를 수행합니다.
  7. 세포와 막을 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. 끝이 뾰족한 집게를 사용하여 멤브레인을 분리하고 양면 탭을 사용하여 멤브레인을 표본 홀더에 놓습니다. 2,000x 배율에서 SEM 하의 세포를 관찰하기 전에 5분 동안 이온 스퍼터링을 수행합니다.

9. 세포 성장 분석

참고: 이 프로토콜에서 CCK-8 분석은 제조업체의 지침에 따라 세포 성장률을 정량화하는 데 사용됩니다.

  1. 예열된 DMEM/F12 9부(부피 기준)와 CCK-8 시약 1부를 혼합하여 CCK-8 혼합물을 준비합니다. 오래된 배양 배지를 제거한 후 세포 함유 웰에 CCK-8 혼합물 150μL를 첨가합니다.
  2. 인서트를 새로운 24웰 플레이트로 옮겨 세포가 들어 있는 하단 웰에서 분리합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 45 분 동안 세포를 배양합니다.
  3. 상층액을 모아 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 1,800 × g 에서 3분 동안 원심분리기
  4. 마이크로 원심분리 튜브의 상층액 100μL를 96웰 플레이트에 추가합니다. 450nm에서 광학 밀도(OD)를 판독합니다.

결과

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이 프로토콜은 나노 섬유막 기반 2층 모델을 구축하여 MLE-12 폐 상피 세포와 NIH3T3 섬유아세포를 공동 배양하기 위한 중요한 단계를 간략하게 설명합니다(그림 1). 이 모델은 공동 배양된 세포의 라이브 셀 이미징, 면역조직화학 및 종말점 정량 분석에 적합합니다. 다른 세포 유형은 또한 세포 밀도 및 성장 조건을 최적화함으로써 활용될 수 있습니다.

SEM은 비드 형성 없이 제작된 PVA 나노섬유의 균일한 분포를 보여줍니다(그림 2A). PVA 나노 섬유의 직경은 150nm에서 230nm (180 ± 25 nm, 평균 ± 표준 편차 (SD)) 범위였습니다. 전기방사 PCL NM의 나노섬유는 무작위 배향을 가졌으며 구조적으로 콜라겐과 유사했습니다(그림 2B). PCL NM의 대부분의 섬유는 직경이 300nm에서 7μm(3.8± 2.5μm) 사이였습니다. 따라서 PVA 나노 섬유막은 PCL 나노 섬유막보다 기공 크기가 작았습니다.

파종 전에 MLE-12 및 NIH3T3 세포를 각각 Cell-Tracker 빨간색과 녹색으로 염색하고 공동 배양 과정 전반에 걸쳐 모니터링했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 삽입 챔버의 MLE-12 세포와 하부 챔버의 NIH3T3 세포의 공간 분포를 뚜렷하게 관찰할 수 있었습니다. 포커스 스태킹 분석은 NIH3T3 세포가 다양한 깊이(102 ± 20μm)에서 분산 및 검출된 반면 MLE-12 세포는 80 ± 10μm 두께의 층을 형성한 것으로 나타났습니다. SEM은 세포막에 세포가 부착되어 있음을 보여줍니다. NIH3T3 세포는 PCL 나노섬유막에 침투하여 나노섬유 축을 따라 확장되는 반면, MLE-12 세포는 PVA 나노섬유막의 표면에 부착되어 응집을 나타냈습니다(그림 4). 다음으로, 액틴 염색을 통해 NIH3T3 세포와 MLE-12 세포의 세포골격 조직을 조사했습니다. PCL 나노섬유막에서 배양된 NIH3T3 세포는 조직 내 세포와 유사한 액틴 필라멘트의 발사체 분포를 보여주며, PVA 나노섬유막에서 배양된 MLE-12 세포의 액틴 염색은 세포 확산이 없는 둥근 응집체를 보여줍니다(그림 5).

단일배양(monoculture)과 공동배양(coculture)에서 MLE-12 세포의 분포 및 성장 패턴을 비교하였다. PVA NM에서 단일배양에서 Cell-Tracker 적색 염색 세포는 응집체를 형성했지만 공동 배양 상태의 세포는 멤브레인에서 균일한 분포를 유지했습니다(그림 6A). 컨포칼 현미경 이미지의 3D 분석에서 PVA NM에서 공동 배양된 MLE-12 세포의 성장 패턴은 섬유아세포가 없는 상태에서 배양된 세포에 비해 더 많은 융합 세포 밀도로 배양된 세포가 멤브레인에 층상 접착하는 것을 보여줍니다(그림 6B). 또한, 세포 응집체가 아닌 세포 표면(화살표로 표시)에서 세포 간 접착 및 구역 오클루딘(ZO)-1의 발현은 섬유아세포가 없는 배양에서보다 공동 배양 조건에서 더 분명했습니다(그림 6C).

