지주막하 출혈의 혈관내 천공 쥐 모델을 위한 단순화된 수술

요약

여기에서는 신경학적 점수 매기기와 결합된 지주막하 출혈의 혈관 내 천공 쥐 모델에 대한 단순화된 작업을 제시합니다.

초록

혈관내 천공 모델은 일반적으로 실험 연구에서 지주막하 출혈(SAH)을 시뮬레이션하는 방법으로 사용됩니다. 그 자체로 포괄적이고 신뢰할 수 있지만 복잡한 기술이 필요합니다. 이 프로토콜은 신경학적 점수 매기기와 결합된 모델을 다소 세부적으로 단순화합니다. 우리는 나일론 봉합사를 사용하여 총경동맥(CCA)을 고리 모양으로 하고 당겨 명확한 수술 영역을 제공하는 기존 결찰술 외에 일시적으로 혈류를 차단합니다. 전기 소작 펜을 사용하여 혈관을 융합하면 출혈 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 펑크의 깊이를 쉽게 결정할 수 있도록 블랙 마크가 있는 필라멘트를 사용합니다.

총경동맥(CCA)이 내경동맥(ICA)으로 분기하는 경동맥 분기점을 지나 블랙 마커가 최소한의 저항을 동반하며 방해받지 않는 전진은 필라멘트가 전대뇌동맥(ACA)과 중대뇌동맥(MCA)의 두개내 접합부까지 성공적으로 횡단했음을 나타냅니다. 이 현상은 필라멘트가 중요한 뇌혈관 수렴점에 위치한다는 것을 의미합니다. 그런 다음 필라멘트를 약간 앞으로 전진시켜 혈관에 구멍을 뚫으면 마우스의 혈관 내 천공을 더 쉽게 조작할 수 있으므로 유전자 변형 마우스에서 혈관 내 천공 모델의 적용을 용이하게 합니다. 이는 분자 연구 및 제약 연구 및 개발에 매우 중요할 수 있습니다.

서론

뇌졸중의 중증 아형인 지주막하 출혈(SAH)은 특히 50대 중반의 사람들에게 영향을 미치는 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 자발적 SAH는 주로 두개내 동맥류의 파열로 인해 발생하며, 이는 주로 Willis ^1,2의 서클에서 발생합니다. 임상적으로 환자는 종종 벼락같은 두통, 신경학적 기능 장애, 급격한 의식 저하를 보인다³. 신경 중환자 치료의 발전에도 불구하고 거의 40%의 환자가 출혈 후 한 달 이내에 사망합니다⁴. 동맥류 SAH 후 몇 가지 2차 합병증이 발생할 수 있으며, 이는 진행성 신경학적 악화로 이어집니다. 그러나 SAH의 병태생리학 및 임상적 특성은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다.

따라서 근본적인 메커니즘을 더 잘 이해하고 치료 전략을 개선하기 위해서는 소동물에 대한 포괄적이고 신뢰할 수 있는 모델이 필수적입니다. 현재까지 SAH 모델을 확립하기 위한 수많은 프로토콜이 제시되었습니다. 예를 들어, 한 가지 방법은 수조 마그나에 자가 혈액을 주입하는 것입니다. 또 다른 수정된 프로토콜은 두 개의 별도 주사를 수반하는데, 하나는 수조 마그나에, 다른 하나는 시신경 키아스 수조에 주입합니다. 자가 혈액 주입은 기술적 단순성과 유리한 사망률로 인해 널리 채택되었습니다 ^5,6. 더 작고 저렴한 실험실 동물을 사용할 수 있는 가능성을 달성하기 위해 Barry et al.은 1979년 두개골을 제거한 후 텅스텐 미세 전극으로 기저 동맥을 뚫는 것과 관련된 쥐에 대한 최초의 SAH 모델을 설명했습니다⁷.

