방법 논문

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

DOI:

10.3791/67802

⸱

2025년 4월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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FoxP1 전사 인자의 디옥시리보 핵산(DNA)-결합 포크헤드(FKH) 도메인의 국소 유연성과 역학을 조사하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 수행하는 프로토콜에 대해 설명합니다. FoxP1은 3D-DS(3차원 도메인 스와핑) 메커니즘을 통해 이합체화되어 DNA가 있거나 없는 무질서한 중간체를 형성합니다. 3D-DS는 본질적으로 무질서한 영역과 관련이 있기 때문에 FoxP1의 구조적, 기능적 특성을 설명하기 위해서는 해당 영역의 동작을 이해하는 것이 중요합니다. 단일 시스테인 표지된 FoxP1을 사용하여 단일 분자 형광 이방성(smFA) 실험을 수행했으며, 동적 이방성 광자 분포 분석(daPDA) 및 시간 분해 이방성 버스트 분산 분석(traBVA) 접근 방식을 적용하여 국소 유연성과 역학을 조사했습니다. 이 프로토콜은 smFA 측정을 위한 상세한 단계별 가이드를 제공하며, 시간 분해 분석, 분산 및 확률 분포 기술을 강조하여 다양한 시간 척도에 걸쳐 구조적 역학을 캡처합니다. 이 접근 방식을 통해 역학 및 이질성을 FoxP1 이합체 및 DNA 결합과 관련시켜 이 전사 인자를 특징짓는 복잡한 작용 메커니즘을 강조할 수 있었습니다.

서론

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생체 분자의 기능적 활성은 분자 유연성과 구조적 역학에 따라 다릅니다 1,2,3. 당연히 생체 분자는 급격한 움직임부터 기능에 영향을 미치는 장기적인 구조적 변화에 이르기까지 지속적인 열 변동을 경험합니다(그림 1)4. 생체 분자에서 국소 백본 운동은 효소의 힌지 굽힘(hinge bending) 및 운동 단백질의 중요한 구조적 변화를 포함하여 더 큰 규모의 글로벌 운동에 기여합니다. 핵자기공명(NMR)5, X선 결정학6 및 극저온 전자 현미경(cryo-EM)7과 같은 구조 결정 방법은 다양한 생체 분자에서 여러 형태를 밝혔습니다. 그럼에도 불구하고, 국부적 변동을 생체 분자의 큰 구조적 역학과 기능에서의 역할에 연결하는 것은 대부분 탐구되지 않았습니다. 역학 및 구조를 관련시키는 것은 특히 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)의 경우 어려울 수 있습니다8,9,10. 구조화된 단백질과 달리 IDP는 안정적인 3차 구조를 유지하지 않습니다. 대신, 그들은 유사한 자유 에너지 수준으로 광범위한 구조적 변화를 겪어 광범위한 생물학적 활동을 가능하게합니다11 , 12 .

단백질의 분자 유연성을 조사하여 단백질의 구조적 역학을 조사하기 위해 여러 가지 실험적 접근 방식이 사용되었습니다 1,13,14,15,16. 이 중 NMR은 수십 피코초에서 몇 시간12에 이르기까지 다양한 시간 척도에 걸쳐 원자 수준의 해상도를 제공할 수 있는 능력이 두드러집니다. 그러나 고분자 유연성을 결정하는 것은 높은 자유도와 큰 크기의 단백질로 인해 여전히 어렵습니다. 따라서 NMR은 종종 약 100kDa의 생체 분자를 연구하는 것으로 제한됩니다17.

IDP와 같은 매우 역동적인 단백질의 구조적 복잡성을 감안할 때, 단백질의 기능을 이해하기 위해 국소 및 장거리 구조적 공간을 탐색하기 위해 추가적인 방법론적 발전이 개발되었습니다11. 단일분자 다중파라미터 형광 분광법(smMFS)18,19,20,21,22는 생체 분자에 대한 광범위한 정보를 제공하여 생체 분자의 기능, 구조적 역학, 결합 상태 및 화학량론에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 그러나 생체 분자에서 얻은 방대한 양의 구조 데이터를 해석하는 것은 어려우며 분자 역학, 형광단 거동 및 분자의 복잡한 거동과 같은 요인은 데이터 분석을 더욱 복잡하게 만들 수 있습니다 23,24,25,26,27,28.

당사는 단일 분자 형광 이방성(smFA)을 생체 분자의 골격을 따라 국소 및 글로벌 역학을 평가하기 위한 강력한 방법으로 사용합니다(그림 1A). Perrin29에 의해 처음 기술되고 Weber30,31에 의해 생물 분석 도구32로 도입 된 형광 이방성은 나중에 시간 분해 형광 기술의 출현과 검출기의 감도33 , 34 , 35 , 36 , 37 의 증가로 단일 분자 연구에 적용되었습니다. smFA는 피코초에서 몇 시간에 이르는 광범위한 시간 척도에 걸쳐 있으며 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(smFRET) 실험에서 얻은 데이터를 보완합니다38.

smFA는 생체 분자 역학에 대한 중요한 정보를 추출하기 위해 다양한 형식으로 시각화할 수 있습니다(그림 1B). 시간 분해 형광 이방성 감쇠는 피코초에서 나노초 시간 척도39,40의 역학을 캡처하는 1차원 히스토그램입니다. 형광 수명과 개별 분자의 이방성을 연관시키는 2차원 단일 분자 히스토그램은 이방성 상태의 이질성을 드러내고 컨포칼 실험(~ms)에서 관찰 시간 내에 잠재적인 역학에 대한 시각적 통찰력을 제공할 수 있습니다41,42. 밀리초 미만의 동역학을 연구하기 위해 daPDA(Dynamic Anisotropy Photon Distribution Analysis)를 사용할 수 있으며, traBVA(Time-resolved Anisotropy Burst Variance Analysis)는 약밀리초 43(그림 1B)에서 특정 동역학을 확인할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다.

