방법 논문

외상성 뇌 손상의 출혈 및 염증을 연구하기 위한 Stab-Wound Mouse 모델

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DOI:

10.3791/67797

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2025년 2월 21일

 ,  ,  , 
1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

이 논문에서

요약

단순화된 외상성 뇌 손상(TBI) 모델은 치료적 접근의 개발을 촉진했습니다. 이 프로토콜은 바늘을 사용하여 찔린 상처 마우스 피질을 생성하는 방법을 간략하게 설명하여 출혈 및 염증을 분석할 수 있습니다. 칼에 찔린 TBI 마우스 모델은 특수 장비 없이도 수행할 수 있는 이점을 제공합니다.

초록

외상성 뇌 손상(TBI)은 종종 사고나 스포츠 관련 사고로 인해 발생하는 신체적 손상으로 인해 발생합니다. TBI의 원인은 뇌진탕, 뇌 타박상, 혈종, 두개골 골절 등 다양합니다. 이러한 다양한 원인을 복제하기 위해 고유한 프로토콜을 사용하여 다양한 TBI 마우스 모델이 개발되었습니다. 신체적 뇌 손상은 1차 및 2차 뇌 손상으로 이어지며, 이는 신경 세포 손실을 악화시킵니다. 1차 손상은 손상 직후 종종 출혈로 인해 발생하며, 이후 병변 주변의 염증을 포함한 2차 부상을 유발합니다. 따라서 출혈 확장 및 염증성 중증도를 평가하는 데 적합한 TBI 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 TBI 병리학과 관련된 출혈, 염증 및 신경 손실의 메커니즘을 연구하기 위해 찔린 상처 TBI 마우스 모델이라고 하는 관통 뇌 손상을 모방하는 방법을 소개합니다. 이 모델은 바늘로 두개골과 뇌를 뚫어 만들어지며 특별한 실험 장비 없이도 간단하게 실행할 수 있습니다. 또한, 바늘을 사용하여 쥐의 대뇌 피질에 가한 경미한 부상은 수술 후 동물의 행동에 영향을 미치지 않습니다. 이 기능을 통해 연구자들은 광범위한 행동 결과에 대한 걱정 없이 뇌 손상의 국소적인 영향을 연구할 수 있습니다. 칼에 찔린 쥐의 대뇌 피질에서 채취한 샘플 데이터는 실질로의 혈액 누출, 신경교세포 활성화 및 염증성 사이토카인 생성을 평가하는 모델의 효과를 보여줍니다. 또한 이 프로토콜은 혈액 응고제 및 항염증 화합물의 평가를 용이하게 하여 TBI 치료제 개발을 지원합니다.

서론

외상성 뇌 손상(TBI)은 종종 교통 사고 및 낙상 사고를 포함한 사고로 인해 발생하는 신체적 손상으로 인해 발생합니다. TBI는 날카로운 물체가 두개골과 뇌를 관통할 때 발생하는 관통성 뇌손상과 두개골이 끊어지지 않고 뇌 내부가 격렬하게 흔들려 발생하는 폐쇄성 뇌손상의 두 가지 유형으로 분류됩니다1.

TBI의 원인은 뇌진탕, 뇌 타박상, 혈종, 두개골 골절 등 매우 다양합니다. 따라서 TBI 마우스 모델은 이러한 다양한 원인을 복제하기 위해 다양한 프로토콜을 사용하여 개발되었습니다. 예를 들어, 반복적인 뇌진탕 TBI 모델에는 뇌 흔들림이 포함되며, 전자기적으로 제어되는 고무 충격기2를 사용하여 쥐를 여러 번 갇히게 됩니다. 또한, 체중 감소 TBI 모델에서는 표준화된 체중 감소 장치에 의해 머리에 강한 외력이 가해져 두개골이 손상되지 않은 국소 둔기손상 3을 유발합니다. 또한, 칼에 찔린 상처 TBI 모델은 바늘4 을 사용하여 두개골과 뇌에 구멍을 뚫어 준비합니다(그림 1A). 여러 TBI 모델이 개발되었기 때문에 관찰해야 하는 특정 병리학에 따라 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

신체적 손상으로 인한 뇌 손상은 1차 및 2차 뇌 손상으로 이어져 신경 세포 손실을 더욱 악화시킵니다. 원발성 손상은 손상 직후 발생하며, 혈액뇌장벽(BBB)의 파괴, 출혈 및 혈종으로 인해 발생합니다. 따라서 출혈과 혈종 팽창을 최소화하는 것이 중요한데, 이러한 요인들이 TBI 증상의 중증도를 악화시킬 수 있기 때문이다. 2차 손상은 실질내 혈액 성분에 의해 유발되며, 이는 이후 병변 주변에 염증을 유발한다5. 뇌 손상 후 예후는 염증 역학에 따라 다릅니다. 따라서 유리한 예후를 위해 1차 및 2차 부상을 신속하게 완화하는 것이 중요합니다 6,7,8.

