방법 논문

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

DOI:

10.3791/67784

⸱

2025년 1월 31일

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

초록

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원자력 현미경(AFM)을 사용하면 수십 나노미터의 공간 분해능으로 샘플의 기계적 특성을 특성화할 수 있습니다. 포유류 세포는 즉각적인 미세환경의 역학을 감지하고 반응하기 때문에 높은 공간 해상도로 조직의 생체역학적 특성을 특성화하는 것은 다양한 발달, 항상성 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 약 100 - 400nm 두께의 ECM(extracellular matrix) 하부 구조인 기저막(BM)은 종양 진행과 전이 형성에 중요한 역할을 합니다. 이러한 얇은 ECM 하부 구조의 Young's modulus를 결정하는 것은 어렵지만 BM의 생체 역학 데이터는 BM이 세포 행동에 미치는 영향에 대한 근본적이고 새로운 통찰력을 제공하고 귀중한 진단 잠재력을 제공합니다. 여기에서는 전이되기 쉬운 주요 기관 중 하나인 쥐 폐 조직에서 BM 역학을 평가하기 위한 시각화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 폐 조직의 내피 세포층과 상피 세포층 사이에 위치한 BM의 Young's modulus를 결정하기 위한 효율적인 작업 흐름을 설명합니다. 단계별 지침은 쥐 폐 조직 동결, 냉동 절편 및 조직 절편에 대한 AFM 포스 맵 기록으로 구성됩니다. 또한 자체 개발한 사용자 친화적인 AFM 데이터 분석 소프트웨어인 CANTER Processing Toolbox를 사용하여 반자동 데이터 분석 절차를 제공합니다. 이 도구를 사용하면 기록된 힘 맵의 자동 로드, 힘 대 압전 확장 곡선을 힘 대 압흔 곡선으로 변환, Young의 계수 계산 및 Young의 계수 맵을 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 공간 필터링 도구를 사용하여 폐 BM에서 파생된 Young의 계수 값을 결정하고 분리하는 방법을 보여줍니다.

서론

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AFM 힘 지도는 나노미터 공간 해상도와 피코네톤 힘 감도 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12로 다양한 생물학적 샘플의 나노역학적 특성을 결정하는 데 널리 사용되는 기술로 부상했습니다.. 생리학적 조건에서 생물학적 샘플에 대한 AFM 측정의 적용에 대한 선구적인 연구는 P. Hansma와 동료 13,14,15,16,17,18,19,20에 의해 수행되었습니다. 그 후, AFM 힘 측정을 사용하여 개별 분자21, 살아있는 세포 및 세포 골격 9,10,22,23,24,25,26, 조직 및 조직 단면 6,8,11,27,28, 29,30,31 및 생물학적 하이드로겔 3,4,32. 우리 연구에서는 AFM을 사용하여 생물학적 및 화학적 결합 18,33,34,35,36,37 의 기계적 특성을 조사하고 개별 세포 38,39,40의 나노 역학적 특성을 측정했습니다. 더욱이, 성장판 연골8의 측정은 콜라겐 구조와 세포외 기질(ECM)의 영률(Young's modulus)이 연골세포 분열을 지시하고, 결과적으로 배아 발달 동안 쥐 성장판의 성장 방향을 지시한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 관절 연골에서 연골 퇴행 및 골관절염과 관련된 변화를 조사했다 2,41,42,43,44,45,46,47.

최근 몇 년 동안 수많은 AFM 조사에서 건강한 폐 조직과 병리학적 폐 조직의 기계적 특성을 조사했습니다 48,49,50,51,52. 그러나 이러한 조사는 BM과 같은 특정 조직 구성 요소에 초점을 맞추지 않고 주로 전체 조직 역학을 조사했습니다. BM은 뉴런, 근육, 지방 세포 조직 및 혈관과 같은 대부분의 포유류 장기 및 조직 구조를 둘러싸는 특수 ECM 구조의 얇은 층(인간의 경우 100nm - 400nm)을 구성합니다. 우리는 쥐 폐 BM의 기계적 특성이 전이 형성 과정에서 중추적인 역할을 한다는 것을 발견했으며, 이는 부드러운 BM이 유방암 및 신장암 환자의 더 높은 생존 확률과 상관관계가 있는 방식으로 작용한다는 것을 발견했다53. 또한, 이 조사는 분비된 세포외 기질 단백질인 netrin-4가 BM40 내부의 거의 모든 laminin 네트워크에 존재하는 핵심 구성 요소인 laminin γ1과의 화학량론적 1:1 상호 작용을 통해 BM의 Young's modulus를 감소시킨다는 것을 밝혔습니다.

여기에서는 100 - 200nm 얇은 쥐 폐 BM의 영률(EBM)을 결정하기 위해 개발된 프로토콜의 시각화를 제시합니다. BM의 Young's modulus는 강성의 척도이며 선형 탄성 변형54(이 경우 인덴팅 AFM 팁에 의한 BM의 작은 압축) 동안 응력(단위 면적당 힘)에 대한 응력(단위 면적당 힘)의 비율로 정의됩니다. AFM 실험에서 힘과 변위(압흔 깊이)는 AFM 캔틸레버 편향과 캔틸레버 위치에서 얻을 수 있으며, Young의 계수(응력-변형-관계)는 인덴팅 팁의 형상을 설명하는 적절한 탄성 모델(이 경우 수정된 Hertz 모델55)을 사용하여 결과 힘 대 압흔 곡선에서 추출할 수 있습니다. 주요 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 초기에 이 프로토콜은 쥐 폐 조직 샘플을 OCT 화합물에 준비하고 삽입하는 방법론을 설명하며(1단계 참조) AFM 힘 맵을 사용하여 BM 강성을 측정할 수 있는 후속 동결 절제 절차(2단계)를 용이하게 합니다. 단면 및 양면 테이프를 사용하는 여기에 제시된 동결 절편 기술은 고정이 필요없고 절편을 해동하지 않고 폐 조직을 절편화할 수 있습니다. BM 강성을 평가하기 위해 적절한 데이터를 수집하기 위한 자세한 AFM 절차는 프로토콜의 세 번째 섹션에 요약되어 있습니다. 프로토콜의 다음 섹션에서는 자체 개발한 MATLAB 기반 소프트웨어인 CANTER Processing Toolbox56을 사용하여 생성된 힘 부피를 자동으로 분석하는 방법(4.1단계)을 설명합니다. 이 단계에서, Young의 계수는 수정된 Hertz 모델을 피팅하여 기록된 각 힘-인덴테이션 곡선에서 추출되며, 이는 인덴터 형상(이 경우 4면 피라미드(55)에 대해 수정됩니다. 마지막으로, 4.2단계와 4.3단계에서는 개발된 도구 상자의 공간 필터링 도구 및 R2 필터링 도구를 적용하여 폐포 벽의 모든 조직 구획을 포함하는 힘 맵에서 얻은 포괄적인 Young's modulus 값 세트에서 기저막(BM)에 특정한 Young의 계수 값을 추출하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

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동물 표본을 취급하는 모든 절차는 덴마크 동물 복지법에 따라 덴마크 환경 식품부 동물 실험 위원회(허가 번호 2017-15-0201-01265)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해 생후 13주에 수컷 C57BL/6 마우스를 사용했습니다.