이러한 방법은 더 넓은 스펙트럼44,45,46,47을 갖는 편광 분해 형광 상관 분광법(pFCS)과 같은 보다 전통적인 도구를 보완합니다. 전반적으로, smFA를 위한 여러 데이터 분석 도구는 적절한 보정이 고려되는 경우 지역 및 글로벌 구조적 변화를 쉽게 식별할 수 있습니다.

여기에서는 smFA를 적용하여 인간 FoxP1 전사 인자48,49,50,51의 DNA 결합을 연구합니다. 이 단백질은 폴리펩티드 사슬의 본질적으로 무질서한 특성으로 인해 도메인 스와프된 이량체를 채택하며, 이는 단백질의 4차 상태와 DNA의 존재 여부에 따라 특히 영향을 받습니다. BODIPY-FL로 표지할 다양한 단일 시스테인 돌연변이를 생성하고, smFA 실험을 수행하고, daPDA 및 trBVAa를 사용했습니다. 이 접근 방식을 통해 FoxP1 이합체화 및 DNA 결합에 대한 역학 및 이질성을 연관시켜 이 전사 인자를 특징짓는 복잡한 작용 메커니즘을 강조할 수 있었습니다.

프로토콜

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참고: 적절한 형광단을 선택하는 것은 smFA 실험에 필수적입니다. 생체 분자는 사용 가능한 반응 그룹에 따라 단백질의 아미노산 또는 형광 마커가 있는 핵산의 뉴클레오티드 염기를 변형하여 부위 특이적 위치에서 표지할 수 있습니다. 유기 염료52 중에서 Alexa Fluor, Cy, BODIPY 및 Janelia Farms 제품군은 긴 형광 수명, 광안정성 및 높은 양자 수율 덕분에 smFA에 가장 인기 있는 선택입니다. BODIPY-FL은 연장된 형광 수명, 우수한 양자 수율 및 짧은 연결 링커로 인해 선호되는 경우가 많습니다. 또한, 대체 형광단은 벌크 기법이 선호되는 약물 스크리닝에 일반적으로 사용된다53. 키메라 형광 단백질은 라이브 셀 이방성 실험 및 이미징에도 사용할 수 있지만 동적 범위가 더 낮다는 제한이 있습니다.

1. 완충액 준비

알림: 실험실 실험을 하는 동안 장갑, 보안경, 실험용 가운을 착용하십시오.

  1. 표준 완충액(20mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산[HEPES], pH 7.8, 150mM NaCl): 초순수 400mL에 HEPES 2.38g, NaCl 4.38g을 용해하고 pH를 7.8로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
  2. 용해 완충액(20mM HEPES, pH 7.8, 150mM NaCl, 0.1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드[PMSF], 10μg/mL DNAse): 초순수 400mL에 HEPES 2.38g, NaCl 4.38g 및 PMSF 8.71mg과 최종 농도 10μg/mL DNAse를 용해하고 pH를 7.8로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
  3. 평형 완충액(50mM 인산염 완충 식염수[PBS], 150mM NaCl 및 10mM 이미다졸, pH 7.4): 초순수 400mL에 Na2HPO4 5.05g, NaH2PO4 0.85g,NaCl 4.38g 및 이미다졸 0.34g을 용해하고 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
  4. 세척 완충액(50mM PBS, 150mM NaCl 및 30mM 이미다졸, pH 7.4): 초순수 400mL에 Na2HPO4 5.05g, NaH2PO4 0.85g, NaCl 4.38g 및 이미다졸 1.02g을 용해하고 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
  5. 용리 완충액(50mM PBS, 150mM NaCl 및 250mM 이미다졸, pH 7.4): 초순수 400mL에 Na2HPO4 5.05g, NaH2PO4 0.85g, NaCl 4.38g 및 이미다졸 8.5g을 용해하고 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만듭니다.
  6. PBS 완충액(50mM 인산나트륨 완충 식염수, 150mM NaCl, pH 7.4). 초순수 400mL에 Na2HPO4 5.05g, NaH2PO4 0.85g, NaCl 4.38g을 용해하고 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피를 500mL로 만든다.
  7. 0.22μm 공극 크기 필터를 사용하여 용액을 여과하여 모든 완충액을 멸균하고 완충액을 실온(RT)에서 보관합니다.
  8. 단일 분자 획득을 위해 숯 필터를 사용하여 표준 버퍼를 필터링합니다.

2. 형광성 탐침

  1. BODIPY-FL: 1.29mL의 갓 개봉한 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 최종 부피를 추가하여 BODIPY-FL이 포함된 5mg 바이알을 용해하여 10mM BODIPY-FL의 최종 농도를 얻습니다.
  2. 로다민 110: 10mM 로다민 110의 최종 농도를 얻기 위해 갓 개봉한 DMSO 1mL의 최종 부피를 첨가하여 로다민 110 3.67mg을 용해시킵니다.
    알림: 형광 프로브는 빛에 노출될 때 피해야 합니다. 항상 빛에 민감한 튜브(호박색)를 사용하고 알루미늄 호일로 감싸십시오. DMSO가 이미 개봉된 경우 저장 수명을 늘리기 위해 건조기에 보관해야 합니다.
  3. 제조된 형광 프로브의 소량 분취액을 준비하고 추가 사용 전까지 -20°C에서 보관합니다.
    알림: 라벨링 효율성을 향상시키기 위해 동결-해동 주기를 피하십시오.