1995년, 뇌허혈의 Zea-Longa 모델의 수정된 버전인 또 다른 혈관내 천공 모델이 발표되었으며, 현재 형태는 나중에 SAH⁸을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델로 판명되었습니다. 이전 연구에서는 생쥐와 인간이 두개내 동맥류가 주로 발생하는 윌리스(Willis)의 원(circle of Willis)이라고 하는 유사한 두개내 혈관 구조를 가지고 있음을 보여주었다⁹. 이 비개두술(non-craniotomy) 방법은 정밀한 ICA 분기 천공¹⁰을 통해 인간 동맥류 파열 메커니즘을 복제합니다. 또한, 유전자 변형 마우스는 분자 메커니즘 연구에 자주 사용됩니다. 그러나 작은 동물에 대한 복잡한 기술로 인해 혈관 내 천공 모델은 주로 쥐나 토끼에서 사용되는 반면 마우스에 적용하는 경우는 비교적 흔하지 않습니다. 따라서 혈관내 천공 쥐 모델을 단순화하고 높은 폐사율을 줄이는 것이 매우 중요합니다.

여기에서는 Garcia 신경학적 평가 척도¹¹의 수정된 버전을 통합하여 혈관내 천공 쥐 모델의 단순화된 변형을 제시합니다. 당사의 수정은 SAH의 향후 실험 연구를 위한 쉽고 편리하며 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.

프로토콜

특정 병원체가 없는 C57BL/6 수컷 마우스(6-8주령)를 12시간 명암 주기로 유지된 조절된 온도 및 순응 조건의 동물 시설에 보관했습니다. 쥐에게는 표준 설치류 식단과 살균된 수돗물을 무제한으로 제공받았습니다. 실험 시작 전에 2주간의 순응 기간이 허용되었습니다. 동물과 관련된 모든 절차는 룽화병원 동물윤리위원회의 승인을 받았으며 실험동물 관리 및 사용에 대한 중국 국가과학기술위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 준비

1. 37°C로 예열된 가열 패드에 마우스를 놓고 수술이 완료될 때까지 이 온도를 계속 유지합니다.
2. 2-2.5% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 0.4-0.6 L / min의 유속으로 작동하는 동안 1-1.5 % 이소 플루 란으로 유지하십시오.
3. 수술대 위에 마우스를 놓고 머리를 안정시키고 누운 자세를 유지하고 팔다리를 테이프로 고정합니다.

2. SAH 유도

1. 앞쪽 목 중앙을 따라 가위로 피부를 절개합니다(그림 1A).
2. 결합 조직을 절개하고 좌측 총경동맥(CCA)과 그 분기점을 노출시킵니다.
   참고: 미주신경과 인접한 땀샘을 조심스럽게 보호하십시오(그림 1B).
3. CCA를 6-0 나일론 봉합사로 고리를 만들고 접합 없이 양쪽 끝을 자유롭게 둡니다(그림 1C).
4. 봉합사의 양쪽 끝을 테이프에 연결하고 봉합사를 수평면에 대해 45° 각도로 아래쪽과 오른쪽으로 부드럽게 당깁니다. CCA를 임시로 차단하기 위해 테이프를 수술대에 고정합니다(그림 1D).
   참고: 폐색된 혈관 내의 혈류가 실처럼 변하면 성공적인 폐색을 나타냅니다.
5. 나일론 봉합사로 외부 경동맥(ECA)을 결찰합니다(그림 1E).
   참고: 소작 부위는 경동맥 분기점에서 약 2mm의 길이로 가능한 한 상단에 가까워야 합니다.
6. 전기소작 펜을 사용하여 ECA를 결찰 부위의 원위부에 융합합니다(그림 1F).
7. 내부 경동맥(ICA)이 노출될 때까지 ECA를 천천히 아래쪽으로 당깁니다. ECA와 ICA를 일직선으로 정렬하여 다음 절차를 위한 적절한 위치를 확인합니다(그림 1G).
8. 필라멘트의 상단을 날카롭게 합니다. 필라멘트의 마크 포인트는 상단에서 8mm 떨어진 곳에 있습니다.
9. ECA에 필라멘트를 삽입하기 위해 가위로 작게 절개합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 필라멘트를 삽입합니다(그림 1H).
10. 블랙 마크가 CCA와 ICA의 분기점을 완전히 통과할 때까지 집게로 필라멘트를 조심스럽게 전진시킵니다. 혈관에 구멍을 뚫기 위해 2mm 약간 전진합니다(그림 1I).
    참고: 상당한 저항이 느껴지며, 이는 전대뇌동맥(ACA)-중대뇌동맥(MCA) 분기점에 도달했음을 나타냅니다.
11. 천공 직후 필라멘트를 집어넣습니다.
12. 전기소작 펜을 사용하여 ECA를 융합합니다(그림 1J).
13. 테이프를 제거하고 CCA의 나일론 봉합사를 빼내면 혈류가 회복됩니다. CCA의 명백한 맥동을 관찰합니다(그림 1K).
14. 5-0 흡수성 봉합사로 목 절개 부위를 봉합합니다.