주의: 다음 프로토콜에서는 몇 가지 단계에서 조직 표본을 처리해야 합니다. 생물학적 샘플을 취급하는 동안 항상 적절한 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오.

1. 시료 준비

  1. 갓 채취한 쥐의 폐를 15 x 15 x 5mm 기본 틀에 넣습니다. 0.9mm 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 최적 절단 온도(OCT) 매체 대 인산염 완충 식염수(PBS) 용액의 1:1(부피 대 부피) 비율을 샘플에 조심스럽게 주입하는 동시에 바늘을 집어넣습니다. 실온에서 주입을 진행한 상태에서 작은 수술용 핀셋으로 검체를 단단히 고정합니다. 샘플이 부풀어 오르고 눈에 띄는 양의 진물이 관찰되면 주입이 완료된 것으로 간주됩니다.
  2. 시편이 완전히 잠길 때까지 금형에 순수한 OCT를 채웁니다. 폐 전체가 완전히 얼도록 하려면 샘플을 -80°C의 온도에서 최소 4시간 동안 보관하십시오.
    참고: 이 시점에서 샘플은 -80°C에서 최소 2년 동안 보관할 수 있습니다. OCT에 대한 제조업체의 사양에 따르면 내장 조직의 보관 기간은 10년 이상입니다. 일반적으로 4개월 이상 보관해야 하는 샘플은 수분이 샘플에 흡수되는 것을 방지하기 위해 투명 필름으로 감싸는 것이 좋습니다.

2. 내장된 폐 표본의 동결 절편

  1. cryotome의 챔버 온도를 -17 °C로 조절하면 폐 조직 샘플에 대한 최적의 절단 온도입니다. 이 기능을 사용할 수 있는 경우 절단 단계 장치의 온도를 -22°C로 설정합니다. 이는 전체 절편 공정에 걸쳐 시료 표면에서 최적의 절단 온도가 유지되도록 하는 역할을 합니다.
  2. 유리 슬라이드 중앙에 조심스럽게 놓인 양면 접착 테이프를 사용하여 40개의 현미경 슬라이드를 준비한 후 테이프 위에 15mL 원심분리 튜브를 굴려 단단하고 기포 없는 접착력을 보장합니다. 양면 접착 테이프의 길이가 샘플이 들어 있는 OCT 블록의 너비와 거의 같은지 확인합니다. 가장자리에 반투명 가장자리가 있는 현미경 슬라이드는 샘플 정보와 섹션 번호가 포함된 연필로 라벨링할 수 있습니다.
  3. 준비된 현미경 슬라이드를 슬라이드 상자에 삽입합니다. 그런 다음 슬라이드를 냉각시키기 위해 슬라이드를 담고 있는 상자를 cryotome 챔버 내에 놓습니다.
    알림: 슬라이드를 냉각시키면 섹션을 집어 올릴 때 동결-해동 주기가 발생하는 것을 방지할 수 있으며, 이는 샘플의 기계적 특성을 손상시킬 수 있습니다.
  4. 각각 동결된 샘플 블록과 거의 같은 크기의 단면 접착 테이프를 여러 개 준비합니다.
  5. 샘플 홀더의 내부 두 링을 OCT 배지로 채웁니다. 샘플 홀더의 OCT 매체 내에 샘플을 배치하여 가능한 한 수평이 되도록 합니다. 그런 다음 OCT 매체가 완전히 응고되고 샘플이 홀더에 단단히 고정될 때까지 약 10분 동안 샘플 홀더를 극저온 챔버 내에 놓습니다.
  6. 샘플을 담고 있는 홀더를 cryotome의 절단 단계 장치에 설치합니다. 장치의 사용 설명서에 따라 절단 스테이지의 기울기 및 블레이드의 위치와 같은 냉동 저장체의 모든 필수 구성 요소를 조정하여 OCT 블록의 표면과 평행하게 정렬된 절단 평면을 설정합니다.
  7. 절편 두께를 50μm로 조정하여 샘플의 초기 트리밍을 수행하고 조직 슬라이드 수집을 위해 샘플 내의 원하는 위치(일반적으로 표면에서 폐 표본 내부 약 500μm)에 도달할 때까지 절단을 시작합니다. 냉동 절편의 절편 두께를 원하는 조직 절편 두께에 해당하는 15μm로 조정합니다.
    주의 : 냉동 기계와 같은 절단 도구를 사용하는 동안 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 개인의 안전을 보장하려면 제조업체의 안전 지침을 준수하고 칼날에 손가락을 대지 마십시오.
  8. 엄지 손가락으로 강한 압력을 가하여 샘플에 단면 접착 테이프 조각을 부착합니다. 미리 엄지 손가락을 냉동 저장체의 챔버 벽에 몇 초 동안 대고 하여 냉각되었는지 확인하십시오.
    알림: 테이프는 샘플에 단단히 부착되어야 합니다.amp접착력이 부족하면 절단 중에 조직에서 테이프가 분리될 수 있습니다.
  9. cryotome으로 15μm 조직 단면을 생성합니다. 브러시를 사용하여 단면을 지시하고 절단 절차 중에 접착 테이프가 샘플에서 분리되는 것을 방지합니다. 조직 부분의 매끄러운 표면을 위해서는 절단 속도가 느리고 일관되게 유지되는 것이 중요합니다.
  10. 이전 단계에서 만든 섹션은 이제 테이프가 위쪽을 향하도록 블레이드 블록에 평평하게 놓입니다. 슬라이드 상자의 양면 테이프와 함께 냉각 현미경 슬라이드 중 하나를 사용하고 섹션에 단단히 눌러 들어 올립니다. 그런 다음 이제 섹션을 운반하는 현미경 슬라이드를 슬라이드 상자에 다시 넣습니다.
    알림: 현미경 슬라이드와 단면을 취급할 때는 절단 절차 중에 단면이 해동되는 것을 방지하기 위해 항상 극저온 챔버 내에 보관하십시오.
  11. 필요한 섹션 수, 즉 40개가 수집될 때까지 이전 세 단계를 반복합니다.
  12. 완료되면 슬라이드 박스의 뚜껑을 덮고 드라이아이스에 담아 -20°C 냉동고에 넣습니다. 마지막으로 사용한 모든 품목을 소독하고 냉동 체임실의 자외선을 켜서 극저온체를 청소합니다.
    참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. AFM 측정이 수행될 때까지 샘플을 -20°C의 온도에서 보관하십시오. 섹션 및 OCT 매체의 권장 보관 시간은 6주를 초과해서는 안 됩니다. 이 기간을 넘어서면, 섹션과 OCT 매체는 상당한 표면적과 수분을 흡수하는 성향으로 인해 냉동고 연소와 유사한 변화를 보일 수 있습니다.

3. 폐 단면의 AFM 힘 맵

참고: 이 프로토콜의 경우 JPK NanoWizard 4XP(AFM) 및 Bruker의 전동 스테이지와 Leica의 DMi8(도립 광학 현미경)을 사용하여 폐 단면의 힘-변위 곡선을 기록했습니다.