3. 교정 측정

  1. 4개의 검출 채널과 2개의 펄스 레이저(청색 485nm 및 적색 640nm)가 있는 자체 제작 편광 분해 설정에서 다중 파라미터 형광 검출(MFD) 실험을 수행합니다54. 그러나 이방성 측정의 경우 파란색 레이저와 두 개의 검출기 채널을 사용하십시오.
  2. 감지기 채널(평행 및 수직)과 파란색 레이저 출력을 켭니다.
  3. 레이저 출력이 60μW로 설정되어 있는지 확인하고 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 소프트웨어36 제어판을 엽니다.
  4. 1 μL의 100 Rhodamine 110과 49 μL의 증류수를 혼합하여 2 nM Rhodamine 110의 최종 농도를 만듭니다. 보정 측정을 위해 50μL의 2nM Rhodamine 110을 커버 유리 중앙에 추가합니다.
  5. 다음으로, 현미경 대물렌즈 위에 침지 액체(기름 또는 물이지만 동일한 굴절률을 공유하도록 주의)를 한 방울 떨어뜨려 현미경의 해상력을 높입니다.
  6. 대물 렌즈 위에 커버 유리를 놓고 물방울이 현미경 대물렌즈의 중앙에 있는지 확인합니다.
  7. 이미지 평면이 용액 내부와 유리 표면 위에 오도록 조정합니다.
  8. 노브를 조정하여 두 번째 밝은 초점을 찾고 1.5 점으로 돌립니다. 유리와 액체의 계면에 레이저의 초점을 맞춥니다.
  9. 광자 계수 속도를 모니터링하면서 핀홀 위치(70μm)를 조정하여 검출된 광자 수를 최대화합니다.
  10. 시간 태그가 지정된 시간 간선(TTTR 또는 T3) 모드 패널에서 소프트웨어를 열고 시작 버튼을 클릭합니다. 120초 동안의 계수 속도를 기록하고 수집 소프트웨어를 사용하여 Rhodamine 110.ptu 파일 형식을 저장합니다. 이 획득 시간은 농도(2nM)를 고려하여 충분해야 합니다.
  11. 백그라운드 측정을 위해 커버 유리 중앙에 증류수 50μL를 추가하고 3.5-3.10단계를 반복합니다. 그러나 300초 동안 광자 계수 속도를 기록하고 water.ptu 파일을 저장합니다.
  12. 다른 백그라운드 측정의 경우 커버 유리 중앙에 50μL의 표준 버퍼를 추가하고 3.5-3.10단계를 반복합니다. 300초 동안 광자 계수 속도를 기록하고 표준 buffer.ptu 파일을 저장합니다. 그런 다음 BIFL(Burst Integration Fluorescence Lifetime) 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

4. 교정 및 데이터 분석

  1. BIFL 소프트웨어를 열고 자동 창에서 설정 확인을 클릭합니다. 그런 다음 파일에서 매개 변수 가져 오기를 클릭 한 다음 확인을 클릭하십시오.
  2. 분석할 측정값의 경우 데이터 경로 배열을 클릭하고 선택합니다 .
  3. 다음으로, Green scatter와 같은 어레이에 대한 water measurement water.ptu 파일을 로드합니다. 마찬가지로 녹색 배경에 대한 표준 buffer.ptu 파일을 선택합니다. 초록색 두께의 경우 Rhodamine 110.ptu를 선택합니다.
  4. single molecule selection parameters(단일 분자 선택 파라미터)에서 Next(다음)를 클릭한 다음 Adjust(조정 )를 클릭하여 새 팝업 창을 표시합니다. 임계값 을 클릭하여 광자 간 도착 시간을 변경하고 평균 광자 간 도달 시간(dt)에 대한 단일 분자 이벤트 시간을 선택합니다. 그런 다음 min. # 을 클릭하여 단일 분자 이벤트당 최소 광자 수를 선택한 다음 Return을 클릭하여 팝업 창을 닫습니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
  5. 그런 다음 Color fit parameters(색상 맞춤 매개변수 )를 클릭하여 형광 감쇠 매개변수로 생성된 색상인 Green의 초기 형광 수명을 조정합니다. Prompt(프롬프트 )와 Delay(지연 ) 값을 조정하려면 From( 시작 ) 및 To( 끝) 값을 수정합니다. 그런 다음 Return을 클릭하여 팝업 창을 닫습니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
  6. 저장을 클릭하여 ASCII 파일을 처리하고 선택한 폴더에 저장합니다. 그런 다음 ChiSurf22, Photon Distribution Analysis55,56 또는 Burst Variance Analysis57,58을 사용하여 시간 분해 형광 이방성 감쇠에 대한 데이터를 처리합니다.
    참고: ChiSurf, PDA 및 BVA 사용 방법에 대한 예시적인 데이터와 단계별 설명은 각각 github.com/Fluorescence-Tools/chisurf, github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib, www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis 및 github.com/SMB-Lab/feda_tools 에서 확인할 수 있습니다. 실험 데이터는 Zenodo (10.5281/zenodo.13371503)에서 확인할 수 있습니다.