BBB는 내피 세포와 성상세포의 발끝 사이의 긴밀한 연접인 주피세포(pericyte)로 구성되어 있으며, 이 두 세포가 함께 작용하여 건강한 뇌의 혈관에서 물질이 누출되는 것을 제한합니다9. 제시된 찌르기 상처 시스템에서 BBB는 물리적으로 중단됩니다. BBB 무결성을 평가하는 일반적인 방법에는 면역글로불린 G(IgG)에 대한 염색 및 Evans blue 및 dextran10,11과 같은 형광 추적자의 누출 평가가 포함됩니다. IgG 염색은 병변 부위에서 누출되어 뇌에 침착되는 혈액 성분을 라벨링합니다. BBB가 회복됨에 따라 뇌로의 혈액 성분 누출이 감소하고 이러한 침전물은 점차 분해됩니다. 따라서 IgG 염색은 뇌 손상 후 BBB 회복 정도를 평가하는 데 사용됩니다. 또한, 정맥 주사로 투여된 추적자가 뇌 실질로 누출되는 수준은 BBB의 회복을 반영합니다. 이 방법은 추적자 누출이 혈류에서 뇌 실질로의 혈액 성분 전이를 직접 나타내기 때문에 BBB 역학에 대한 보다 명확한 평가를 제공합니다. 또한, 출혈을 최소화하면 경미한 원발성 부상으로 이어지며, 이는 신속한 혈액 응고와 시기 적절한 섬유소 용해에 의해 뒷받침됩니다. 따라서 혈액 응고 및 섬유소 용해 조절제의 발현을 정량화하는 것은 이 과정을 분석하는 효과적인 방법입니다. 응고의 기저에 있는 분자 메커니즘과 관련하여, 뇌 손상 후 출혈은 섬유소 형성에 의해 중단됩니다. 그 후, 피브린이 풍부한 혈전은 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 우로키나제 플라스미노겐 활성제(uPA)에 의해 분해됩니다. 칼에 찔린 상처를 입은 TBI 마우스 모델에서는 피브린 형성이 부상 후 1일에 최고조에 달하고 그 이후에는10일 후에 감소합니다. 따라서 BBB의 회복 수준은 혈액 성분 및 뇌 실질로의 추적자 유출, 혈액 응고 인자의 발현을 정량화하여 예측할 수 있습니다.

2차 손상 과정에서 염증에 대한 정량화 방법에는 신경교세포 활성화(glial activation)와 염증성 사이토카인 발현(inflammatory cytokine expression)이 포함됩니다. 장기간의 염증은 주로 병변 부위 주변에 과도한 미세아교세포와 성상세포 축적에 의해 유발됩니다. 예를 들어, 칼에 찔린 TBI 모델에서, 칼에 찔린 상처는 병변 주위의 신경교세포의 재활성화를 자극하여 세포 파편과 혈액 성분을 제거합니다. 이 신경교세포의 재활성화는 일반적으로 칼에 찔린 상처 후 3일 후에 최고조에 달한다12,13. 식세포작용(phagocytosis) 기능 외에도, 재활성화된 신경교세포는 과도한 염증성 사이토카인을 분비하여 병변 주위의 신경 세포 손실을 초래한다14. 신경교세포염증(glial inflammation)의 약화는 뇌손상 후 예후가 좋다고 보고되었다12,14. 염증의 정도를 판단하는 것은 중증도와 예후를 평가하는 데 유용합니다. 따라서 출혈 확장 및 염증성 중증도를 평가하기에 적합한 TBI 모델을 개발하는 것이 필수적입니다. 본 연구는 TBI 병리학에서 출혈, 염증 및 신경 소실의 기전을 연구하기 위해 관통 뇌 손상을 모방한 찌르기 상처 마우스 모델을 소개합니다.