  1. AFM 설정
    1. AFM 설정에 필요한 모든 장치(예: 컴퓨터, AFM 컨트롤러, 방진 테이블, 광학 현미경 등)를 켭니다.
    2. AFM 제어 소프트웨어를 실행합니다. Choose Experiment 개요에서 QI Advanced Imaging 모드를 선택합니다. 또한 실험 데이터 및 보정 파일을 저장해야 하는 위치를 지정합니다.
      참고: QI Advanced Imaging 확장이 없는 경우 대체 옵션으로 Contact Mode Force Mapping 모드를 활용하십시오.
    3. 관찰 중인 특정 유형의 샘플에 적합한 스프링 상수가 있는 캔틸레버를 선택합니다. 연폐 조직 샘플의 경우 피라미드 모양의 팁과 0.6 N/m의 공칭 스프링 상수가 있는 Bruker의 MLCT 캔틸레버 F를 사용하는 것이 좋습니다. 칩에 여러 개의 캔틸레버(예: MLCT)가 포함되어 있는 경우 실체 현미경 아래에서 핀셋을 사용하여 칩에서 더 이상 캔틸레버를 제거하여 측정에 사용되는 캔틸레버만 s와 접촉하도록 합니다.amp르.
      알림: 측정에 사용된 것보다 샘플과 접촉하는 다른 캔틸레버는 샘플의 원치 않는 움직임을 유발할 수 있습니다.amp실험 중 또는 s의 분리로 이어질 수 있습니다.amp기본 테이프에서 le.
      주의 : 현재 또는 후속 단계에서 핀셋으로 측정에 사용되는 캔틸레버에 닿지 않도록 하십시오.
    4. 캔틸레버 홀더에 칩을 설치합니다. 홀더를 AFM 헤드에 삽입합니다. 도립 광학 현미경에 위치한 샘플 스테이지에 AFM 헤드를 배치합니다. 사용 설명서의 지시에 따라 광학 레버 경로를 정렬합니다. 광학 레버 경로의 적절한 정렬은 레이저 빔이 처음에 측정 캔틸레버의 프런트 엔드에 배치되고 이후에 반사된 레이저 빔이 분할된 포토다이오드의 중심에 부딪힐 때 달성됩니다.
  2. Thermal Noise 방법을 사용한 캔틸레버 교정57
    알림: 캔틸레버의 보정에는 역 광학 레버 감도(InvOLS) 및 스프링 상수 결정이 포함됩니다. 사용된 모든 캔틸레버의 개별 보정은 일반적으로 캔틸레버에 제공되는 공칭 스프링 상수가 일반적으로 대략적인 근사치에 불과하기 때문에 필요합니다. 이 프로토콜에 설명된 것과 같이 기록된 힘 곡선에서 샘플의 기계적 특성을 결정하는 실험에서는 단단한 기판에서 접촉 기반 방법을 통해 InvOLS를 직접 결정하는 것이 필수적입니다. 캔틸레버의 기하학에서 파생하는 것과 같이 InvOLS를 결정하는 대체 방법은 대략적인 근사치만 제공할 수 있으며 여기에 설명된 응용 프로그램 유형에는 적합하지 않습니다. 대안적으로, 공급업체가 정확한 스프링 상수를 제공하는 곳에 캔틸레버가 사용되는 경우, InvOLS는 Schiller 등에 의해 기술된 절차에 의해 결정될 수 있습니다.58.
    1. 샘플에 현미경 슬라이드를 놓습니다.tage AFM. 현미경 슬라이드는 InvOLS의 접촉 기반 측정을 위한 견고한 기판 역할을 합니다.
    2. AFM 헤드를 샘플 스테이지에 배치한 후 캔틸레버 홀더와 현미경 슬라이드 사이의 남은 간격이 약 1 - 2mm가 될 때까지 스테퍼 모터를 사용하여 헤드를 내립니다. PBS를 캔틸레버 홀더 측면에 바르고 긴 바늘(0.9mm x 70mm)이 있는 1mL 주사기를 사용하여 홀더와 현미경 슬라이드 사이의 틈새에 PBS가 아래로 흐르고 유체 반월판을 형성하도록 합니다.
      알림: s의 힘 부피 측정에 사용되는 버퍼 또는 매체와 같은 동일한 액체가 있는지 확인하십시오.ample는 교정 프로세스에도 사용됩니다.
    3. 소프트웨어에서 연락처 기반 캘리브레이션을 수행하려면 데이터 수집 페이지로 이동하여 고급 보기 옵션을 선택합니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 버거 메뉴 버튼을 사용하여 Calibration Manager 에 액세스합니다. 이 인터페이스 내에서 Contact-based(접촉 기반 )를 Method(방법 )로 선택하고 드롭다운 메뉴에서 MLCT F cantilever( MLCT F 캔틸레버)를 cantilever name(캔틸레버 이름)으로 선택합니다. 또한 해당 입력 필드에서 설정값을 1V로 설정하고 스캔 횟수 를 10으로 설정합니다.
    4. Acquire Data(데이터 획득) 페이지의 왼쪽 제어판에서 자동 접근 절차에 대한 설정값 1V를 입력합니다. 사용자 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 파란색 아래쪽 화살표 버튼을 클릭하여 자동 접근 방식을 시작합니다. 접근이 완료되고 캔틸레버가 현미경 슬라이드와 접촉하면, 캘리브레이션 매니저 창에서 캘리브레이션 버튼을 클릭합니다..
      참고: InvOLS 및 캔틸레버 스프링 상수는 10개의 힘 곡선과 열 노이즈 방법57로 스프링 상수를 결정하는 데 사용되는 화력 스펙트럼 밀도(PSD)를 기록하여 자동으로 결정됩니다. 자동 보정 절차가 완료된 후 맞춤 곡선이 기록된 캔틸레버 PSD의 일반 모드(첫 번째 피크)를 올바르게 설명하고 결정된 스프링 상수가 캔틸레버 제조업체가 제공한 공칭 스프링 상수와 동일한 크기를 갖는지 육안으로 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 피팅이 화력 스펙트럼의 첫 번째 피크에 수렴하고 이를 나타내도록 피팅 범위를 수동으로 조정해야 합니다.
    5. 보정이 완료되면 보정 관리자 창을 닫습니다. 캘리브레이션 매니저를 닫은 후, 미리 선택된 디렉토리(3.1.2단계 참조)에 캘리브레이션 파일(*.tnd ascii 파일)이 생성되며, 여기에는 나중에 데이터 분석에 필요한 결정된 캘리브레이션 결과가 포함됩니다. 예를 들어 데이터 분석 프로세스 중에 나중에 참조할 수 있도록 교정 값을 실험실 노트북에 문서화합니다.