5. FoxP1 단백질 제제

  1. 재조합 FoxP1 박테리아 과발현
    1. quick-change site-directed polymerase chain reaction (PCR) 돌연변이 유발 후 E. coli C41 박테리아 세포로의 형질전환을 수행합니다.
    2. LB 매체와 오토클레이브를 준비하여 살균합니다.
    3. 5 μL(100 μg/mL)의 암피실린을 함유한 LB 배지 5 mL에 추가하여 단일 대장균 C41 콜로니를 사전 접종합니다. 37 °C에서 인큐베이터 쉐이커에서 밤새 배양합니다.
    4. 다음날, 500mL의 LB 배지에 하룻밤 동안 사전 접종을 1:500의 비율로 사전 첨가된 항생제를 접종하여 대규모 박테리아 배양을 접종합니다.
    5. 600nm에서 배양물의 흡광도를 측정하여 배양물의 성장을 모니터링합니다.
    6. 광학 밀도가 ~0.5-0.7 사이에 도달하면 0.5mM 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 최종 농도를 추가하여 단백질 발현을 유도하고 인큐베이터 쉐이커에서 밤새 배양을 15°C로 유지합니다.
    7. 1.4-1.6 범위의 광학 밀도 (600 nm)를 달성 한 후, 4 °C에서 20 분 동안 3000 g 에서 원심 분리로 박테리아 세포를 수확한다. 상등액을 버리고 펠릿을 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 재조합 FoxP1 정제
    1. Lyse E. coli C41 세포는 초음파 처리, 액체 균질화, 프렌치 프레스 등과 같은 용해 방법을 사용하여 용해 완충액을 추가합니다.
    2. 용해물을 14000g에서 4°C에서 10 분 동안 원심분리합니다.
    3. His6-태그가 지정된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 친화성 컬럼을 세척하고 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 NiSO4 와 평형을 이룹니다.
    4. His6-태그가 지정된 FoxP1 단백질을 평형화된 Ni2+-NTA 친화도 컬럼에 로드합니다.
    5. 용리 완충액의 선형 그래디언트를 사용하여 Ni2+-NTA 컬럼에서 FoxP1 단백질을 용리합니다.
    6. 단백질이 용리된 후 완충액 교환을 위한 투석을 수행합니다. 이미다졸 없이 평형 완충액에 단백질을 추가하고 4°C에서 자석 교반기를 사용하여 밤새 투석합니다.
      참고: 단백질이 다른 방법을 사용하여 정제된 경우 그에 따라 완충액 교환을 수행합니다.
    7. His6-태그를 제거하려면 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제(TEV:FoxP1의 1:100 비율)를 하룻밤 동안 투석에 추가합니다.
      참고:그의 6-태그 분해는 또한 온-컬럼 TEV 프로테아제 분해를 추가하여 수행할 수 있습니다. 이 단계는 관심 단백질의 수율을 향상시킬 것입니다.
    8. 다음 날 5.2.3-5.2.5의 단계를 반복합니다. 그러나 이번에는 용출 완충액이 아닌 세척 완충액에서 단백질을 용리합니다.
    9. PBS buffer를 첨가하여 단백질을 적정한 부피로 농축하고 단백질의 흡광계수를 고려하여 280nm에서 흡광도를 사용하여 단백질을 정량화합니다.
  3. 재조합 FoxP1 라벨링
    1. Dithiothreitol(DTT) 또는 tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)의 10배 몰 초과량으로 50-100μM FoxP1 단백질을 실온에서 30분 동안 실온에서 500μL로 배양합니다.
    2. PD 10 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼 교환을 수행합니다. 컬럼 어댑터를 사용하여 PD10 컬럼을 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
    3. PBS 완충액 5mL와 원심분리기를 100×0g 2분 동안 2 % 첨가하여 PD10 컬럼을 평형을 이룹니다. 이 단계를 3회 반복합니다.
    4. PD10 컬럼을 새 50mL 튜브에 보관하고 2mL의 PBS 버퍼를 컬럼에 추가합니다. 그런 다음 1단계의 FoxP1 단백질 500μL를 컬럼에 추가합니다. 1000 ×g 을 2분 동안 원심분리하여 단백질을 용리하고 단백질을 수집합니다.
    5. 단백질을 초원심 필터(10kDa MWCO)에 첨가하여 농축하고 7500 ×g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 용리액을 수집합니다.
    6. 단백질 농도를 측정하고 단백질에 시스테인 농도 30%에 해당하는 BODIPY를 첨가한 후 4°C에서 2시간 동안 로테이터에 놓습니다.
    7. 완충액 교환을 수행하고 5.3.2-5.3.5 단계에서 설명한 대로 단백질을 농축합니다.
    8. 분광 광도계 또는 Bradford 또는 Lowry 방법과 같은 비색 분석을 사용하여 단백질 농도를 확인하고 500nm에서 흡광도에 의한 염료의 농도를 확인합니다.
    9. 다음 공식을 사용하여 라벨링 정도를 측정합니다.
      (염료/ε염료)/(단백질의 분자량/밀리리터당 단백질 밀리그램) = 염료의 몰/단백질의 몰
      여기서 ADye 및 εDye 는 최대 흡광 파장에서 염료의 흡광 값과 염료의 몰 흡광 계수이며, 각각59입니다. 280 nm에서 측정할 때 단백질의 실제 흡광도는 다음 공식으로 보정해야 합니다.
      단백질 = A280-(염료· CF280)
      여기서, CF280 은 280 nm에서의 고유 흡광도를 고려하여 지정된 염료에 대한 보정 계수입니다59.
      참고: 우리는 시스테인 변형 단백질의 발현과 정제에 초점을 맞추고 있지만, 단백질에 시스테인 잔기를 전략적으로 도입하는 것에 대해서는 신중한 고려를 해야 합니다.