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프로토콜

모든 동물 관리 프로토콜은 일본 오차노미즈 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 일본 문부과학성이 제정한 지침에 따라 수행되었습니다. 생후 6주령의 성체 C57BL/6J 암컷 마우스(20-25g)를 사용하였다. 모든 생쥐는 깨끗한 환경에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 대뇌 피질에 찌르는 상처 수술

  1. 시약의 준비
    참고: 마취 프로토콜은 앞서 설명한 것과 유사합니다15. 동물 시설에서 특정 마취제를 권장하는 경우 해당 지침을 따르십시오. 펜토바르비탈 나트륨이 대뇌 피질의 찌르기 수술에 효과적이라는 것은 이전에 확인되었습니다 4,13,16,17.
    1. 복합 마취제 MMB: 1mg/mL 메데토미딘 1.875mL, 5mg/mL 미다졸람 2.0mL, 5mg/mL 부토르판올 타르타르산염 2.5mL를 18.625mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 총 25mL를 생성합니다. 이 혼합물의 농도는 75mg/L 메데토미딘, 400mg/L 미다졸람 및 500mg/L 부토르파놀 타르타르산염 혼합물입니다. 사용하기 전에 최대 8주 동안 4°C에서 보관하십시오.
    2. 마취 길항제: 150μL의 5mg/mL 아티파메졸 염산염을 9.85mL의 PBS에 용해시켜 75mg/L 아티파메졸 염산염 농도의 총 부피 10mL를 생성합니다. 사용하기 전에 최대 8주 동안 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관하십시오.
  2. 수술 절차
    1. 마우스 마취: 이소플루란 흡입 용액에 적신 종이를 사용하여 마우스가 잠들 때까지 일시적으로 마취합니다. 그런 다음 27G x 3/4" 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 10μL/g 복합 마취제 MMB 복강내 마취제를 주입합니다. 3-5분 후 발가락 꼬집기를 수행하고 오른쪽 반사를 확인하여 마취 효과를 확인합니다.
      알림: 이소플루란 흡입 용액을 사용할 때 마취제를 과도하게 투여하지 않도록 세심한 주의를 기울이십시오.
    2. 마우스를 복부 쪽에 놓고 종이 타월에 넣습니다. 이식 후 마우스가 발가락 꼬집기로 여전히 마취되어 있는지 다시 확인합니다.
    3. 후두부 피부의 털을 면도합니다. 면봉을 사용하여 쥐의 머리 뒤쪽에 있는 털을 70% 에탄올로 소독합니다. 뭉툭한 집게로 후두부를 잡고 1.0-1.5mm 폭으로 절개하여 두개골이나 장기를 손상시키지 않고 후두골을 노출시킵니다. 절개 부위를 부드럽고 천천히 열어 두개골을 통해 대뇌 피질과 소뇌 사이의 경계를 관찰합니다(그림 1B).
      알림: 상처가 없는 마우스의 두개골이나 뇌에 손상이 발생하지 않는지 확인하십시오.
    4. 마우스 개두술: 19G x 1•1/2" 바늘을 사용하여 후두골의 오른쪽 반구에 작은 구멍을 만듭니다. 바늘을 부드럽게 회전하여 찔린 상처 바늘을 위한 삽입 지점을 만들고 뇌 실질이 손상되지 않도록 주의하십시오. 구멍은 람다와 가장자리 사이의 우반구 귀 간 선의 중간 지점에 위치해야 합니다(그림 1B). 이 구멍은 후속 단계에서 찔린 바늘을 삽입하기 위한 가이드 역할을 합니다.
    5. 찌르는 상처: 삽입 지점에서 27G x 3/4" 바늘을 삽입하고 배꼬리 축을 따라 대뇌 피질을 찌릅니다(그림 1B, C). 바늘은 두개골 앞쪽에 닿을 때까지 삽입한 다음 부드럽게 빼냅니다. 적절한 깊이는 대뇌 피질의 표면을 통해 바늘을 볼 수 있는 깊이입니다. 대뇌 피질의 왼쪽은 손상되지 않은 대조군으로 사용됩니다.
    6. 1/2 원형 바늘로 나일론 3-0 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
    7. 10μL/g의 마취 길항근제를 복합 마취제 MMB로 복강내 투여합니다. 마우스는 마취 길항제 주사 후 8-16시간 이내에 걸을 수 있어야 합니다.

