Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

Summary

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Abstract

3차원(3D) 세포 배양은 세포와 세포외 기질 간의 향상된 상호 작용을 촉진하기 때문에 기존의 2차원(2D) 배양보다 생체 내 미세환경을 더 정확하게 표현합니다. 이 연구는 혁신적인 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조(스페로이드/오가노이드)를 생성하는 효율적이고 비용 효율적이며 재현 가능한 방법론을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 새로운 스탬프를 사용하여 6웰 플레이트의 웰당 663개의 마이크로웰을 생성하여 세포 응집을 위한 이상적인 환경을 제공했습니다. 1차 돼지 췌장 섬 세포를 이러한 마이크로웰에 파종하여 응집하여 스페로이드/오가노이드를 형성했습니다. 배양물을 37°C에서 5%_CO2 이하로 배양하고, 배지를 3일마다 교체하였다. 스페로이드 형성을 주기적으로 모니터링하고 특성화를 위해 샘플을 수집했습니다. 이 방법은 균일하고 고품질의 스페로이드를 성공적으로 생성하여 실험 변동성을 줄이고 조작을 최소화하며 세포 상호 작용을 향상시켰습니다. 아가로스 기반 마이크로패턴 몰드를 사용하여 3D 배양을 위한 단순화되고 제어된 환경을 제공하여 표준화되고 비용 효율적인 솔루션을 제공했습니다. 이 방법론은 약물 검사 및 조직 공학 응용 분야를 지원하며, 다양한 실험실 환경에서 쉽게 구현할 수 있는 3D 세포 배양 모델을 위한 실용적이고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

지난 50년 동안 수많은 세포 생물학 연구에서 2차원(2D) 배양이 동물 모델에서 관찰된 생체 내 조건을 정확하게 재현하지 못한다는 사실이 입증되었습니다¹. 구조적으로 2D 세포 배양은 세포가 3차원으로 조직하고 생체 내 시스템에서 관찰된 상황을 복제하는 것을 허용하지 않습니다. 또한, 3차원(3D) 배양에 비해 2D 배양에서는 세포 신호 전달 경로가 변경되는데, 이는 2D 배양을 사용한 특정 유형의 약물 스크리닝이 왜 그렇게 모순되는지를 설명할 수 있습니다². 세포 배양 기술의 상당한 발전은 3D 배양 시스템의 도입으로 나타났습니다. 3D 시스템은 세포 구성과 세포 구조에 따라 복잡성이 상당히 다릅니다. 일반적으로 두 가지 유형의 구조, 즉 스페로이드와 오가노이드가 생성됩니다. 스페로이드는 정상 또는 종양 조직, 배아체 및 세포주에서 얻은 세포의 단순한 클러스터로 설명됩니다. 3D 구조의 형성은 구조적 지원과 생화학적 단서를 제공하는 세포외 기질(ECM)의 구성 요소에 의해 매개되는 세포-세포 상호 작용 및 신호 경로를 포함한 다양한 요인의 영향을 받습니다. 이러한 요소는 조직 조직과 기능에 기여하는 상호 작용을 조절합니다³. 스페로이드 배양 시스템은 1970년대 초에 처음으로 기술되었으며, V79 중국 햄스터 폐 세포주를 결절성 암종의 모델로 사용하여 비부착 조건에서 성장하고 완벽한 구체를 형성했습니다⁴. 오가노이드(organoid)는 줄기세포(stem-cell) 또는 전구세포(progenitor cell)에서 유래한 장기 특이적 세포 유형의 클러스터(cluster)로 설명되며, 세포 분류 및 계통 지정과 같은 과정을 통해 공간적으로 제한된 방식으로 자체 조직화되며, 이는 생체 내 발달(in vivo development)을 반영합니다⁵.

3D 조건에서 세포를 배양하는 데 사용할 수 있는 여러 가지 방법과 재료를 사용할 수 있습니다. 현재 3D 배양을 생성하기 위해 사용되는 주요 방법은 다음과 같습니다 : 1) 행잉 드롭; 2) 회전 세포 배양 및 부착성이 낮은 플라스틱; 3) 원뿔형 우물을 포함하는 피라미드 판; 4) 거대 다공성 골격; 5) 자석 구슬; 및 6) 스캐폴드가 없는 하이드로겔.