6. 현미경 샘플 챔버 준비

  1. 495μL의 초순수와 5μL(0.01% v/v 최종 농도)의 Tween-20(비이온성 계면활성제)을 챔버 슬라이드의 웰에 넣고 혼합합니다. RT에서 30분 이상 배양합니다.
  2. 초순수로 챔버를 두 번 부드럽게 세척하고 건조시킵니다.
    알림: 챔버는 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

7. 단일분자 형광 이방성 실험

  1. 먼저 smFA 기기를 보정합니다. 라만 산란광을 측정하거나 수명이 짧고 포화 요오드화칼륨(KI) 용액에 의해 추가로 담금질된 적절한 방출 스펙트럼(예: 에리스로신 또는 공작석 녹색)을 가진 염료의 형광을 측정하여 기기 응답 기능을 측정합니다.
  2. 배경 형광을 보정하려면 버퍼 용액을 측정하십시오. 평행 및 수직 검출기(G-factor)의 상대 감도는 빠르게 회전하는 염료에서 데이터를 획득하여 보정합니다. 여기서, 2nM 로다민(110)을 사용하여 검출기(60)를 교정하였다.
  3. 단량체 FoxP1에 대한 smFA 실험의 경우, 챔버 슬라이드에서 500μL의 표준 완충액(20mM HEPES, 20mM NaCl, pH 7.8)에 100pM BODIPY 표지 FoxP1 및 100nM 표지되지 않은 FoxP1을 추가합니다.
  4. DNA 및 단량체 FoxP1을 사용한 적정 분석의 경우, 100pM BODIPY 표지/100nM 표지되지 않은 단백질 혼합물에 400nM DNA를 첨가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
  5. 이량체 FoxP1에 대한 smFA 실험의 경우, 표준 완충액의 100pM BODIPY 표지 FoxP1에 500nM 비표지 FoxP1을 추가합니다. 그런 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  6. DNA 및 이합체 FoxP1을 사용한 적정 분석의 경우, 2000 nM DNA를 100 pM BODIPY 표지/500 nM 표지되지 않은 단백질 혼합물에 첨가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
  7. 측정을 시작하고 BIFL 소프트웨어에서 30초 기록의 버스트 양이 60-90 사이인지 확인합니다. 샘플이 더 농축되어 있으면 해당 값에 도달할 때까지 희석하십시오. 이 단계는 단일 분자 조건을 보장합니다.
  8. 최소 4시간 동안 DNA가 없거나 존재하는 경우 단량체 FoxP1 또는 이합체 FoxP1에 대한 각 측정을 smFA로 시작합니다.
  9. 섹션 4에 설명된 대로 smFA 측정을 분석합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광 이방성은 형광단의 흡수와 방출 쌍극자 모멘트의 상대적 방향에서 발생합니다. 형광단이 편광에 노출되면 입사광의 전기장 벡터와 정렬된 흡수 전이 모멘트를 가진 형광단이 우선적으로 여기됩니다(광선택). 결과적으로, 여기 상태 집단은 부분적으로 배향 상태가 되며, 여기 분자의 상당 부분은 편광된 여기 빛(61)의 전기장 벡터와 정렬된 전이 모멘트를 갖습니다. 형광단은 브라운 운동으로 인해 회전합니다. 따라서 방출 전이 모멘트도 회전하여 형광 이방성에 대한 시간 의존성이 발생합니다. 이 효과는 형광 분자의 회전 운동을 측정하고, 결합 이벤트를 감지하고, 형광단의 환경을 특성화하고, 분자 역학을 캡처하는 데 사용할 수 있습니다.

단일 분자 실험은 샘플의 이질성을 결정할 수 있는 고유한 준비가 되어 있습니다. 단일 분자 감도와 형광 이방성을 활용하면 다중 파라미터 형광 분광법에 또 다른 차원이 추가됩니다. 일반적인 단일 분자 컨포칼 현미경(그림 2)20,21에서 펄스 레이저를 사용할 때 강도 기반 또는 시간 분해를 통해 형광 이방성을 결정할 수 있습니다.

컨포칼 현미경(62)에서 높은 개구수 대물렌즈의 탈분극 효과를 고려하기 위해, 시간-분해 이방성(35,63)의 적절한 형태는 다음과 같이 주어진다.

figure-results-1(1)

여기서figure-results-2, 및 figure-results-3 는 파장 x에서 여기 후 y번째 검출 채널에서 시간 분해 형광 강도이고, 병렬 및 수직 편광 L1 및 L2에 대한 이고, 는 이러한 측정에 사용된 높은 개구수(NA) 대물렌즈로 인한 병렬 및 수직 신호 간의 혼합을 설명하는 요인입니다(35,62), 64. 염료에 대한 병렬 및 figure-results-4수직 검출 채널의 figure-results-5검출 효율 차이는 검출 효율 figure-results-6의 비율로 보정됩니다. GUV는 G 인자라고도 합니다.

시간 분해 형광 이방성은 다음과 같이 더 큰 생체 분자에 부착되는 형광단을 설명하기 위해 다지수 감쇠를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

figure-results-7,     (2)

여기서 r0 는 형광단 의존 기본 이방성 (일반적으로 r0 = 0.38), r∞ 는 잔류 이방성, ρ1 및 ρ2 는 각각 빠름 (형광단의 국소 운동) 및 느린 (거대 분자의 전역 운동) 회전 상관 시간입니다.

단일 분자 이방성 측정(그림 2)에서 BIFL(Burst-Integrated Fluorescence Lifetime) 분석을 사용하여 개별 이미터를 식별하기 위해 광자 도착 시간이 기록됩니다33,35. 광자 간 도착 시간(Δt)은 실행 평균을 사용하여 평활화된 다음 시각화를 돕기 위해 플롯됩니다. 이 시간의 히스토그램에는 배경에서 발생하는 광자의 평균과 표준 편차를 결정하기 위해 반 가우스가 맞춰져 있습니다. 표준 편차의 배수로 설정되는 임의의 임계값은 각 버스트의 첫 번째 광자와 마지막 광자를 식별하면서 개별 이벤트를 필터링하는 데 사용됩니다. 그런 다음 각 버스트 내의 광자는 방정식 1 및 2를 사용하거나 최대 우도추정기 35를 통해 시간 분해 및 강도 기반 정상 상태 형광 이방성을 계산하는 것을 포함하는 추가 분석을 위해 통합됩니다. 단일 분자 이벤트에서 광자의 수가 제한되어 있기 때문에 최대우도 추정기는 단일 지수 성분만 고려하며 더 이상 논의되지 않습니다.