2. BBB 파괴로부터 출혈 및 회복 평가

  1. 마우스 IgG 누출에 대한 찔린 상처 입은 뇌 절편의 면역효소 염색
    참고: 여기서는 슬라이드에 장착된 얼어붙은 뇌 절편이 사용되었습니다. 자유롭게 떠다니는 얼어붙은 뇌 절편도 이 프로토콜에 적합합니다.
    1. 마우스 마취: 마우스가 잠들 때까지 이소플루란 흡입 용액에 적신 종이 근처에 마우스를 놓아 마취를 유도합니다. 그런 다음 즉시 100μL/kg 복합 마취제 MMB를 복강내로 투여합니다. 발가락 꼬집음과 오른쪽 반사로 마취 효과를 확인합니다.
    2. 마우스를 등에 대고 양쪽 팔과 발을 해부 보드에 고정합니다.
    3. 마우스 흉흉술 : 뭉툭한 집게를 사용하여 복부 피부를 잡고 피부와 복막을 1.0-1.5cm 절개하여 흉곽을 노출시킵니다. 심장 손상을 피하면서 가위로 흉곽을 조심스럽게 열어 심장 관류를 위해 노출시킵니다.
    4. 심장 관류 고정: 연동 관류 펌프를 준비하고 한쪽 끝에 19G x 1•1/2" 바늘이 있는 튜브를 부착합니다. 사용하기 전에 펌프를 켜서 튜브에 PBS를 채우십시오. 그런 다음 펌프가 작동하는 동안 바늘 끝을 좌심실에 삽입하고 집게로 고정합니다. 우심방을 0.5-1.0mm 절개합니다. 혈액을 제거하기 위해 최소18mL 의 PBS와 함께 4분 동안 6-6mL/분의 속도로 마우스 20를 관류합니다.
    5. 펌프를 멈추고 튜브를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 옮깁니다. 고정18을 위해 PBS에 최소 20mL의 4% PFA를 사용하여 5분 동안 4-6mL/분의 속도로 펌프를 다시 시작합니다.
      참고: 펌프를 사용할 수 없는 경우 관류를 위해 19G x 1•1/2" 바늘이 있는 50mL 주사기를 사용할 수도 있습니다.
    6. 뇌 해부: 해부 보드의 복부 쪽에 마우스를 놓고 후두 부위에서 코까지 피부의 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 가위로 두개골을 제거하여 조심스럽게 뇌를 완전히 노출시킵니다. 구부러진 겸자로 뇌를 들어 올려 PBS 중 10mL의 4% PFA로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다.
    7. 완전한 고정을 위해 4°C에서 PBS의 4% PFA에 절개된 뇌를 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 15% 자당 10mL로 뇌를 하룻밤 동안 배양하고 PBS에서 30% 자당 10mL로 옮겨 시소 셰이커에서 하루 더 보냅니다. 이 점진적인 자당 대체는 뇌가 나중에 냉동실에 보관될 때 얼음으로 인한 조직 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다.
    8. 뇌 임베딩(Brain embedding): 조직 임베딩 몰드 내의 임베딩 배지에 뇌를 관상으로 삽입한 다음 드라이아이스와 함께 2-메틸부탄을 사용하여 동결19.
    9. 동결된 뇌 절편: 저온 유지 장치를 사용하여 내장된 뇌의 연속 관상 절편(20μm 두께)을 양전하 슬라이드 유리에 장착합니다. 뇌 절편은 실온에서 하룻밤 동안 완전히 자연 건조되어 -80°C의 냉동고에 보관됩니다.
    10. 차단 완충액 준비: TBS에 신생아 송아지 혈청 10%, 소 알부민 30mg/mL, 글리신 10mg/mL 및 트리톤 X-100 0.4%를 혼합하여 차단 완충액을 만듭니다. 사용하기 전에 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.
    11. 마우스 IgG 염색: 칼에 찔린 대뇌 피질 절편을 실온에서 1시간 동안 자연 건조시킨 후 30분 동안 슬라이드당 500μL의 4% PFA로 사후 수정합니다. 그런 다음 PBS(500μL/슬라이드)로 섹션을 5분 동안 세척한 다음 Tris-buffered Saline(TBS, 500μL/슬라이드)으로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
      알림: 완충액이 증발하는 것을 방지하기 위해 보습 상자에서 모든 절차를 수행하십시오.
    12. TBS에 10% 메탄올과 3% 과산화수소를 넣은 섹션에서 내인성 효소 활성을 5분 동안 담금질한 다음 트리스 완충 식염수(TBS, 500μL/슬라이드)로 각각 5분 동안 2회 세척합니다.