      주의 : 이 단계부터는 캔틸레버의 레이저 위치를 변경하거나 AFM 헤드의 미러를 조정하거나 캔틸레버 홀더를 재배치하지 마십시오. 이러한 요소를 수정하면 InvOLS에 영향을 미치고 보정 값이 유효하지 않게 됩니다. 열 드리프트를 보상하려면 AFM 헤드의 분할된 광 다이오드의 위치를 조정하십시오.
  3. 폐 절편의 폐포 벽 분석
    1. 냉동실에서 평가할 표본 슬라이드를 회수합니다. 전체 OCT 배지가 투명해질 때까지 샘플을 실온에서 약 1분 동안 해동합니다. 그런 다음 PBS 방울을 폐 조직 부분에 추가하여 수분을 보충합니다.
    2. 폐 조직 절편을 운반하는 현미경 슬라이드를 s에 놓습니다.amp르 스테이지. AFM 헤드를 s에 다시 설치하십시오.ample stage 및 캔틸레버가 s보다 약 1mm 위에 위치할 때까지 헤드를 내립니다.amp르. 조직 섹션과 캔틸레버 홀더 사이에 액체 메니스커스가 형성될 때까지 0.9mm x 70mm 바늘과 결합된 1mL 주사기를 사용하여 캔틸레버 홀더 측면에 PBS를 추가합니다.
    3. 사용자 인터페이스의 오른쪽 상단 모서리에 있는 렌치 아이콘이 있는 버튼을 클릭하여 설정 관리자로 이동합니다. 설정 관리자에서 다음 일반 설정을 조정합니다. 접근 설정 섹션에서 목표 높이를 4μm로 설정합니다. 그런 다음 현재 모드 설정 섹션에서 고급 피드백 설정으로 이동하여 승수를 1로 설정합니다. 마지막으로, Current Mode Settings 섹션에도 있는 Force Settings 하위 섹션 내에서 Mode at end 드롭다운 메뉴에서 Retracted Piezo 옵션을 선택합니다.
    4. 도립 광학 현미경을 사용하여 손상되지 않은 폐포 벽을 식별하고 탐색합니다. 온전한 벽은 명시야 이미지에서 어둡고 매끄러운 가장자리가 특징입니다. (그림 2A-B 참조).
      참고: 사용 가능한 경우 AFM 제어 소프트웨어에서 명시야 이미지를 가져오면 캔틸레버를 특정 폐포 벽으로 이동하고 그 위에 있는 힘 또는 QI 맵을 정확하게 캡처하는 데 도움이 될 수 있습니다. JPK SPM 소프트웨어에서는 이 기능을 직접 오버레이라고 합니다.
    5. 사용된 AFM, 사용된 캔틸레버 및 관찰된 샘플을 기반으로 왼쪽 제어판에서 force-indentation 곡선에 대한 매개변수를 설정합니다. Bruker의 NanoWizard 4XP 및 MLCT 캔틸레버 F의 경우 다음 매개변수를 권장합니다. 설정값 = 5nN; z 길이 = 8 μm; Z 속도 = 300μm/s.
      참고: 권장 z 길이인 8μm는 다소 큽니다. 이것은 폐 조직의 특성에 기인합니다. 폐 조직이 일반적으로 매우 부드럽다는 점을 감안할 때, 압입 깊이는 5nN의 비교적 겸손한 설정값으로도 특정 지점에서 최대 4μm에 도달할 수 있습니다. 팁이 샘플과 접촉하지 않는 기준선이 힘-압흔 곡선의 약 절반 이상을 차지하도록 하려면 곡선의 총 길이를 8μm로 설정하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 나중에 곡선 분석이 크게 단순화됩니다. 다른 bio-AFM의 경우 이러한 매개변수도 적용할 수 있어야 하지만, 최대 압입력을 결정하는 설정값과 같은 특정 매개변수의 명명법은 제조업체마다 다를 수 있습니다. AFM 시스템이 여기에 제공된 높은 수직 속도를 달성할 수 없는 경우 AFM 제조업체의 권장 사항에 따라 z 속도를 줄여야 합니다.
      주의: 결과의 비교 가능성을 보장하려면 모든 실험에서 동일한 z-approach 속도를 사용하는 것이 중요합니다.
    6. 초기 개요 힘 맵의 위치와 크기를 설정하여 한 공기 쪽에서 다른 쪽 면으로 확장되는 전체 폐포 벽을 포함하도록 합니다. 쥐 폐 조직 샘플의 경우 일반적으로 20μm x 20μm에서 30μm x 30μm 사이의 크기로 충분합니다. 맵의 특정 크기에 관계없이 픽셀 수(기록된 힘 곡선의 수에 해당)를 50 x 50으로 설정합니다. 이를 통해 각 맵에 대해 2,500개의 force-indentation 곡선이 생성되며, 이는 force map의 경사 채널에서 BM을 식별하는 데 필요한 해상도를 제공합니다. (그림 2C-D 참조).
    7. 개요 맵을 기록한 후 힘 맵의 높이와 경사 채널을 검사합니다. 높이 채널이 폐포 벽이 손상되지 않았음을 나타내고( 그림 2D 참조) 경사 채널의 BM을 상피와 내피의 두 층 사이에 위치한 명확하게 정의된 밝은 선( 그림 2C, E 참조)으로 구별할 수 있는 경우 BM에서 3μm x 3μm 또는 4μm x 4μm 크기의 보다 집중된 힘 맵을 캡처합니다.픽셀을 50으로 유지 x 50 곡선.
      참고: 이 절차를 사용하면 맵 해상도가 높아지고 특히 BM에 대해 더 많은 수의 Young's modulus 값을 기록할 수 있습니다(그림 2E-F 참조). 또한 이를 통해 BM과 주변 조직을 보다 정확하게 구별할 수 있어 후속 공간 필터링 프로세스의 정밀도가 향상됩니다. 개요 맵의 채널에 무너지거나 파열된 벽이 표시되는 경우, 캔틸레버가 팁뿐만 아니라 샘플에 닿았을 뿐만 아니라 경사 채널에서 식별 가능한 BM이 없는 경우 BM의 아티팩트가 없는 평가가 있는 벽을 식별할 수 있을 때까지 조직 섹션의 다른 벽으로 이동합니다.
      원하는 수의 폐포 벽이 평가될 때까지 동일한 폐 표본의 추가 절편에 대해 이전 단계(3.3.6 및 3.3.7)를 반복합니다. 확실한 결과를 얻기 위해 각 폐 표본에 대해 최소 4개의 벽이 권장됩니다59.
    8. 측정이 완료되면 샘플 및 PBS와 접촉한 모든 장비 및 재료를 세척합니다. 샘플이 더 이상 필요하지 않은 경우 오토클레이브 유리 폐기물 용기에 폐기하십시오. 기록된 모든 데이터를 저장하고 AFM 제어 소프트웨어와 컴퓨터를 종료합니다. 마지막으로 사용된 모든 전기 장치를 차단하십시오.
      참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 실험 데이터가 저장되고 나중에 분석할 수 있습니다.