3. 가짜 그룹

1. 가짜 그룹에서는 필라멘트가 ICA에서 부분적으로 전진하고 구멍을 뚫지 않고 빼내는 것을 제외하고는 동일한 외과 수술을 수행합니다¹².

4. 실험 종료

1. 수술 후 24시간 후, Sugawara et ^al.11(원본 Garcia et ^al.13)이 보고한 채점 시스템의 수정된 버전에 따라 신경학적 성능을 평가합니다. 다음 6가지 평가를 맹검 방식으로 수행합니다: 자발적인 활동, 모든 팔다리의 움직임, 앞다리의 움직임, 철봉 벽 오르기, 몸통 양쪽의 접촉에 대한 반응, 진동 자극에 대한 반응. 행동 점수 표를 사용하여 신경학적 기능을 평가합니다(표 1).
2. 흡입된 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 마우스를 누운 자세로 놓고 테이프로 수술대에 고정하여 팔다리를 고정합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 복부의 정중선을 따라 절개하고 복벽을 잘라 흉강을 노출시킵니다. 흉골을 조심스럽게 잘라 심장을 드러냅니다.
3. 주입 바늘을 좌심실에 조심스럽게 삽입하여 바늘이 안정적이고 심장을 관통하지 않도록 합니다.
4. 유출되는 액체가 투명하고 투명해질 때까지 적절한 유속(약 10mL/분)으로 사전 냉각된 1x PBS(4°C)로 관류를 시작하여 혈액이 완전히 교체되었음을 나타냅니다.
5. 관류가 완료되면 주입 바늘을 제거하고 수액 주입을 중단합니다. 뇌 조직 채취를 진행합니다.

5. 수술 후 관리

1. 피부를 봉합할 때는 생쥐의 통증을 완화하기 위해 lornoxicam을 근육 주사합니다.
2. 수술 중 양쪽 눈에 에리스로마이신 안연고를 바르면 안구건조증을 완화할 수 있습니다.
3. 수술 후 수술 과정에서 잃은 출혈량에 따라 0.2-0.4mL의 식염수를 마우스에 복강내로 주입하여 수액 교체를 합니다.
4. 감염을 예방하기 위해 하루 40,000단위씩 연속 3일 동안 페니실린을 근육주사합니다.
5. 수술 후 첫 몇 시간 동안 동물의 자발적 호흡을 정기적으로 확인하고 사전 정의된 인도적 종말점에 대해 하루에 두 번 모니터링합니다. 수술로 인한 호흡 곤란이 있거나 기준선에서 >20%의 체중 감소, 음식/물에 접근할 수 없는 지속적인 불능 또는 심각한 신경학적 결손을 포함한 종점을 충족하는 경우 CO₂가 있는 마우스를 즉시 안락사시킵니다.
   참고: 동물은 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치되지 않으며 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌아가지 않습니다.