    13. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼(500μL/슬라이드)를 사용하여 차단을 수행합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 비오틴 접합 마우스 IgG 항체(차단 완충액을 사용한 1:300 희석, 300μL/슬라이드)로 절편을 배양합니다.
    14. 마우스 IgG 항체로 배양하는 동안 300μL의 차단 완충액에 avidin/biotin 기반 peroxidase 시스템 키트의 1μL의 시약 A와 1μL의 시약 B의 혼합물을 준비합니다. 사용하기 전에 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 마우스 IgG 항체 배양이 완료된 후 TBS로 절편을 5분, 3회 세척합니다. 그런 다음 준비된 시약 A와 B의 혼합물(300μL/슬라이드)로 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    15. 0.1 M Tris-HCl pH 8.0으로 5 시간 동안 3 회 1 회 섹션을 세척합니다. 그런 다음 0.05 % 과산화수소가 첨가 된 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 μL / 슬라이드)에서 0.05 % 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB)을 사용하여 5 분에서 1 시간 동안 색상을 현상합니다 (그림 2A). 반응을 멈추기 전에 현미경으로 색상 변화를 관찰하십시오.
    16. 0.1M Tris-HCl pH 8.0으로 단면을 5분 동안 3회 세척하고 단면을 15분 동안 자연 건조합니다. 그 후, 95% 에탄올에 2분 동안 두 번 담근 다음 100% 에탄올에 2분 동안 두 번 담궈 섹션을 탈수합니다. 자일렌의 단면을 5분 동안 두 번 지웁니다. 물에 불용성 장착 매체를 사용하여 섹션을 커버슬립하고 건조시킵니다.
    17. 마우스 IgG 염색 강도 분석: 20x 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 절편의 이미지를 캡처합니다.
    18. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 섹션의 면역효소 염색 영역에서 무작위로 선택된 5개의 필드(각각 8 × 8μm2 )에서 평균 회색 값을 측정하여 염색 강도를 정량화합니다. 각 반대측의 평균 회색 값을 사용하여 염색 강도를 정규화합니다. 배경 보정으로 부상 부위는 없습니다. 5개 필드에서 정규화된 평균 회색 값의 평균을 계산하여 각 섹션에 대한 마우스 IgG 염색의 평균 회색 값을 결정합니다.
  2. Evans blue의 뇌 실질로의 누출 평가
    참고: Evans blue protocol은 앞서 설명한 방법11과 유사합니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 덱스트란은 BBB 분해10 회복에도 작용합니다.
    1. 에반스 블루 주사: 해부 1시간 전에 꼬리 정맥을 통해 칼에 찔린 마우스에게 PBS(3mL/kg)에 2% 에반스 블루를 투여합니다.
    2. 신선한 뇌 추출: Evans 블루 투여 후 1시간 후 2.1.1-2.1.4단계에 설명된 대로 PBS로 마우스를 관류합니다. 그런 다음 뇌 슬라이서를 사용하여 신선한 뇌를 관상동맥으로 1mm 두께로 절개하여 자릅니다. 그래프 논문에 따르면 4개의 슬라이스를 선택하고 칼에 찔린 부위 또는 상처가 없는 대뇌 피질의 손상되지 않은 영역을 포함하는 뇌 조각(각각 1mm2 제곱)을 잘라냅니다(그림 1D).
    3. Evans blue 정량화: 1.5mL 튜브에 4개의 뇌 조각을 수집하고 조직 분쇄기를 사용하여 200μL의 트리클로로아세트산으로 균질화합니다. 균질액을 10,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫으로 상층액을 수집하고 600μL의 에탄올로 희석합니다. 농도를 정량화하기 위해 0-1.0ng/mL 범위의 Evans blue의 표준 곡선을 준비합니다. 플레이트 리더를 사용하여 620nm의 여기 파장으로 680nm에서 형광 강도를 측정합니다.