멤브레인 상의 세포 증식은 CCK-8 분석을 사용하여 측정했습니다. NIH3T3 및 MLE-12 세포 증식은 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 7). 그러나 배양 플레이트보다 멤브레인에서 세포의 성장 속도가 더 낮게 관찰되었습니다(데이터는 표시되지 않음). NM에서 공동 배양된 NIH3T3 및 MLE-12 세포는 배양 플레이트에서 단일배양된 세포에 비해 안정적인 성장률을 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: 스캐폴드 기반 2층 시스템에서 NIH3T3 섬유아세포 및 MLE-12 상피 세포 공동 배양 방법을 설명하기 위한 개략도. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: PVA 및 PCL 나노섬유의 구조. (A) PVA 및 (B) PCL 나노섬유막은 전기방사에 의해 생산되었습니다. 나노 섬유의 구조와 직경은 멤브레인 표면의 SEM으로 측정됩니다. 스케일 바 = 1μm(A), 10μm(B). 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 공동 배양 시스템에서 PCL 나노 섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노 섬유막의 MLE-12 세포의 공간 분포. NIH3T3 세포(4 × 105)는 Cell-Tracker Green으로 염색하고, MLE-12 세포(3 × 105)는 Cell-Tracker Red로 염색했습니다. 파종된 세포를 24시간 동안 배양하고 컨포칼 현미경의 Z-적층 이미지를 사용하여 관찰했습니다. 숫자는 μm로 표시됩니다. 화살표는 X(너비), Y(길이), Z(깊이)로 치수를 표시합니다. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: PCL 나노섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노섬유막의 MLE-12 세포의 접착 및 형태. 세포를 24시간 동안 멤브레인에서 배양하고 2,000배 배율에서 SEM을 사용하여 관찰했습니다. 스케일 바 = 15μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: PCL 나노섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노섬유막의 MLE-12 세포의 액틴 스트레스 섬유. NIH3T3 세포(4 × 10,5) 및 MLE-12 세포(3 × 10,5 세포)를 각각 PCL 및 PVA 나노섬유막에 파종했습니다. 48시간 배양 후, 세포를 phalloidin-iFlour 488로 염색하고 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰했습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리 (ε-카프로 락톤); FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: PVA 나노섬유막에서 공동배양된 MLE-12 세포의 성장 패턴. (A) Cell-Tracker 적색 염색 MLE-12 세포(3 × 105 개 세포)를 PVA 나노섬유막에 파종하고 단독(-NIH3T3 세포) 및 NIH3T3 세포와 함께 2층 시스템(+NIH3T3 세포)에서 48시간 동안 배양했습니다. (B) 48시간 동안 단일배양 및 공동 배양된 MLE-12 세포를 Hoechst 33342(파란색) 및 Phalloidin-iFlour 488로 염색하고 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰했습니다. 3D 이미지는 Imaris 소프트웨어의 표면 기능을 사용하여 표시됩니다. (C) MLE-12 세포를 48시간 동안 배양하고 Phalloidin-iFlour 488 및 anti-ZO-1 항체(빨간색)로 형광 표지했습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 2층 공동 배양 시스템에서 세포의 성장 속도. NIH3T3 세포(4 × 10,5) 및 MLE-12 세포(3 × 10,5)를 표시된 시간 동안 공동 배양합니다. 인서트 및 하단 웰의 세포 성장은 CCK-8 분석을 사용하여 측정합니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2D 배양에서 3D 배양 모델로의 전환은 체외 공동 배양 모델 개발의 중요한 진전을 나타냅니다. 3D 배양 모델은 세포가 증식, 응집 및 분화할 수 있는 조직 미세환경을 모방해야 합니다22. 골격 기반 3D 공동 배양 모델을 사용하면 조직 구조의 복제가 향상됩니다. 본 연구에서는 NM 기반 트랜스웰(trans-well) 시스템이 두 가지 유형의 세포에 대한 간접 3D 공동 배양을 제공합니다. 하부 챔버에 큰 기공이 있는 PCL NM은 세포 침투를 허용하고 간질 매트릭스를 모방합니다. 이 골격은 섬유아세포의 성장과 공간 조직을 지원합니다. 상부 챔버에 PVA 나노 섬유막을 사용하면 층에 MLE-12 상피 세포를 형성할 수 있습니다. PVA 나노 섬유막의 직경과 기공 크기는 상피 조직의 기저막에 있는 상피 세포를 모방하는 상피 세포의 접착 및 성장을 지원하는 데 이상적인 기질입니다19.

피브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)과 같은 세포 접착 단백질(cell-adhesive protein)은 세포를 콜라겐 원섬유(collagen fibril)와 연결하는 ECM의 핵심 단백질입니다23. 상피 세포는 표면의 인테그린 수용체(integrin receptor)를 통해 라미닌(laminin)과 상호 작용한다18. PVA NM에 파종된 MLE-12 세포는 멤브레인에 부착되어 3차원으로 성장했습니다. 그러나 다공성 PVA NM에 대한 상피 세포 결합이 낮았으며, 배양된 세포와 상호 작용하는 특정 생물학적 모티프가 없기 때문에 응집이 발생했습니다. 당사의 공동 배양 시스템에서는 NIH3T3와 MLE-12 세포 간의 직접적인 세포 간 접촉이 없으며 통신은 부분비 신호 전달을 통해서만 발생합니다. 공동 배양된 NIH3T3 세포의 존재는 배양 기간 동안 MLE-12 세포의 멤브레인에 대한 부착을 안정화할 수 있습니다. 이러한 안정화는 섬유아세포에 의한 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 다양한 성장인자(growth factor)를 포함한 용해성 인자의 분비에 기인할 수 있다24. 이에 비해, PCL 나노섬유성 골격에서 섬유아세포와 암세포를 직접 공동 배양하는 종양 모델에서, 섬유아세포는 매트릭스 리모델링을 통해 ECM의 특성을 변화시킨다25.