4. 데이터 분석

  1. 힘-압흔 곡선 분석
    참고: Force Curve Analysis 응용 프로그램에 대한 자세한 설명서는 https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis 여기에서 찾을 수 있습니다.
    1. MATLAB에서 CANTER Processing Toolbox56 을 실행하고 힘 곡선 분석 응용 프로그램을 엽니다.
      참고: 도구 상자는 다음 링크를 따라 GitHub 리포지토리에서 다운로드할 수 있습니다. https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. MATLAB을 사용하여 소프트웨어를 설치하고 시작하는 방법에 대한 포괄적인 가이드로 구성된 README.md 파일은 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다. 도구 상자에 포함된 각 응용 프로그램에 대한 자세한 내용은 https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki 의 해당 wiki에서 확인할 수 있습니다.
    2. Select File(파일 선택) 버튼을 클릭하고 포스 맵이 저장된 위치로 이동하여 두 번 클릭한 다음 애플리케이션의 사용자 인터페이스에서 Load Data(데이터 로드) 버튼을 클릭하여 고해상도(3 μm x 3 μm 또는 4 μm x 4 μm) 포스 맵을 로드합니다.
    3. 이전 프로토콜 단계에서 선택한 힘 맵을 기록하는 데 사용되는 캔틸레버에 대해 결정된 보정 값(InvOLS 및 스프링 상수)을 요청하는 팝업 창이 나타납니다(3.2단계 참조). 각 편집 필드에 교정 값을 입력합니다. 3.2.4단계에서 문서화되지 않은 경우 보정 값이 포함된 자동으로 생성된 보정 파일을 참조하십시오. 팁-표본 분리를 계산해야 하는지 여부에 대한 질문에 대해 기본 옵션을 yes 로 유지합니다. 그런 다음 제출 버튼을 클릭하여 계속 진행합니다.
    4. 두 번째 팝업 창이 나타나 들여쓰기된 샘플에 대한 인덴터 형상과 푸아송 비율을 선택할 수 있습니다. 사용된 MLCT 캔틸레버의 경우 팁 형상으로 4면 피라미드 를 선택하고 모서리에 대한 반각으로 17.5°를 입력합니다(둘 다 기본값임). 기본 포아송 비율 0.5를 사용하며, 이는 비압축성 재질을 나타냅니다. QI 맵의 로딩 절차를 계속하려면 제출 버튼을 클릭하십시오.
      참고: 로딩 절차 중에 기록된 편향-변위 곡선(AFM의 원시 데이터)은 제공된 보정 값을 기반으로 힘-압흔 곡선으로 변환됩니다. 개별 변환 단계 및 관련 방정식에 대한 포괄적인 이해는 Hartmann et al.59의 보충 정보를 참조하십시오.
    5. 로딩 프로세스가 완료되면 힘 맵의 초기 힘 곡선이 화면에 표시됩니다. 베이스라인 보정 모드 Offset + Tilt 가 선택되어 있는지 확인합니다. 이 모드는 힘 유도 곡선의 기준선을 자동으로 감지하고 기울기 및 수직 오프셋을 0으로 수정합니다. 또한 Contact Point Finder 의 알고리즘으로 Via Hertz 모델을 선택하고 이 옵션의 지정된 편집 필드에 20% 값을 사용합니다. 이 알고리즘은 연조직 샘플에 기록된 힘-압흔 곡선에서 접촉점을 감지하는 데 특히 적합합니다. 마지막으로 해당 편집 필드의 맞춤 깊이를 1.5μm로 설정합니다.
      알림: 현미경 슬라이드의 강성이 결과 Young's modulus에 영향을 미치지 않도록 하려면 최대 맞춤 깊이를 조직 단면 두께10의 60%보다 크지 않은 값으로 설정하는 것이 좋습니다. 보정 알고리즘에 대한 자세한 내용은 Hartmann et al.59의 보충 정보를 참조하십시오.
      주의: 결과가 비슷하다는 것을 보장하기 위해 실험 전반에 걸쳐 동일한 맞춤 깊이를 사용하십시오.
    6. 수정된 Hertz 모델의 핏을 QI 맵의 모든 힘-들여쓰기 곡선에 적용하려면 Keep & Apply to all 버튼을 클릭합니다. 해석 중에 각 힘 곡선을 표시해야 하는지 여부를 묻는 대화 상자 창이 열립니다. 곡선을 표시하지 않으면 처리 속도가 약간 빨라집니다.
    7. 마지막 하중 곡선 해석이 완료되면 맞춤 결과를 저장해야 하는지 여부를 묻는 창이 나타납니다. 결과를 둘 다에 저장합니다. tsv(탭으로 구분된 값) 및 .xlsx(Excel) 파일 형식에서 예를 클릭하고 결과 파일의 이름을 입력합니다. 또한 파일 확장자가 *.meta_data인 텍스트 파일이 저장되며, 여기에는 사용된 보정 값, 선택한 맞춤 모델, 선택한 접점 감지 알고리즘, 맞춤 범위 및 기타 관련 정보와 같은 곡선 분석과 관련된 모든 세부 정보가 포함됩니다.
    8. 메인 창의 오른쪽 상단 모서리에 있는 십자 아이콘을 클릭하여 Force Curve Analysis 응용 프로그램을 닫습니다.
  2. QI 맵 결과의 공간 필터링
    참고: 공간 필터링 단계는 BM에서 생성된 QI 맵의 Young's modulus 값만 추가 분석에 고려되도록 합니다. 결과 필터링 도구에 대한 자세한 설명서는 https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool 에서 확인할 수 있습니다.
    1. CANTER Processing Toolbox의 응용 프로그램 선택 창에 있는 응용 프로그램 목록에서 결과 필터링 도구를 선택하고 응용 프로그램 시작 버튼을 클릭하여 응용 프로그램을 시작합니다.
    2. 피팅 결과를 로드하려면 결과 필터링 도구 사용자 인터페이스의 상단 메뉴 표시줄에서 열기를 클릭합니다. 후속 팝업 창에서 JPK 맵 탭에 있는 첫 번째 설정 버튼을 찾아 힘 곡선 해석 결과가 포함된 .tsv 파일을 선택합니다(4.1.6단계 참조). 두 번째 설정 버튼을 클릭하고 이미 선택한 .tsv 파일에 해당하는 QI 맵 파일을 찾습니다. 그런 다음 제출을 클릭하여 맵 데이터를 로드하고 곡선 해석 결과를 강제로 적용합니다.
    3. 상단 Displayed channel 드롭다운 메뉴에서 Emodul 옵션을 선택하여 얻은 Young's modulus 결과를 맵 이미지로 표시합니다. 또한 히스토그램 플롯 아래에 있는 데이터 채널 드롭다운 메뉴에서 Emodul 옵션(아직 선택하지 않은 경우)을 선택하여 QI 맵의 로드된 Young's modulus 값의 분포를 시각화합니다.
    4. 사용자 인터페이스의 중앙에 있는 Manipulation flow 화살표 버튼을 클릭하고 오른쪽을 가리키는지 확인합니다. 히스토그램 축 위에 있는 필터 패널에서 이미지 필터 토글 버튼을 켜기 위치로 설정합니다. Filter geometry 드롭다운 메뉴에서 Freehand 옵션을 선택한 다음 Add 버튼을 클릭합니다.
    5. 상단 채널 이미지에서 마우스 왼쪽 키를 누른 상태에서 BM을 빙글빙글 돌면서 필터 마스크를 그립니다. BM은 Young's modulus map에서 인접한 연조직과 비교하여 밝은(높은 Young's modulus 값) 구조로 식별할 수 있습니다(그림 3A 참조). 마스크 그리기가 끝나면 마우스 왼쪽 키를 놓고 맵에 적용할 마스크를 두 번 클릭합니다. 이제 오른쪽의 히스토그램 그래프에는 녹색으로 강조 표시된 맵 영역에 대한 Young의 모듈러스 값만 표시됩니다(기본 색상, 그림 3C-D 참조).
    6. 마스크된 Young의 모듈러스 값만 포함하는 새 .tsv 결과 파일을 만들려면 사용자 인터페이스의 상단 메뉴 모음에서 저장 > 히스토그램 저장 > 데이터 저장을 클릭합니다. 또는 히스토그램이 플로팅된 좌표축의 빈 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 상황별 메뉴에서 데이터 저장을 선택합니다.
    7. 팝업 창에서 모두 선택을 클릭하여 .tsv 파일에 쓸 결과를 묻습니다. 그런 다음 확인 버튼을 클릭하여 선택을 확인합니다. 그런 다음 저장 대화 상자에 .tsv 파일의 이름을 입력하고 원하는 저장 위치를 선택한 다음 마지막으로 확인을 클릭하여 필터링된 결과를 저장합니다.
    8. 응용 프로그램의 오른쪽 상단 모서리에 있는 십자 아이콘을 클릭하여 결과 필터링 도구를 닫습니다.
  3. R2 결과 필터링
    참고: 이 프로토콜 단계는 수정된 Hertz 모델이 피팅된 힘-압입 곡선에 대해 양호한 일치를 보인 경우 Young의 모듈러스 결과만 고려되도록 합니다. R² 필터링 도구에 대한 자세한 설명서는 https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool 에서 확인할 수 있습니다.
    1. CANTER Processing Toolbox의 응용 프로그램 선택 창에 있는 응용 프로그램 목록에서 R² Filtering Tool을 선택하고 응용 프로그램 시작을 클릭하여 R² Filtering Tool을 시작합니다.
    2. 사용자 인터페이스의 상단 메뉴 표시줄로 이동하여 .tsv 파일 열기를 클릭합니다. 후속 파일 로드 대화 상자에서 이전 단계 4.2.5에서 저장한 BM의 Young's modulus 결과가 포함된 .tsv 파일을 찾아 두 번 클릭하여 선택합니다.
    3. .tsv 파일에 포함된 데이터 열 목록을 표시하는 대화 상자가 나타납니다. Young의 모듈러스 데이터를 포함하는 열로 Emodul 을 선택합니다. 그런 다음 R² 데이터를 요청하는 별도의 목록 상자 대화 상자에서 rsquare_fit를 선택합니다. 로딩 절차가 완료되면 로드된 Young의 모듈러스 데이터는 화면 왼쪽 상단에 히스토그램 형태로 표시되고 R² 데이터 분포는 오른쪽 상단의 그래프에 표시됩니다.
    4. 그래픽 사용자 인터페이스 중앙에 있는 편집 필드에 0.96을 입력합니다. Filter Data(데이터 필터링 ) 버튼을 클릭하여 입력한 값을 사용하여 R² 필터를 적용합니다. 이 작업은 R² 값이 0.96 이상인 결과만 유지합니다. Young의 모듈러스 결과와 해당 R² 값의 필터링된 분포는 사용자 인터페이스의 아래쪽 절반에 표시됩니다.
    5. 위쪽 메뉴 모음에서 필터링된 데이터 저장을 선택하여 정의된 R² 필터 기준인 > 0.96을 충족하는 결과만 포함하는 새 .tsv 파일을 만듭니다. 예를 들어, 프로빙된 폐 BM에 대한 Young의 계수 분포를 시각화하는 Histogram Plotting Tool을 사용하여 저장된 데이터를 히스토그램으로 표시할 수 있습니다( 그림 4A 참조).