3. 찔린 상처 후 뇌의 염증 수준 평가

  1. 신경교세포에 대한 찔린 상처 입은 뇌 절편의 면역효소 염색
    1. 뇌 절편 준비: 2.1.1-2.1.9 단계에서 설명한 대로 뇌 절편에 슬라이드 안경을 장착합니다.
    2. 신경교세포 염색: 칼에 찔린 대뇌 피질 절편을 1시간 동안 자연 건조시킨 후 4% PFA(500μL/슬라이드)로 절편을 30분 동안 다시 고정합니다. 그런 다음 PBS(500μL/슬라이드)로 섹션을 5분 동안 세척한 다음 TBS(500μL/슬라이드)로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
    3. TBS에 10% 메탄올과 3% 과산화수소를 넣은 섹션에서 내인성 효소 활성을 5분 동안 담금질한 다음 트리스 완충 식염수(TBS, 500μL/슬라이드)로 각각 5분 동안 2회 세척합니다.
    4. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼(500μL/슬라이드)를 사용하여 차단을 수행합니다.
    5. 1차 항체(300 μL/슬라이드)로 절편을 밤새 배양합니다. 1차 항체에 대해 다음 희석액을 사용하십시오: Iba1의 경우 1:3,000 희석, GFAP의 경우 1:1,000 희석을 블로킹 완충액에서 희석합니다.
    6. TBS로 각 5분씩 섹션을 세 번 씻습니다. 그런 다음 비오틴 접합 2차 항체(차단 완충액을 사용한 1:300 희석, 300μL/슬라이드)를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    7. 2차 항체로 배양하는 동안 300μL의 차단 완충액에 avidin/biotin 기반 peroxidase 시스템 키트의 1μL의 시약 A와 1μL의 시약 B의 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 사용하기 전에 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    8. 2차 항체 배양이 완료된 후, TBS로 절편을 각각 5분씩 3회 세척하고, 준비된 시약 A와 B의 혼합물(300μL/슬라이드)로 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    9. 0.1 M Tris-HCl pH 8.0으로 5 시간 동안 3 회 1 회 섹션을 세척합니다. 그런 다음 0.05 % 과산화수소가 첨가 된 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 μL / slide)에서 0.05 % DAB를 사용하여 30 분에서 3 시간 동안 색상을 현상합니다. 반응을 멈추기 전에 현미경으로 색상 변화를 관찰하십시오.
    10. 0.1M Tris-HCl pH 8.0으로 단면을 5분 동안 3회 세척하고 단면을 15분 동안 자연 건조합니다. 그 후, 95% 에탄올에 2분 동안 두 번 담근 다음 100% 에탄올을 2분 동안 두 번 담가 섹션을 탈수합니다. 자일렌의 단면을 5분 동안 두 번 지웁니다. 물에 불용성 장착 매체를 사용하여 섹션을 커버슬립하고 건조시킵니다. 20x 대물렌즈를 가진 현미경을 사용하여 단면 이미지를 캡처합니다.
  2. 신경교세포에 대한 찔린 상처 입은 뇌 절편의 면역형광 염색
    1. 뇌 절편 준비: 2.1.1-2.1.9 단계에서 설명한 대로 뇌 절편에 슬라이드 안경을 장착합니다.
    2. 신경교세포 염색: 칼에 찔린 대뇌 피질 절편을 1시간 동안 자연 건조시킨 후 4% PFA(500μL/슬라이드)로 절편을 30분 동안 다시 고정합니다. 그런 다음 PBS(500μL/슬라이드)로 섹션을 5분 동안 세척한 다음 TBS(500μL/슬라이드)로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼(500μL/슬라이드)를 사용하여 차단을 수행합니다.
    3. 1차 항체(300 μL/슬라이드)로 절편을 밤새 배양합니다. 1차 항체에 대해 다음 희석액을 사용하십시오: Iba1의 경우 1:3,000 희석, GFAP의 경우 1:1,000 희석, 차단 완충액에서 희석.