상피 세포는 성장 지지대 및 선택적으로 투과성 층 역할을하는 기저막에 있습니다. 현재 상피 조직의 3D 복합 모델을 생성하기 위해 오가노이드 기술을 포함한 여러 기술 전략이 개발되고 있습니다26. 그러나 오가노이드 구조는 기존 분석법의 사용을 방해합니다27. 또한 실험 데이터 수집을 위한 기존 현미경은 오가노이드가 3D 하이드로겔 매트릭스에 내장된 동안 배양된다는 사실로 인해 복잡합니다27. 이 연구에서는 PVA NM에서 배양된 상피 세포의 정확한 관찰을 용이하게 하기 위해 삽입 챔버를 낮은 챔버와 분리했습니다. 또한 3D 오가노이드는 줄기세포의 분화에 의해 생산됩니다. 따라서, 줄기세포를 배양하는 것은 코컬쳐링 시스템에 비해 시간이 오래 걸리고 복잡한 절차이며, 오가노이드의 이질성이 보고되고 있다28.

단일배양과 비교했을 때, 상피세포와 섬유아세포의 공동배양은 골격에 대한 접착력을 향상시키고 배양된 상피세포의 안정적인 성장과 기능을 유지합니다. 또한, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 보조 물질은 공동 배양된 섬유아세포에 의해 분비되는 수용성 인자로 인해 배양 배지에 필요하지 않습니다. 구조적 지지를 제공하여 세포 공동 배양에서 나노 섬유 스캐폴드를 사용하는 장점에도 불구하고, 생체 적합성 하이드로겔에 비해 배양 세포를 둘러싼 ECM을 제공할 수 없습니다29. 따라서, 이러한 제한은 과층된 하이드로겔이 있는 NM 상의 세포를 사용하여 달성할 수 있습니다.

결론적으로, 섬유아세포와 상피세포의 동시 배양을 위한 간단한 삽입 공동 배양 시스템은 상피 조직 재생, 종양 미세환경, 독성 분석 및 약물 활성 테스트를 포함한 다양한 생리학적 및 약리학적 맥락에서 매우 중요합니다. 나노 섬유막 기반 3D 공동 배양 시스템은 고처리량 약물 흡수 및 수송 스크리닝 연구를 위해 계측 및 설계될 것입니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 대한민국 보건복지부(HR16C0001)의 자금 지원을 받는 한국보건산업개발연구원(KHIDI)을 통한 한국보건기술연구개발사업(Korea Health Technology R&D Project)의 보조금으로 지원되었다. 교육부 한국기초과학연구원(국가연구시설장비센터) 보조금을 통한 기초과학 연구역량 강화 사업 (2019R1A6C1010003) 한국연구재단(NRF) 보조금 지원 대한민국 정부(MSIT) (2022R1A4A5032702).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% 트립신/EDTA웰진LS015-01
100x 페니실린/스트렙토마이신Gibco10378016
20x PBSLPS 용액CBP007A
4% 파라포름알데히드BiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 접합 ZO-1 항체Invitrogen339194
항체 희석제 OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 분석 키트DonginbioCCK-3000
세포 배양 접시 (150x20)SPL20151
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Red CMTPXInvitrogenC34552
클로로포름삼춘C0584
원추형 튜브SPL50050
커버 유리CorningCLS2980245
DMEM 고포도WelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN 데시케이터 베이스, 평면 플랜지, 나사 스레드DWK Life Sciences 7.022 260
DURAN 유리 데시케이터 뚜껑 및 스톱콕Daihan ScienceSM.2444061
DURAN 스톱콕, PTFE 스핀들 포함DWK Life Sciences 
전기회전 기계NanoNCESR200RD
에틸 알코올, 순수시그마 알드리치459844
FBS시그마 알드리치TMS-013-BKR 
형광 레이저 컨포칼 스캐너 모듈 K1-fluo나노스코프 시스템
젤/마운트Biomeda Corp.M01
글루타르알데히드 용액시그마 알드리치340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
금속 노즐 27GNanoNC
매니큐어네이처 리퍼블릭
일반 염소 혈청Vector LaboratoriesS-1000
오스뮴 테트록사이드시그마 알드리치201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
플라스틱 Syringe_Lure 자물쇠 (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poly(아크릴산)Sigma Aldrich323667
Poly(비닐 알코올)Sigma Aldrich341584
PolycaprolactoneSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
주사 전자 현미경SECSNE-4500M
슬라이드 유리Marienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 다중 모드 리더Biotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
당 10322671

참고문헌

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