결과

신경학적 점수
각 그룹의 9개 마우스는 SAH를 평가하기 위해 Sugawara et ^al.11에 의해 보고된 채점 시스템의 수정을 사용하여 수술 후 24시간 동안 평가되었습니다. 최대 획득 가능한 점수는 18입니다. 그 중 가짜 그룹의 n = 9 마리의 동물은 모두 18 점을 받았습니다. SAH 그룹에서 평균 점수는 11(p < 0.0001)이었습니다(그림 2).

뇌의 병리학적 변화
혈전은 뇌 기저부에서 볼 수 있었고 Willis의 서클에 축적된 반면, 가짜 그룹에서는 그러한 결과가 발견되지 않았습니다(그림 3).

토론

결론적으로, 본 연구는 혈관내 필라멘트 삽입에 의해 유도된 지주막하 출혈(SAH)의 간단하고 신뢰할 수 있는 쥐 모델을 제시하여 편리하고 효과적인 접근 방식을 제공합니다. 기존의 혈관내 천공 모델과 비교했을 때, 이 프로토콜은 천공 단계에서 동일합니다: 필라멘트는 외부 경동맥(ECA)으로 도입되고, 총경동맥(CCA)을 통해 진행된 다음, 이후 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 되며, 여기서 전대뇌동맥(ACA)을 천공하기 위해 더 진행됩니다. 우리는 결찰 이외의 혈류를 일시적으로 차단하기 위해 CCA를 당기는 봉합사를 사용합니다. 쥐와 달리 생쥐의 수술 영역은 매우 제한적입니다. 결찰 대신 견인을 사용하거나 동맥 클램프를 사용하면 수술 영역을 적절하게 노출시킬 수 있습니다. 한편으로, 이 접근법은 목에 필요한 절개 부위를 효과적으로 최소화할 수 있으므로 마우스에 대한 외상을 줄일 수 있습니다. 다른 한편으로는, 명확한 수술 필드를 제공하고 결찰에 사용되는 상당한 시간을 절...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6 마우스	상하이 Jiesjie 실험 동물 유한 회사
; 전기 소작 펜	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	표면적인 경미한 수술, 조직 응고 및 식물의 소작에 사용하기에 적합합니다.
등유랑스 	RWD	R650-IE	이소플루란은 흡입형 전신 마취제입니다. 혈액/가스 분배 계수가 작습니다. 동물 마취에 사용하면 원활하고 신속하며 편안하게 마취를 유도할 수 있으며 회복이 빠르고 근육 이완이 좋으며 교감 신경계에 흥분 효과가 없습니다. 이소플루란은 간에서의 대사율이 낮기 때문에 간에 대한 독성이 적고 반복 사용해도 뚜렷한 부작용이 없습니다. 마취 폐가스가 환경 및 실험실 인력에 미치는 악영향을 피하려면 가스 회수 시스템과 함께 사용하는 것이 좋습니다.
MACO 필라멘트	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	20-25g 무게의 마우스에 사용되며 봉합사 팁은 폴리라이신 또는 실리콘 코팅 없이 반구형으로 녹고 팁에서 9-10mm 떨어진 곳에 표시되어 소독되어 직접 사용할 수 있습니다. 이 모델에는 세 가지 포장 사양이 있습니다. 적절한 모델을 결정하기 위해 공식 실험 전에 사전 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
현미경	Olympus	BX61VS	고해상도 및 고정밀 이미징을 위해 설계된 UIS2 광학 시스템이 장착된 완전 전동식 정립 현미경입니다. 기능으로는 전동식 코피 (nosepiece), 스테이지 (stage) 및 초점 (focus) 과 표본의 대형 고해상도 디지털 이미지를 만드는 가상 슬라이드 기능이 있습니다. 병리학, 세포 생물학, 신경과학 및 재료 과학의 고급 연구 응용 분야에 적합합니다.
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