    4. TBS로 각 5분씩 섹션을 세 번 씻습니다. 그런 다음 형광 접합 2차 항체(차단 완충액을 사용한 1:300 희석, 300μL/슬라이드)를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    5. TBS로 절편을 각각 5분씩 3회 세척하고 TBS(500μL/슬라이드)의 0.4μg/mL DAPI 용액으로 절편을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    6. TBS(500μL/슬라이드)로 5분, 증류수(500μL/슬라이드)로 5분 동안 섹션을 세척합니다. 섹션을 15분 동안 공기 건조시킨 후 수성 장착 매체로 덮고 건조시킵니다. 20x 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 단면 이미지를 캡처합니다.
  3. 신경교세포 마커 및 염증성 사이토카인을 위한 Real-time qPCR
    참고: 제시된 프로토콜에 사용된 프라이머 서열 16,20,21,22는 표 1에 나열되어 있습니다.
    1. 신선한 뇌 조직 준비: 2.1.1-2.1.4 단계에 설명된 대로 PBS로 마우스를 관류합니다. 그런 다음 뇌 슬라이서를 사용하여 신선한 뇌를 1mm 두께의 부분으로 추출하여 자릅니다. 그래프 논문에 따르면 4개의 슬라이스를 선택하고 대뇌 피질의 반대쪽 측면에 있는 칼에 찔린 상처 부위 또는 손상되지 않은 영역을 포함하는 뇌 조각(각각 1mm2 제곱)을 잘라냅니다. 중앙의 병변을 포함하여 잘라낼 영역을 결정합니다(그림 1D).
    2. RNA 추출: 1.5 mL 튜브에 4개의 뇌 조각을 모으고 피펫팅을 통해 1 mL의 TRIzol 시약으로 균질화합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 200μL의 클로로포름을 넣고 와류를 잘 일으키고 실온에서 추가로 2분 동안 배양합니다. 혼합물을 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. DNA와 단백질이 포함된 흰색 침전물을 피하면서 상부의 투명한 층을 새로운 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. 수집된 상층부에 500μL의 이소프로판올을 첨가하고 잘 섞은 후 실온에서 10분 동안 배양합니다. 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 제거하고 70% 에탄올 1mL를 첨가하여 RNA 펠렛을 세척합니다. 7,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 완전히 제거하고 펠릿을 10분 동안 자연 건조합니다. RNase가 없는 물 15μL에 RNA 펠릿을 용해시키고 55°C에서 10분 동안 RNA를 변성시킵니다.
    4. 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다. RNA를 즉시 -80°C에서 보관하십시오.
    5. cDNA 합성: cDNA 합성을 위해 시판되는 DNA 합성 키트를 사용하십시오. 각 샘플에 대해 1.5μL 튜브에 총 10μL의 반응 완충액을 준비하며, 여기에는 2 μL의 5 x RT 완충액, 0.5 μL의 RT 효소 혼합물, 0.5 μL의 프라이머 혼합물, 1 μg의 RNA 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함됩니다. 역전사 반응의 경우 37°C에서 15분 동안 배양하고 효소 불활성화 반응의 경우 5분 동안 98°C에서 배양합니다. 그런 다음 90μL의 뉴클레아제가 없는 물을 완충액에 넣고 잘 섞습니다. cDNA 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
    6. RNA 발현 정량화: Real-time qPCR 분석을 위해서는 시중에서 판매되는 qPCR 마스터 믹스 키트를 사용하십시오. 2μL의 뉴클레아제가 없는 물에 5μL의 KOD SYBR qPCR Mix, 0.4μL의 5μM 정방향 프라이머, 0.4μL의 5μM 역방향 프라이머, 0.2μL의 50 x ROX를 결합하여 각 샘플에 대한 Mix 용액을 준비합니다.
    7. 8-strip tube에 2 μL의 cDNA 용액과 8 μL의 Mix 용액을 혼합하여 잘 혼합한 후 spin down합니다.
    8. 98°C에서 2분 동안 PCR 반응을 시작한 다음 98°C에서 10초, 60°C에서 10초, 68°C에서 30초의 40사이클을 수행합니다. 실시간 qPCR 기계를 사용하여 용융/해리 곡선 분석 단계를 수행합니다.
    9. mRNA 발현 분석: 하우스키핑 유전자인 Gapdh로 정규화한 다음 반대쪽23으로 정규화하여 수행하는 2-Delta-Delta-Ct 방법을 사용하여 mRNA 발현 수준을 분석합니다.

