이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
초파리 멜라노가스터 뇌의 면역 염색은 복잡한 행동, 신경 회로 및 단백질 발현 패턴의 메커니즘을 탐구하는 데 필수적입니다. 전통적인 방법은 종종 복잡한 해부 수행, 조직 무결성 유지, 고해상도 이미징 중 특정 발현 패턴 시각화와 같은 문제를 수반합니다. 당사는 동결 절편과 형광 염색 및 면역 염색을 결합한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 조직 보존 및 신호 선명도를 개선하고 초파리 뇌 이미징을 위한 힘든 해부의 필요성을 줄여줍니다. 이 방법은 신속한 해부, 최적의 고정, 동결 보호 및 동결 절편을 수반한 후 형광 염색 및 면역 염색을 수반합니다. 이 프로토콜은 조직 손상을 크게 줄이고 항체 침투를 강화하며 선명하고 잘 정의된 이미지를 생성합니다. 우리는 특정 신경 집단과 시냅스 단백질을 높은 충실도로 시각화하여 이 접근 방식의 효과를 입증합니다. 이 다재다능한 방법을 사용하면 여러 z-평면에 걸쳐 성인 뇌의 다양한 단백질 마커를 분석할 수 있으며 다른 조직 및 모델 유기체에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초파리 신경생물학 연구에서 고품질 면역조직화학을 수행하는 연구자에게 신뢰할 수 있고 효율적인 도구를 제공합니다. 이 방법의 상세한 시각화는 신경 해부학, 병리학 및 단백질 국소화에 대한 포괄적인 분석을 용이하게 하여 신경 과학 연구에 특히 유용합니다.
서론
사회적 상호작용1, 감각 지각 및 처리2, 학습3, 움직임4에 이르는 복잡한 행동은 뇌에 의해 주도된다. 신경 장애도 점점 더 흔해지고 있으며 시간이 지남에 따라 증가할 것으로 예측됩니다 5,6. 뇌가 건강과 질병 모두에서 어떻게 작용하는지 연구하는 것은 매우 중요합니다. 분자생물학의 중심 교리에 따르면, 생물학적 단위의 가장 중요한 기능 중 하나는 단백질7이며, 단백질이 얼마나 많이 발현되는지, 그리고 어디서 발현되는지는 뇌가 어떻게 작동하는지를 이해하는 데 매우 중요하다.
흔히 초파리(fruit fly)로 알려진 초파리(Drosophila melanogaster)는 노화 및 병태생리학적 조건에서 뇌 기능을 연구하는 데 매우 유용한 모델이다8. 초파리에서 고급 유전 도구를 사용할 수 있게 됨에....
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프로토콜
1. 장비 준비
- 저온 유지 장치의 전원이 켜져 있고 -20 °C로 설정되어 있는지 확인하십시오. 슬라이드 워머 또는 소형 인큐베이터의 전원을 켜고 37°C로 설정되어 있는지 확인합니다.
참고: 이 단계에서 라벨이 부착된 슬라이드는 워머 또는 인큐베이터에 놓고 절단될 때까지 무기한 방치할 수 있습니다.
2. 용액 준비
- 10x PBS 스톡에서 pH 7.4의 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL를 준비합니다. PBS에서 4% 파라포름알데히드 용액을 최종 부피 10mL로 준비합니다.
- 스프레이 병에 70% 에탄올의 물을 섞은 세척액을 준비합니다. 차단 용액(20x 스톡의 Tris-buffered Saline 중 3% 소 혈청 알부민(BSA))을 준비합니다. 1차 항체 용액을 준비합니다(희석은 실험에 따라 다름). 여기에서는 TBS에서 3% BSA에 ApoE 마우스 항체를 1:250 희석하여 사용합니다.
- 2차 항체 용액을 준비합니다(희석은 실험에 따라 다름). 여기에서는 TBS에서 3% BSA에 Alexa Flour 750 A210....