행잉 드롭은 스캐폴드가 없는 3D 배양을 얻는 데 사용되는 방법입니다. 이 방법은 광범위한 취급의 필요성, 낮은 생산 효율, 구형 형상 및 높은 전단력에 대한 노출을 포함하여 특정 제한 사항을 제시합니다. 또한 배지 교체 또는 화합물 첨가와 같은 특정 절차는 까다로울 수 있으며 재료 손실이 발생할 수 있습니다. 또한, 문헌 보고서에 따르면 일부 세포주는 이 접근법을 사용할 때 단단히 채워진 스페로이드를 생성하지 못합니다⁶.

회전식 세포 배양과 부착성이 낮은 플라스틱을 사용하여 세포가 기질에 부착되어 응집되어 스페로이드를 형성하는 것을 방지합니다. 이 프로세스에는 특정 플라스크 및/또는 교반/회전이 필요합니다. 이는 대규모 스페로이드 또는 오가노이드 생산을 위한 가장 간단한 접근 방식 중 하나이지만, 특정 장비의 필요성, 낮은 배양 수명, 스페로이드의 크기 변화, 세포의 기계적 손상 및 낮은 효율과 같은 단점이 없는 것은 아닙니다⁶.

원뿔형 웰을 포함하는 피라미드 플레이트는 상업적으로 이용 가능한 플레이트로서 비용에 영향을 미치며, 일부 조작이 스페로이드/오가노이드의 형성을 방해할 수 있다는 사실⁷.

거대 다공성 골격은 3D 배양에도 사용됩니다. 그러나 효과적인 세포 파종(cell seeding)과 균일한 분포를 달성하는 데 큰 장애물이 있습니다. 이 문제는 공극 크기가 너무 작아 세포가 침투할 수 없거나 너무 커서 세포를 안전하게 유지할 수 없기 때문에 발생합니다. 이 문제를 해결하기 위해 이 기술의 복잡성과 비용에 직접적인 영향을 미치는 몇 가지 전략이 검토되었습니다8.

마그네틱 비드 방법론은 적은 수의 스페로이드/오가노이드를 생성하고, 비용이 많이 들며, 세포 내부에 나노 입자 잔류물을 남길 수 있습니다⁹.

스페로이드를 배양하기 위한 시스템 중 비접착 아가로스 하이드로겔을 사용할 수 있으며, 이는 스캐폴드가 없는 하이드로겔을 나타냅니다. 이 접근 방식은 3D 구조의 크기를 정밀하게 제어하고 플레이트당 상당한 수의 이러한 구조를 생성할 수 있는 용량과 같은 주목할만한 이점을 제공합니다. 이 방법에서는 세포가 미리 형성된 웰이 있는 하이드로겔에 도입되어 3D 스페로이드¹⁰로 가라앉고 자체 조립됩니다.

본 연구에서는 마이크로패턴 몰드를 이용하여 간단하고 효율적이며 재현 가능하고 저렴한 방식으로 아가로스 마이크로웰을 생성하는 장치와 방법론을 제시한다.

이 스탬프를 중력의 도움을 받아 아가로스에서 마이크로웰을 생성하는 금형으로 사용하면 마이크로웰과 세포 조직 내에서 세포 상호 작용을 향상시켜 간단하고 효율적이며 재현 가능하고 저렴한 방식으로 체외에서 3D 구조(스페로이드/오가노이드)를 생성하여 연구 시간과 실험실 자원을 절약하는 것을 목표로 합니다.

Protocol

이 프로토콜은 2021년 9월 8일에 승인된 우리 기관 CEUA-FMUSP: 1699/2021의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르며, "돼지 췌장 섬의 격리 및 캡슐화"를 따르며, 세포 및 분자 치료 NUCEL 그룹(www.usp.br/nucel)의 주제 프로젝트, FAPESP 보조금 번호 2016/05311-2, "만성 퇴행성 질환(암 및 당뇨병) 치료를 목표로 하는 재생 의학"의 일부입니다.