단일 분자 이벤트의 2차원 히스토그램에서 평균 형광 수명(τ) 및 이방성(rxy)은 평균 회전 시간(ρ)을 얻기 위해 Perrin의 방정식29,61에 의해 관련될 수 있습니다.

figure-results-8(3)

특정 ρ 값은 서로 다른 버스트의 광자가 결합된 시간 분해 형광 이방성 감쇠에 통합되는 "하위 앙상블"(se) 분석을 통해 더 높은 확실성을 얻을 수 있으며, 이는 방정식 2의 매개변수를 실험적 감쇠(seTRFA)에 최적화하여 분석할 수 있습니다. Time-resolved anisotropy는 ns 시간 프레임 내에서 발생하는 형광 방출 내에서 생체 분자의 회전 운동(국소 및 전역)과 관련된 이질성 및 역학을 해결할 수 있습니다.

단일 분자 이벤트(밀리초 미만 규모) 내에서 역학을 감지하기 위해 시간 분해 이방성 버스트 분산 분석(traBVA)57을 도입했습니다. traBVA에서, Mi 연속적인 광자 세그먼트를 포함하는 광자 폭발의 경우, 폭발에 대한 초과 이방성 분산(s2)은 다음과 같습니다.

figure-results-9.     (4)

단일 비등방성 상태의 경우 σ2 의 분산은 샷 노이즈65 (sn: √N, 여기서 N 은 광자의 수)에서만 발생합니다.

figure-results-10(5)

여기서 m은 버스트의 광자 수입니다. 따라서 이방성에서 추가 분산을 식별하기 위해 구조적 이질성으로 인한 초과 이방성 분산(S2)을 방정식 4와 5의 차이로 정의할 수 있습니다.

figure-results-11(6)

개별 분자의 관찰 내에서 발생하는 역학을 포착하고 분산 근사치를 고려하기 위해 동적 이방성 광자 분포 분석(daPDA)55,56을 사용할 수 있습니다. daPDA에서 형광 강도는 이항 분포로 표현되는 조건부 확률(figure-results-12)에 따라 모델링됩니다.

figure-results-13(7)

함께, Poisson 분포를 따르는 배경 계수 비율의 추정치와 함께

figure-results-14(8)

여기서 figure-results-15 는 설정된 시간 창당 평균 배경 광자 수입니다. 병렬 및 수직 배경 개수 figure-results-16 및 figure-results-17는 버퍼 샘플을 참조로 사용하여 측정할 수 있습니다. 실험적으로 결정된 형광 이방성은 운동 변화를 포함할 수 있는 편광 채널당 형광 강도 분포로 성능 수치 χ2 를 최소화하여 최적화됩니다.

제공된 분석 루틴 및 데이터 표현은 수집된 데이터를 해석하는 포괄적인 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 주로 나노초에서 밀리초까지의 이방성 변화를 캡처하는 데 제한이 있는 컨포칼 측정에 중점을 두지만, 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 채택하여 더 긴 시간 동안 형광 이방성을 모니터링할 수 있으므로 시계열 분석이 가능합니다 66. 단일 분자 공초점 측정의 경우, 관찰된 앙상블의 고유한 지문을 생성하는 다차원 히스토그램의 사용을 강조합니다. 선택된 집단에서 재구성된 시간 분해 형광 감소는 나노초 규모에서 형광 이방성의 진화를 추적할 수 있습니다(그림 3). 광자 분포 분석(Photon Distribution Analysis) 55,56 및 버스트 분산 분석(BVA)57,58 은 또한 시간 분해 감쇠와 다차원 히스토그램 사이의 중간 시간 척도에서 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 프로토콜은 나노초에서 밀리초 시간 척도를 연결할 수 있는 펄스 여기67,68의 유무에 관계없이 편광 형광 상관 분광법(FCS)의 사용을 다루지 않지만, 제시된 프로토콜의 범위를 벗어나지만 동일한 데이터를 사용하여 FCS69를 계산할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행하는 경우 더 긴 시료 측정 시간이 권장됩니다.

이 접근 방식은 인간 FoxP 단백질과 같은 복잡한 시스템에 적용되어 작용 메커니즘과 관련된 움직임에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. FoxP 단백질은 뇌 및 폐 발달과 같은 여러 생리학적 측면에 관여하는 전사 인자입니다. 중요한 것은 다양한 돌연변이가 이러한 단백질의 기능을 손상시키는 것으로 인식되었다는 것입니다 70,71. FoxP1의 DNA 결합 도메인을 모델로 사용하여 다양한 단일 시스테인 돌연변이를 생성하여 BODIPY-FL 염료를 움직임의 추적기로 도입했습니다(그림 4A). 실제로, 우리는 이합체화(dimerization)와 DNA 결합(DNA binding)의 효과를 이 단백질의 주요 구조 조절자(structural regulators)로 평가했습니다. smFA 접근법을 사용하여 2D-smFA 플롯을 생성하고 단량체 및 이합체 조건에서 각 돌연변이에 대한 traBVA 및 daPDA를 만들었습니다. 연구된 단일 돌연변이 중 하나의 예를 보여줍니다(그림 4). 이방성 거동은 높고 낮은 회전 상관 시간을 결정하는 측면에서 모든 돌연변이에서 유사하며, 따라서 추정 가능하고, 무질서하고, 접힌 앙상블을 결정합니다. 그럼에도 불구하고, 각 앙상블의 분획 및 동역학 측면에서 모든 돌연변이에서 매우 이질적이며, 이합체화 및 DNA 결합에 의해 영향을 받는 서로 다른 질서-무질서 전이 변화를 입증하고 사슬을 따라 구조 역학의 고해상도로 설명을 보여줍니다(그림 5).