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

온전한 폐포 벽을 식별하고 측정한 후 이 프로토콜의 주요 결과는 BM의 필터링된 Young's modulus 값입니다. 모든 조직 절편에서 AFM 측정에 적합한 폐포 벽을 찾는 것은 불가능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리의 실험적 관찰에서, 쥐 폐 표본에서 파생된 냉동 절편의 약 75%가 정량화할 수 있는 폐포 벽을 나타냈습니다. 폐 BM에서 Young's modulus의 공간 분포를 정확하게 결정하려면 3μm x 3μm 또는 4μm x 4μm에 걸친 힘 맵을 사용하는 것이 좋습니다. 이 접근 방식은 일반적으로 두께가 100nm - 200nm를 측정하는 마우스 폐 BM을 검사하기 위한 충분한 분해능을 보장합니다. 따라서 실험적 접근 방식에는 각 힘 맵에 대해 50 x 50 힘 곡선을 캡처하여 총 2,500개의 힘 곡선을 생성하는 것이 포함됩니다. 힘 맵 내에서 힘 곡선은 균일한 간격으로 배치됩니다. 이것은 BM의 Young's modulus 외에도 BM을 둘러싼 조직 구조가 작은 힘 맵에서도 조사된다는 것을 의미합니다. 따라서 폐 BM의 Young's modulus를 정확하고 선택적으로 결정하기 위해 이 프로토콜에서 2단계 필터링 프로세스를 구현했습니다.

작업자별 공간 필터링의 초기 필터링 단계는 분석된 힘 맵에 포함된 총 결과 값의 약 10%에서 25%를 포함하는 쥐 폐 BM에서 비롯된 힘 곡선 맞춤 결과를 선택합니다. 이 초기 공간 필터링 후 추가 분석을 위해 약 250 - 625개의 맞춤 결과가 유지됩니다. 다음 필터링 단계에서는 수정된 Hertz 모델에 의해 적절하게 설명된 힘 곡선에서 비롯된 BM 관련 결과만 포함되도록 합니다. 따라서 수정된 Hertz 모델 적합치의 결정 계수(R2)가 필터 기준으로 사용됩니다. 우리의 경험적 경험에 따르면R2 값이 0.96보다 높은 결과를 유지하는 것이 이 프로토콜을 준수하여 얻은 적합 결과에 적합합니다. R2 값은 힘 곡선 기준선의 품질(매끄러움)과 길이, 접촉점의 결정 및 적합 모델의 수렴에 의해 크게 영향을 받는다는 점에 유의해야 합니다. 두 필터링 절차를 모두 적용한 후 일반적으로 약 100 - 500 Young의 탄성계수 값이 단일 폐포 벽의 BM에 대해 유지됩니다.

BM에서 이러한 나머지 Young's modulus 값의 분포는 히스토그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다(그림 4A). 폐 BM의 결과 Young's modulus 값은 양수 값만 얻을 수 있는 무작위 변수에서 일반적으로 관찰되는 로그 정규 분포를 따른다는 점에 유의하는 것이 중요합니다61. 이는 그림 4B의 QQ 플롯으로 시각화됩니다. 결과적으로, 정규(가우스) 분포는 로그 변환된 영률(E) 값의 분포에 적합될 수 있습니다. 여기서 자연 로그(ln)는 E 값을 변환하는 데 사용되었습니다. 분포(μ) 및 표준 편차(σ)의 피크 위치를 이 피팅에서 추출한 후 다음 방정식을 사용하여 EBM으로 표시되는 대표 Young's modulus를 얻기 위해 재변환했습니다.

figure-results-1

재변환 후에는 표준 편차 간격이 더 이상 피크 값 주위에서 대칭이 아닙니다. 표준 편차 구간의 음수(σ-) 및 양수(σ+) 가장자리는 다음 표현식을 사용하여 계산할 수 있습니다.

figure-results-2

figure-results-3

이 방정식은 지수 함수가 자연 로그62의 역 함수라는 사실의 결과입니다.