1. 스탬프 장치의 제작

참고: 이 스탬프는 NUCEL 그룹(https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/)에서 맞춤 제작했습니다. 스탬프 장치는 정밀도와 고급 3차원 모델링 기능으로 널리 알려진 참조 소프트웨어를 사용하여 개발되었습니다.

1. 설계된 프로토타입에 스페로이드 또는 오가노이드와 같은 동일한 수의 3차원 배양을 생성할 수 있도록 배열된 663개의 마이크로핀이 있는지 확인합니다. T6 트레이 표면에 있는 스탬프의 안정성을 보장하려면 장치 둘레를 따라 5개의 지지점을 전략적으로 배치하십시오.
2. 마이크로핀이 길이가 1mm에서 3mm까지 조정 가능한 치수의 원뿔형 디자인인지 확인합니다. 원뿔의 기본 직경은 0.7mm에서 1.5mm 사이이며 테이퍼 각도는 5°에서 10° 사이입니다.
3. 마이크로핀의 깊이를 정의하는 장치의 "정지" 구조가 조정 가능한 길이가 10-19mm이고 직경이 20-40mm이며 표면 전체에 마이크로핀이 균일하게 분포되어 있는지 확인합니다.
4. 또한 한 손 조작에 적합한 인체공학적 손잡이를 갖도록 장치를 설계하여 사용 중 실용성과 정밀도를 향상시킵니다.
   참고: 장치의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 3D 프린팅 프로세스에 필수적인 .stl 형식의 디지털 파일이 제공됩니다.
5. 적절한 소프트웨어를 사용하여 슬라이스하고 호환되는 3D 프린터로 인쇄하기만 하면 됩니다. 다음 인쇄 치수를 사용하십시오 : X - 68 mm; Y - 120 밀리미터; Z - 150mm로 기능과 구조적 품질 간의 이상적인 균형을 보장합니다.
6. 장치 제작을 위해 최적의 장치 성능을 위한 필수 특성인 고해상도와 균일한 표면 마감이 필요한 UV 경화 고분자 수지와 호환되는 광경화 3D 프린터를 사용하십시오.
7. 선택한 3D 프린터와 호환되는 소프트웨어를 사용하여 인쇄하기 위해 디지털 모델을 슬라이스합니다.

2. 아가로스 마이크로웰의 준비

1. 아가로스 용액을 준비합니다.
   1. 순수한 아가로스 분말의 무게를 측정하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 1-2%(w/v)의 최종 농도를 달성합니다.
   2. 용액이 완전히 용해될 때까지 전자레인지나 수조에서 가열하여 균일하고 투명한지 확인합니다.
      알림: 과열이나 과도한 재가열은 아가로스를 저하시킬 수 있으므로 피하십시오. 많은 양의 원액을 준비하지 마십시오.
   3. 용액을 피펫팅에 이상적인 온도인 ~40 °C로 냉각시킵니다.
2. 주문 제작 스탬프를 준비합니다.
   1. 부드러운 강모 스폰지와 증류수로 스탬프를 씻어 잔여물을 제거합니다.
   2. 청소한 스탬프를 자외선에 5-10분 동안 노출시켜 무균 상태를 확인하십시오.
3. 마이크로웰을 형성합니다.
   1. 40°C 아가로스 용액 ~3mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 붓거나 피펫팅하여 2-3mm의 균일한 깊이를 보장합니다.
   2. 아가로스가 아직 따뜻할 때 우물 중앙에 맞춤형 스탬프를 놓습니다.
      참고: 스탬프에는 정렬과 안정성을 보장하는 측면 지지대가 있어 수동 지원이 필요하지 않습니다. 각 스탬프는 웰당 ~663개의 마이크로웰(높이 ~2mm)을 생성합니다. 마이크로핀에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포가 형성되면 스탬프를 부드럽게 움직여 제거합니다.
   3. 플레이트를 움직이지 않고 실온에서 5-10분 동안 아가로스가 응고되도록 합니다.
      참고: 마이크로웰 구조의 변화를 피하기 위해 응고 중에 아가로스를 방해하지 마십시오.
   4. 스탬프를 제거하십시오.amp부드러운 앞뒤로 움직여 마이크로웰을 손상시키지 않고 진공을 해제합니다.
      참고: 이 움직임은 공기 유입을 용이하게 하여 젤을 변형시키지 않고 부드러운 스탬프 제거를 가능하게 합니다. 마이크로웰은 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다.
   5. 마이크로웰을 PBS 용액으로 3회 세척하여 잔여물을 제거합니다.
   6. 미생물 오염을 방지하기 위해 플레이트를 10분 동안 자외선에 노출시킵니다.
   7. 3mL의 배양 배지를 추가하고 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
      참고: 이 배양은 세포 파종 전에 오염이 없는지 확인합니다.