figure-results-18
그림 1: 생체 분자의 동적 범위와 형광 이방성 방법. (A) 관심 생체 분자의 골격을 따라 다양한 위치에 묶여 있는 작은 형광단의 이방성은 국소 구조 역학에 정보를 제공합니다. (B) 형광 강도 감소(time-resolved fluorescence anisotropy, FA) 및 컨포칼 단분자 현미경 데이터의 단분자 히스토그램에 의해 조사된 시간 척도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-19
그림 2: Single-molecule fluorescence anisotropy data registration and processing. (A) 자유롭게 확산되는 분자는 단일 선형 편광 여기 레이저(이 경우 파란색)가 장착된 컨포칼 단일 분자 현미경을 사용하여 분석됩니다. 형광 방출(이 경우 녹색)은 빔 편광자가 신호를 두 개의 편광(여기원에 대한 figure-results-20평행 figure-results-21및 수직 )으로 분할한 후 두 개의 검출기에 의해 감지됩니다. (B) 감지된 각 광자는 미시 시간, 매크로 시간 및 채널 유형의 세 가지 매개변수로 특징지어집니다. 데이터는 TTTR(Time-Tagged Time-Resolved) 형식(72)으로 저장된다. (C) 개별 분자의 버스트를 선택하고 처리하여 관찰된 각 분자에 대한 형광 이방성을 포함한 형광 매개변수를 추출합니다. (D) 데이터는 형광 이방성 대 형광 수명의 2차원 플롯 및 시간 분해 이방성 감소를 포함하여 여러 가지 방식으로 표현됩니다. 이러한 표현을 통해 형광 수명, 회전 상관 시간 및 시스템 이질성에 대한 시각적 및 정량적 결정을 모두 수행할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-22
그림 3: FoxP1 도메인 스왑 이량체의 대표 데이터. (A) 분자당 평균 형광 수명에 대한 형광 이방성(r산란)의 상관관계를 윤곽 플롯으로 나타낸 것. 분자의 앙상블 평균을 대표하는 두 개의 회전 성분에 대한 단일 Perrin 방정식의 오버레이, 각각 0.2 ns 및 8.5 ns의 ρ1 및 ρ2 를 고려합니다. (B) Sub-ensemble time-resolved 형광 감쇠는 샘플의 time-resolved 형광 이방성을 계산하는 데 사용됩니다. 방정식 2에 맞추면 형광 이방성의 국소 및 전역 성분이 해결되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-23
그림 4: 단일분자 형광 이방성(smFA)을 사용하여 모니터링한 밀리초 미만의 FoxP1 역학. (A) 단량체 FoxP1 구조를 만화로 표현한 것. (B) 2차원 히스토그램은 동적 이질성을 보여주며, 시간 분해 형광 이방성을 통해 식별된 두 개의 뚜렷한 회전 상관 시간을 나타냅니다. 시간 분해 이방성 버스트 분산 분석(traBVA)은 큰 이방성을 나타내는 초과 분산(식 6)이 있는 이벤트의 작은 하위 집합을 발견합니다. PDA(Photon Distribution Analysis)를 사용한 정량적 동적 이방성 분석은 이 프로세스에 대한 환율을 추가로 추출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-24
그림 5: 이합체화 중 FoxP1의 국소 및 전역 운동 스크리닝. (A) 단량체 FoxP1과 이합체 형태를 비교한 만화 표현. (B) 단량체 및 이합체 조건에서 위치별 평균 초과 분산이 표시되며, 초과 분산이 클수록 이방성의 더 큰 변화를 나타냅니다. (C) 광자 분포 분석(PDA)을 사용한 동적 이방성 분석은 DNA의 부재(녹색) 및 존재(노란색)에서 개체군 분율(어두운 색에서 높은 이방성, 밝은 색에서 낮은 이방성)을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 접근 방식에서는 로컬 행동과 글로벌 행동 간의 전환에 대한 속도(표시되지 않음)를 추정하여 FoxP1이 부분적으로 풀림을 겪는다는 것을 밝혔습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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단일 분자 형광 이방성 실험의 경우 선택한 형광단의 광물리적 특성을 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 속성에는 검출 시스템과 일치해야 하는 방출 파장과 사용 가능한 펄스 레이저와 호환되어야 하는 여기 파장이 포함됩니다. dynamic range를 최적화하려면 형광단의 형광 수명은 분자의 회전 확산 시간에 비해 길어야 합니다. 이는 회전 역학과 관심 생체 분자에 대한 형광단 쌍극자의 연결/방향을 추적하는 데 중요합니다. 또한 밝기, 광안정성 및 양자 수율은 안정적인 신호 대 잡음비로 강력한 신호를 생성하는 데 필수적입니다. 이러한 이유로 BODIPY-FL은 여러 연구에서 형광단으로 선택되었습니다 39,40,42.

생체 분자의 골격 역학을 스크리닝하려면 일반적으로 부위 특이적 라벨링을 통해 달성되는 단백질 라벨링이 필요한 경우가 많습니다. 이것은 일반적으로 표적 화학 변형을 위한 잔류물을 도입하여 수행됩니다. 가장 일반적인 접근법은 관심 위치에 시스테인을 도입하는 것인데, 여기서 티올 측쇄는 말레이미드 또는 요오드아세트아미드와 같은 시약으로 선택적으로 변형될 수 있습니다. 덜 일반적으로, 벤질산 할라이드와 브로모메틸 케톤은 티오에테르 결합을 형성하는 데 사용됩니다. 다른 아미노산 곁사슬도 표적화할 수 있지만 단백질에 풍부하게 존재하는 것은 흔하지 않습니다. 그러나 비천연 아미노산과 같은 대체 접근법도 사용할 수 있다73. 라벨링을 위한 적절한 부위 선택은 연구 중인 생체 분자에 대한 간섭을 최소화하는 데 중요하며 적절한 대조군이 마련되어 있어야 합니다. 예를 들어, 표지된 분자가 결합 분석에 사용되는 경우, 보완적인 label-free 방법은 형광단이 결합 친화력에 영향을 미치지 않는지 확인해야 합니다.