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결과
위에서 설명한 방법을 사용하면 성체 파리 뇌의 형광 이미징을 지루한 해부 없이 안정적으로 수행할 수 있습니다. 그림 1에서 간단히 볼 수 있듯이 이 방법은 간단하며 모든 시편, 장비 및 재료를 쉽게 구할 수 있는 경우 신속하게 수행할 수 있습니다. 또는 OCT 금형 단계에서 -80°C 보관을 사용하면 몇 주 후에 사용할 수 있도록 시편을 보관할 수 있습니다. 연구자들은 간단한 해부 및 임베딩 기술을 배우기 위해 오랜 시간 훈련을 받을 필요가 없으므로 이 방법을 쉽게 이용할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 수행된 형광 현미경 검사의 예는 그림 2A-D에서 볼 수 있습니다. 항체 태그(ApoE)와 형광 염색(Nile Red)의 .......
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토론
여기에서는 동결 절제된 초파리 머리의 정밀한 형광 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 몇 가지 중요한 장점이 있는 간단한 접근 방식입니다. 즉, 이 방법은 기본적인 실험실 안전 교육을 받은 사람이라면 누구나 이수할 수 있을 만큼 간단하고, 고품질 항체가 존재하는 모든 단백질의 발현을 측정할 수 있으며, 관심 단백질이 얼마나 많이 발현되는지와 머리 전체에서 해당 발현이 발생하는 위치를 정확하게 측정할 수 있습니다. 조직과 이미지 품질이 충분히 높으면 전체 초파리 머리에 걸쳐 발현을 3D 매핑할 수 있습니다.
컨포칼 현미경 검사와 결합된 이미징을 위해 뇌를 분리하는 기술적으로 어려운 접근 방식과 달리, 이 프로토콜은 뇌뿐만 아니라 초파리 머리 전체에 걸쳐 이미징을 가능하게 합니다. 이것은 파리 시각 시스템이 뉴런 기능의 중요한 모델이라는 점을 감안할 때
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
프로토콜 개발에 귀중한 피드백을 제공하는 데 도움을 주신 Melkani 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 플라이 스톡인 Elav-Gal4 (BL#458) 및 UAS-ApoE4 (BL#76607)는 Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA)에서 획득하였다. 이 작업은 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 AG065992 및 G.C.M에 대한 RF1NS133378의 지원을 받았습니다. 이 작업은 UAB Startup Funds 3123226 및 G.C.M의 3123227에서도 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1000 uL 피펫 | Eppendorf | 3123000063 | |
| 1000 uL 피펫 팁 | Olympus Plastics | 23-165R | |
| 10X 인산염 완충 식염수(PBS) | Fisher | J62036.K7 | ph=7.4 |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 64-17-5 | |
| 20X Tris 완충 식염수 | Thermo Scientific | J60877.K2 | pH=7.4 |
| AF750 염소 안티 마우스 2차 항체 | Alexa Fluor | A21037 | |
| 안티 롤 유리 | IMEB | AR-14047742497 | |
| ApoE 마우스 1차 항체 | Santa Cruz | SC13521 | |
| 소 혈청 알부민 | Fisher | 9048-46-8 | |
| 원심분리기 튜브 1.5mL | Fisher | 05-408-129 | |
| 충전 슬라이드 | Globe Scientific | 1415-15 | |
| 저온 절편 금형 | Fisher | 2363553 | |
| 저온 유지 장치 | Leica | CM 3050 S | |
| 저온 유지 장치 블레이드 | C.L. Sturkey | DT554N50 | |
| ??? | |||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fly Pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 경화 장착 매체 Dapi | Vectashield | H-1800 | |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | |
| 현미경 | Olympus | SZ61 | |
| Nile Red | Sigma | N3013 | |
| 최적 절단 온도 화합물 | Fisher | 4585 | |
| 오비탈 셰이커 | OHAUS | SHLD0415DG | |
| 파라포름알데히드 20% | 전자 현미경 과학 | 15713 | |
| 면도날 | Gravey | #40475 | |
| 스프링 가위 | 미세 과학 도구 | 15000-10 | |
| 설탕 | 피셔 | S5-500 |
참고문헌
- Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
- Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Ne....
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재인쇄 및 허가