3. 마이크로웰에서 세포 파종

1. 세포 현탁액을 준비합니다.
   1. 균일한 현탁액을 얻기 위해 트립신화(trypsinization) 또는 다른 해리 방법을 통해 세포를 수집합니다.
   2. 세포를 세고 마이크로웰당 원하는 수에 따라 농도를 조정합니다.
      참고: 663개의 마이크로웰에서 마이크로웰당 5,000개의 세포를 시딩^{하려면 총 세포} 10개 × 3.315개 이상을 포함하는 현탁액을 준비합니다. 세포 농도를 최적화하여 중심 괴사를 방지하고 적절한 영양분 및 산소 확산을 보장합니다.
2. 세포에 씨를 뿌립니다.
   1. 준비된 세포 현탁액 ~3mL를 마이크로웰 위에 피펫팅하여 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 균일한 분포를 보장합니다.
   2. 세포가 중력(~10-15분)에 의해 정착하도록 하거나 100×g에서 5 분 동안 부드러운 원심분리를 수행합니다.
      참고: 원심분리는 세포가 마이크로웰에 집중되도록 하는 데 사용할 수 있습니다.
   3. 플레이트를 가습 분위기에서 37°C의 CO₂ 인큐베이터로 옮깁니다.

4. 3D 세포 배양 유지

1. 배양 배지를 교체하십시오.
   1. 2-3일마다 배지를 교체하여 기존 배지의 50%를 제거하고 새 배지를 추가합니다.
      알림: 탈수를 방지하기 위해 배양 기간 동안 마이크로웰이 물에 잠긴 상태로 유지되도록 하십시오.
2. 3D 배양의 형성을 모니터링합니다.
   1. 3D 구조가 완전히 형성되고 조밀해질 때까지 배양을 계속합니다(예: 1차 췌장 섬 배양의 경우 2-3일).
      참고: 더 긴 형성 시간이 필요한 배양의 경우 2-3일마다 부분적인 배지 변경을 수행합니다.

5. 3D 구조의 수집 및 특성화

1. 스페로이드/오가노이드를 수집합니다.
   1. 오래된 매체를 제거하고 압축 또는 분해를 방지하기 위해 직경이 넓거나 절단된 피펫 팁을 사용하여 격렬한 피펫팅을 통해 3D 구조를 수집합니다.
      참고: 응집체를 변형시키지 않고 제거하기 위해 격렬한 피펫팅을 제어해야 합니다.
2. 분석을 준비합니다.
   1. 수집된 스페로이드/오가노이드를 즉시 사용하거나 향후 분석을 위해 고정합니다.
      참고: 스페로이드의 연관성과 안정성은 세포 유형, 형성 시간 및 배양 조건에 따라 다릅니다. 해리를 피하기 위해 주의가 필수적입니다.

Results

이 연구에 사용된 세포 배양은 돼지 췌장 섬에서 파생되었습니다. 이 연구에 사용된 섬 제제는 디티존 염색에 따라 80 ± 5%의 순도를 가졌고, 살아있는 세포에서 플루오레세인 디아세테이트 또는 죽은 세포에서 프로피듐 요오드화물(Live/Dead 형광법)의 검출에 따라 >80%의 섬 세포 생존율을 가졌습니다. 돼지 췌장 섬 제제가 최소 80% 순수하고(예: 디티존 염색에 의해) >80% 생존 가능한지 확인하십시오. 분리 시, 앞서 설명한 바와 같이 37°C 및 5% CO₂에서 1mM L-글루타민, 0.2% 시프로플록사신 및 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 CMRL 1066 배지에서 부착 배양을 유지합니다^11,12.