그림 4A의 히스토그램에서 결정된 피크 값 μ = 9.31 및 표준 편차 σ = 0.18을 재변환한 후 대표적인 Young의 모듈러스 값은 표준 편차 간격이 [-1.82kPa, +2.18kPa]인 EBM = 11.05kPa입니다. 또는 로그 정규 분포를 변환되지 않은 Young의 모듈러스(E) 값의 히스토그램에 적합하여 분포의 특성 모수를 결정할 수 있습니다.

Hartmann et al.59에서 자세히 설명한 바와 같이 강력한 대표 결과를 얻기 위해 마우스당 최소 4개의 벽을 분석하는 것이 좋습니다. 마우스에 대한 대표 Young's modulus EBM 을 결정하기 위해 4개 벽 모두의 로그 변환 값을 하나의 결합된 히스토그램과 μ로 표시했으며 σ는 정규 분포를 피팅하여 결정했습니다. 이어서, μ 및 σ는 앞서 설명한 바와 같이 재형변환되어 대상 마우스에 대한 EBM 및 표준 편차 간격을 검색한다.

figure-results-4
그림 1: 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하기 위한 주요 프로토콜 단계의 개요. 초기 단계는 쥐의 폐를 얻어 준비한 다음 삽입하는 것입니다. 따라서 폐에 OCT 배지와 PBS의 조합을 주입한 다음 OCT 화합물에 완전히 담그십시오. 그 후, 15μm 두께의 폐 조직 절편을 냉동 절편체(cryotome)로 동결 절편을 얻습니다. 이 프로토콜에서는 절단 공정 중에 샘플을 제자리에 고정하기 위해 단면 및 양면 점착 테이프를 사용하는 프로세스를 자세히 설명합니다. 그 후, BM의 Young's modulus 값은 조직 단면에 대한 AFM 힘 맵 측정을 통해 결정됩니다. 힘 곡선 분석 프로세스가 완료되면 공간 및 R² 필터링이 적용되어 관심 구조, 특히 BM(힘 맵에서 녹색으로 표시되고 로그 변환된 Young의 모듈러스 분포에서 정량화됨)의 Young's modulus 결과를 분리합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 2: 쥐의 폐 조직 절편에 대해 수행된 예시적인 힘 맵 AFM 실험. (A) 쥐의 폐 조직 절편에 대한 명시야 현미경 개요 이미지로, 두 개의 폐포 사이에 위치한 적절한 온전한 폐포 벽을 식별할 수 있습니다. 이미지의 오른쪽에는 AFM의 삼각형 모양의 MLCT 캔틸레버 F가 보입니다. (B) 조직 단면 내에서 선택한 벽의 확대 보기. (C) 폐포 벽의 50 x 50 힘 곡선을 포함하는 개요 15 x 15 μm 맵의 기울기 및 (D) 높이 채널. 경사 채널에서 BM은 밝은 선(흰색 화살표)으로 식별될 수 있으며, 이는 벽 내에서 강성이 증가된 구조를 나타냅니다. 높이 채널은 벽의 무결성을 확인하며 파열의 증거를 보여주지 않습니다. 개요 15 x 15 μm 맵에서 BM을 식별한 후 50 x 50 힘 곡선이 있는 더 작은 4 x 4 μm 맵(E: 경사 채널, F: 높이 채널)이 기록됩니다. 눈금 막대 : (A) 200 μm 및 (BD) 25 μm. 표시된 AFM 이미지의 색상 눈금 범위는 (C) 2.36 - 9.29 nN/μm, (D) 0 - 3.38 μm, (E) 2.36 - 9.29 nN/μm (개요 이미지) 및 2.42 - 8.37 nN/μm (작은 이미지), (F) 0 - 3.38 μm (개요 이미지) 및 0 - 1.99 μm (작은 이미지)이며, 어두운 곳에서 밝은 곳까지입니다. 모든 AFM 이미지에는 선형 색상 스케일이 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 3: 공간 필터링 절차의 시각화. (A) 힘의 곡선 분석으로 인한 Young의 계수 맵으로, 결과의 공간 필터링을 가능하게 하기 위해 결과 필터링 도구에 표시됩니다. BM은 더 부드러운 조직 구획으로 둘러싸인 밝은(높은 Young's modulus 값) 줄무늬로 식별할 수 있습니다. (B) 필터링되지 않은 맵 (A)에 해당하는 Young의 모듈러스 값의 히스토그램. (C) 공간 필터 마스크(녹색 영역)를 적용한 후 (D) 히스토그램은 BM으로 식별된 녹색 강조 영역의 Young's modulus 값으로만 구성됩니다. 히스토그램의 왼쪽에서 관찰할 수 있는 잔류 소프트 값은 수렴이 불량한 피팅에 기인할 수 있으며, 이는 후속 R² 필터링 단계에서 제거됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 4: 이 프로토콜에 따라 수신된 쥐 폐 BM의 Young's modulus 분포. (A) 결과 BM Young의 계수 값(N = 325)의 로그 정규화 히스토그램. 정규 분포(검은색 실선)를 피팅하여 표준 편차가 σ = 0.18인 평균값 μ = 9.31을 결정합니다. 재변환 후, 이는 비대칭 표준 편차 간격이 [-1.82 kPa, +2.18 kPa]인 EBM = 11.05 kPa의 BM의 Young's modulus에 해당합니다. (B) QQ: 표준 정규 분포의 분위수 대비 로그화된 BM Young의 모듈러스 값의 분위수 플롯. 이 플롯은 분포의 왼쪽 꼬리와 오른쪽 꼬리에 있는 일부 값을 제외하고 결과 Young의 모듈러스 값이 주로 로그 정규 분포임을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BM의 기계적 특성은 종양 발아, 세포 분화, 세포 이동 및 염색질53 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 의 접근성과 같은 다양한 세포 기능에 미치는 영향으로 인해 상당한 관심을 받았습니다. 결과적으로, 일관되고 측정 가능한 방식으로 BM 역학을 평가하는 능력에는 충족되지 않은 격차가 존재합니다. 이 프로토콜은 AFM 사용자가 야생형 또는 유전자 변형 마우스에서 얻은 건강하거나 병리학적인 쥐 폐 샘플에서 폐 BM의 Young's modulus를 결정할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스 기반 MATLAB 응용 프로그램인 CANTER Processing Toolbox56은 AFM 데이터의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 폐 질환에 대한 임상 진단, 관리 또는 새로운 치료 전략의 발전으로 이어질 수 있는 연구를 수행하는 다른 연구자들에게 유용할 것으로 예상됩니다.

프로토콜의 중요한 단계에는 폐 표본의 동결 절편 중에 동결-해동 주기로 인한 기계적 특성의 변경을 방지하기 위해 조직 절편이 언제든지 해동되지 않도록 하는 것이 포함됩니다. 따라서 사전 냉각된 현미경 슬라이드만 사용하여 절편을 수집하고 극저온 체온의 챔버 내에서만 처리하는 것이 필수적입니다. 폐포 벽에서 힘 맵을 기록하는 동안 가장 중요한 단계는 생성된 경사 이미지를 활용하여 프로브 영역의 강성 분포에 대한 정성적 개요를 제공하여 BM의 적절한 측정 위치를 식별하는 것입니다. 얻어진 Young의 모듈러스 값의 공간 필터링은 프로토콜에서 중요한 단계를 구성하며 CANTER Processing Toolbox의 핵심 기능입니다. 이 필터링 단계를 통해 연구자는 특유의 더 뻣뻣한 발자국을 통해 두 개의 부드러운 세포층 사이에 위치한 BM을 식별하고 추가 분석을 위해 BM의 해당 Young's modulus 값을 추출할 수 있습니다.