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결과

BBB 파괴로부터의 회복을 분석하기 위해, 뇌 손상 후 1일, 3일, 5일, 7일에 혈청 IgG의 혈관 유출 수준을 측정하여 칼에 찔린 상처 입은 대뇌 피질의 출혈 수준을 평가했습니다. 쥐의 IgG 염색 영상은 뇌 손상 후 대뇌 피질에 혈액 누출과 침착이 있음을 보여주었습니다. 이는 BBB가 회복되고 IgG 단백질이 분해됨에 따라 7일 이상 경과한 후 감소했습니다(그림 2B). IgG 유출 수준은 찔린 상처 부위 주변의 IgG 염색 강도를 측정하여 정량화되었으며, 이는 IgG 유출이 뇌 손상 후 1일 후에 최고조에 달했음을 나타냅니다(그림 2C). BBB 파괴로부터의 회복을 확인하는 것 외에도, 찌르는 상처 후 뇌 실질로의 Evans blue 누출을 정량화했습니다. 온전한 뇌에서 BBB는 에반스 블루가 혈관에서 뇌로 누출되는 것을 방지합니다. 그러나 뇌 손상 후 BBB 파괴로 인해 상처 부위 주변에 즉시 Evans blue...

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토론

여기에서는 바늘을 사용하여 TBI 마우스 모델을 만들기 위한 프로토콜이 소개되었습니다. 이 프로토콜은 조직학적 및 분자 생물학적 접근 방식을 사용하여 BBB 파괴 및 뇌 손상 후 염증으로부터의 회복을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 반복적 뇌진탕 TBI 모델 및 체중 감소 TBI 모델과 같은 대체 프로토콜도 BBB 파괴 및 염증을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 특수 기계를 사용하여 충격 강도, 범위 및 뇌 영역에 대한 특정 매개변수를 포함하여 통제된 조건에서 TBI 병리학을 복제합니다. 또한 두개골이 손상되지 않은 폐쇄성 뇌 손상을 일으킬 수 있습니다. 반대로, 제안된 칼에 찔린 상처 TBI 모델은 두개골과 뇌 손상으로 인한 관통 뇌 손상을 모두 모방합니다. 또한, 제시된 프로토콜은 좁은 범위 내에서 뇌 손상을 유발할 수 있기 때문에 BBB 파괴 및 염증을 분석하기 위한 관찰 영역을 명확하게 정의하는 것이 중요합니다. 이것은 평소보다 얇은 바늘을 사용...

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공개 사항

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감사의 글

면역조직화학과 real-time qPCR에 도움을 주신 Ayana Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi, Nito Nakahira에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS KAKENHI 19K16122, 다케다 과학 재단, 아스텔라스 대사 장애 연구 재단, 미쓰비시 재단, 뇌 과학 재단 및 우에하라 기념 재단의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
19 G x 1• 1/2" 바늘TERUMONN-1938R 
27 G x 3/4 "바늘TERUMONN-2719S
anti-GFAP 항체Sigma-AldrichG9269
anti-Iba1 항체Wako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku Kogyo제품명 : Antisedan
Biotin-conjugated mouse IgG antibodyVector LaboratoriesBA-9200
비오틴 활용 토끼 IgG 항체Vector LaboratoriesBA-1000
소 알부민Nacalai tesque01860-07
Brain SlicerVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji Animal Health제품명 : Vetorphale 5 mg
컨포칼 현미경ZeissLSM700
크라이오스타트 LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blueWako056-04061
형광 접합 토끼 IgG 항체InvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02수성 장착 매체
이소플루란 흡입 용액Viatrisv002139
KOD SYBR qPCR 믹스TOYOBOQKD-201qPCR 마스터 믹스 키트
메데토미딘일본 젠야쿠공업상품명: Domitor
현미경OlympusFSX100
미량 분광 광도계ThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01수불용성 장착 매체
신생아 송아지 혈청Gibco16010159
O.C.T. 컴파운드Sakura Finetek Japan45833임베딩 매체
Peel-A-Way, 잘린 22mm 스퀘어 탑Ted Pella27118조직 임베딩 몰드
연동 관류 펌프ATTOSJ-1211
플레이트 리더Fisher ScientificCytation 3
실시간 qPCR 기계ThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA 합성 키트
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15양전하 슬라이드 유리
바늘이 있는 봉합사 AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol 시약Invitrogen15596026
VECTASTAIN ABC 표준 키트Vector LaboratoriesPK-4000Avidin/biotin-based peroxidase system kit

참고문헌

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