본 연구에서는 아가로스 주형에서 마이크로웰을 생성하기 위한 스탬프 기반 시스템의 효과를 철저히 평가했습니다(

Discussion

문헌에는 다양한 3D 배양 프로토콜이 존재하지만, Wassmer 등^[13 ]이 수행한 연구에서는 췌장섬을 사용하여 3D 구조를 생성하기 위한 몇 가지 방법론을 테스트했습니다. 저자들은 토착 섬과 자체 응집된 스페로이드가 크기와 모양에 대해 상당한 이질성을 보였으며 다른 방법을 사용하여 얻은 것보다 더 크다는 것을 관찰했습니다. 연구 결과를 바탕으로 그들은 스페로이드가 각각 고유한 장점과 단점이 있는 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다는 결론을 내렸습니다. Islet cell Aggregation의 경우 권장되는 방법은 행잉 드롭 기법, 아가로스 마이크로웰 플레이트 또는 Sphericalplate 5D입니다.

문헌에서 성공적으로 채택된 아가로스 마이크로웰을 생성하는 장치가 있습니다. 예를 들어, Stuart et ^al.14 은 장치를...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L 마이크로파	일렉트로룩	78965840 6699 9	아가로스 용액을 가열하는 데 사용되는 장비, 용해를 촉진하고 더 큰 균질성을 보장하는 데 사용됩니다. 그것은 용액이 우물의 형성을 위한 이상적인 액체 상태에 도달할 수 있도록 합니다.
3DFila Gray Opaque Photosensitive 3D Resin			UV 경화형 고분자 수지
3D 프린터 - Creality Halot One	Creality	N/A	3D 프린터 스탬프 장치
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	겔을 형성하려면 식염수 인산염 완충액(PBS) 또는 적절한 배지에 1-2%를 용해시킵니다.
Autodesk Fusion 360			3D 모델링
BB15 CO2 인큐베이터	Thermo Fisher	51023121	적절하고 통제된 환경에서 배양된 세포를 배양하는 데 사용되는 장비입니다.
Chitubox	Chitubox	N/A	용 부품 슬라이싱에 사용되는 소프트웨어
	VECO	N/A	설정된 매개변수 및 프로토콜 내에서 세포 배양을 수행하기 위한 멸균 환경을 보장합니다.
배양 배지	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	적절한 세포 배양을 위한 첨가제가 포함되어 있습니다.
배양 플레이트(P6)	SARSTEDT	1023221	아가로스를 형성하고 세포를 배양하는 데 사용됩니다.
삼각 플라스크 (25 mL)	Laborglas	91 216 14	1&ndash를 용해하는 데 사용되는 용기; PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 일반적으로 전자레인지에서 가열되는 다른 적절한 매체에 2% 아가로스.
Falcon 15 mL 폴리스티렌 원심분리기 튜브	Corning	352099	세포를 현탁액 상태로 유지하고 가능한 희석을 수행하는 데 사용됩니다.
소 태아 혈청 (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	배양 배지용 첨가제.
PBS 용액 (Saline Phosphate Buffer)	실험실에서		MiliQ 초순수로 1x 희석 한 N/A를 만들었습니다. 아가로스 1-2%를 용해시키고 이미 생산된 우물을 세척하는 데 사용됩니다.
파란색 캡이 달린 시약 병 - Schott	Laborglas	21801545	배양 배지를 준비하고 저장하는 데 사용됩니다.
스탬프 장치	NUCEL 그룹	N/A	링크 - 이 링크는 스탬프 장치의 .stl 파일에 대한 액세스를 제공합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 슬라이스하고 호환되는 3D 프린터로 인쇄하기만 하면 됩니다. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=공유
처리된 배양 플라스크와 필터 25 cm²	코닝	430639	부착 세포의 배양 및 유지에 사용됩니다.
Trypsin	Merck	07-07-9002	파종 전 세포 해리용.
자외선 (UV)	N/A	N/A	스탬프와 플레이트를 살균하는 데 사용됩니다.