이 고급 분석 워크플로우는 netrin-4 녹아웃 마우스가 야생형 깔짚 마우스에 비해 폐 기저막에서 실질적으로(약 2배) 더 높은 Young's modulus를 나타냈다는 것을 밝혔습니다53. 따라서, 본 프로토콜은 다양한 조건 또는 그룹에 대한 비교 분석을 용이하게 합니다.

AFM 외에도 분자 수준에서의 광학 또는 자기 핀셋 69,70,71, 중간 규모의 마이크로 압입 기술 72,73 및 거시적 수준에서 제한 또는 제한되지 않은 압축 테스트74,75를 포함하여 생체 재료의 기계적 특성을 검사하기 위한 수많은 방법론이 존재합니다. 구체적으로, 압력 근조영술, 인장 테스트76,77 및 유변학78 이 혈관 샘플 및 재구성 된 BM 매트릭스의 BM 강성을 평가하는 데 사용되었습니다. 그러나 압력 근조영술 및 인장 테스트와 같은 기술은 다양한 세포층 및 구조 요소를 포함하는 전체 혈관과 같은 전체 조직 또는 전체 조직의 기계적 특성만 평가할 수 있습니다. 결과적으로 이러한 방법을 사용하여 BM 생체 역학을 평가할 때 세포 구성 요소와 같은 비 BM의 기계적 특성은 항상 BM 결과에 중첩되어 BM 자체의 특정 특성을 분리하기가 어렵습니다.

이 프로토콜에서 관심 기능(BM)은 force-map 결과의 공간 필터링을 통해 추출됩니다. 이 접근 방식의 한계는 관심 기능이 얻어진 Young의 모듈러스 맵 또는 기타 사용 가능한 맵 채널에서 뚜렷한 패턴으로 식별 가능하고 식별할 수 있어야 한다는 요구 사항입니다. 예를 들어, 폐포 조직의 BM은 주변 세포에 비해 상당히 높은 Young's modulus를 나타내는 상호 연결된 구조로 인해 단독으로 식별할 수 있습니다. 결과적으로, BM은 얻어진 Young's modulus 맵에서 연속적인 밝은 줄무늬로 나타납니다. 그럼에도 불구하고 다른 생물학적 구조는 맵 결과에서 공간 필터링을 가능하게 할 만큼 주변 조직의 구조와 충분히 구별되지 않는 기계적 특성을 나타냅니다. 이 프로토콜은 면역형광 염색과 같은 기록된 힘 맵에서 구조를 식별하기 위해 다른 방법과 결합할 수 있지만, 이 접근 방식은 해석하기 어려운 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 합병증은 염색 절차가 조직의 기계적 특성을 변화시킬 수 있기 때문에 발생할 수 있습니다. 결과적으로, AFM 측정 전에 조직의 처리 또는 염색은 관심 특징을 식별할 수 있는 대체 방법이 없는 경우에만 수행해야 합니다. 또한 염색된 샘플과 염색되지 않은 샘플의 생체역학적 특성을 비교하는 적절한 대조 실험을 수행하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜은 Young의 모듈러스 대비를 기반으로 대상 구조를 식별하는 방법을 소개합니다. 결과적으로, 갑상선, 결장 및 전립선을 포함하여 폐와 유사한 해부학적 BM을 가진 조직에 적용될 수 있습니다. (Hartmann et al.59의 확장 데이터 그림 참조). 이 프로토콜과 CANTER Processing Toolbox56 은 처음에는 BM 역학을 분석하기 위해 개발되었지만, AFM 힘 맵 내에서 기계적으로 구별되고 연결된 영역을 검사할 수 있을 만큼 다재다능합니다(www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki 의 지침 참조). 이러한 광범위한 적용 가능성으로 인해 이 도구는 AFM 분야 전반에 걸쳐 가치가 있으며 더 넓은 과학 커뮤니티에서 기계생물학에 대한 관심이 높아지는 데 도움이 됩니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H. 및 H.C.-S. 바이에른 연구 포커스(Bavarian Research Focus), Herstellung und biophysikalische, Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben(CANTER) 및 바이에른 학술 포럼(BayWISS)-박사 컨소시엄 건강 연구를 통해 바이에른 주 과학 예술부의 자금 지원을 인정합니다. 데이터 분석 소프트웨어 CANTER Processing Toolbox의 개발은 연구 컨소시엄 Exploring articular cartilage and subchondral bone degeneration and regeneration in osteoarthritis - ExCarBon (FOR2407-1/2)의 하위 프로젝트 1(CL 409/4-1/2)의 일환으로 독일 연구 재단의 지원을 받았습니다. B.H. 및 H.C.-S. 주요 계측 캠페인 GGA-HAW (INST 99/38-1)를 통해 독일 연구 재단의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 덴마크 암 학회(D204-A12454 (R.R.))와 독일 연구 재단(539446614 to R.R.)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 주사기B Braun9166017VInjekt-F
10mL 주사기B Braun4606108VInjekt Luer Solo
15mL 팔콘 튜브Sarstedt62.554.002나사 캡 튜브
캔틸레버 - MLCTBruker AFM 프로브3444AFM 캔틸레버, 피라미드 팁 모양의
극저온 톱날Leica Biosystems14035843496로우 프로파일 일회용 블레이드 DB80LX
극저온 탐 샘플 홀더Leica Biosystems14047740044표본 디스크 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay ExtensionBruker소프트웨어 확장 JPK SPM 소프트웨어 용 확장으로 도립 현미경의 광학 이미지를 SPM 소프트웨어의 데이터 뷰어로 가져올 수 있습니다.
일회용 기본 금형Science ServicesSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
양면 테이프tesa Film56661-00002사진 필름 테이프
고정 스프링 캔틸레버 홀더Bruker
도립 현미경 - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK 전동 스테이지Bruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS microscope KameraLeica Microsystems
MATLABMathworks버전 R2024a 이상
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - Image Processing Toolbox매스웍스
MATLAB - Signal Processing Toolbox Mathworks
MATLAB - 통계 및 머신 러닝 도구 상자Mathworks
현미경 슬라이드Carl RothH869.1캔틸레버 보정을 위한 일반 현미경
슬라이드 현미경 슬라이드 - 반투명 가장자리Carl RothH870.1냉동 절편을 위한 서리로 덥은 가장자리가 있는 현미경 슬라이드
바늘 &슬래시; 0.9mm &시간; 25 mmB Braun4657500OCT 주입  폐 샘플에
바늘 &슬래시; 0.9mm &시간; 70mmB 브라운4665791에 PBS를 적용하는 긴 바늘
Ca2+, Mg2+, 500mL
메스B Braun5518083수술용 일회용 메
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