적절한 샘플을 식별하고 최적의 라벨링 전략을 구현한 후 다음 단계는 단일 분자 실험을 위해 컨포칼 현미경이 적절하게 정렬되고 보정되었는지 확인하는 것입니다. 이 프로토콜은 추가 분석에 필요한 요인을 결정하는 방법을 설명합니다. 기기가 보정되면 다음 단계는 샘플을 측정하고 데이터를 처리하여 감지된 광자에서 가능한 한 많은 정보를 추출하는 것입니다. 그림 2와 같이 마이크로 시간, 매크로 시간 및 채널 유형과 같은 주요 매개변수는 일반적인 TCSPC 전자 장치를 사용하여 추가 분석 및 시각화에 사용할 수 있습니다.

최근 단일 분자 형광 분광법의 발전은 생체 분자의 이종 앙상블에서 구조 정보를 연구하는 데 광범위하게 사용될 수 있습니다. 그러나 형광 이방성(fluorescence anisotropy)이 제공하는 통찰력을 활용하는 연구는 상대적으로 적으며, 생체 분자의 구조적 역학을 도출하기 위해서는 완전한 단백질 모델이 필요합니다. 따라서 여러 전사 인자의 도메인 간 및 단백질-단백질 상호 작용의 역학을 밝히는 것은 어려운 일입니다.

결론적으로, 단일분자 형광 이방성 실험은 생체 분자 골격의 국소 및 전역 운동에 대한 보완적인 정보를 제공하며, 이는 생체 분자 골격의 기능을 이해하는 데 중요합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 이 기사의 내용과 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 EM에 대한 FONDECYT 보조금 11200729 및 FONDEQUIP EQM200202, NIH R15CA280699 R01GM151334 및 HS에 대한 NSF CAREER MCB 1749778 Awards의 지원을 받았습니다. NK는 Clemson University 박사후 연구원 프로그램의 지원을 인정했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 488ThermoFisher ScienctificA20100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100
Amicon 울트라 원심 필터, 10kDa MWCO밀리포어 시그마UFC901008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010
암피실린 나트륨염밀리포어 시그마A0166-5Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166
BODIP FL 말레이미드(BODIPY FL N-(2-아미노에틸))말레이미드)ThermoFisher ScienctificB10250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250
일회용 PD 10 탈염 컬럼Millipore SigmaGE17-0851-01https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101
디티오트레이톨Millipore Sigma10197777001
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro DMSO, 무수ThermoFisher ScienctificD12345https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345
DNAseMillipore Sigma10104159001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001
E. coli C41 박테리아 세포 Invitrogen
Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL 컬럼Bio-Rad12004037
https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037 HEPESMillipore Sigma7365-45-9https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375
ImidazoleMillipore Sigma288-32-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513
IPTG밀리포어 시그마I6758-1G
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758 MCE 멤브레인 필터, 0.22 및 mu; m 기공 크기Millipore SigmaGSWP02500https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500
NaClMillipore Sigma7647-14-5
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014 Nunc Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템ThermoFisher Scienctific154534https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534
OverExpress C41(DE3) 화학적으로 유능한 세포밀리포어 시그마CMC0017-20X40ULhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017
PMSF밀리포어 시그마329-98-6https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830
로다민 110써모피셔 과학419075000https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000
나트륨 인산염 이염기성Millipore Sigma7558-79-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264
인산나트륨 일염기성 이수화물Millipore Sigma13472-35-0https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505
TCEP, 염산염, 시약 등급Milllipore Sigma580567-5GMhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567
트윈 20밀리포어 시그마11332465001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, A. Thermodynamic fluctuations in protein molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (8), 2740-2741 (1976).
  2. Volozhin, S. I. Inguinal hernia in cryptorchism. Khirurgiia (Mosk). 450 (7), 69-71 (1975).
  3. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838-844 (2007).
  4. Karplus, M., Mccammon, J. A. The internal dynamics of globular-proteins. CRC Crit Rev Biochem. 9 (4), 293-349 (1981).
  5. Ishima, R., Torchia, D. A. Protein dynamics from nmr. Nat Struct Biol. 7 (9), 740-743 (2000).
  6. Fernandez, F. J., Querol-Garcia, J., Navas-Yuste, S., Martino, F., Vega, M. C. X-ray crystallography for macromolecular complexes. Adv Exp Med Biol. 3234, 125-140 (2024).
  7. Bai, X. C., Mcmullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  8. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically unstructured proteins: Re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. 293 (2), 321-331 (1999).
  9. Tompa, P. Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. 27 (10), 527-533 (2002).
  10. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (3), 197-208 (2005).
  11. Csermely, P., Palotai, R., Nussinov, R. Induced fit, conformational selection and independent dynamic segments: An extended view of binding events. Trends Biochem Sci. 35 (10), 539-546 (2010).
  12. Camacho-Zarco, A. R., et al. NMR provides unique insight into the functional dynamics and interactions of intrinsically disordered proteins. Chem Rev. 122 (10), 9331-9356 (2022).
  13. Drenth, J. Principles of Protein X-Ray Crystallography. , Springer, Verlag. New York, NY. (2007).
  14. Loeb, H. Systematic diagnosis of chronic diarrhea in infants and small children. Kinderarztl Prax. 44 (1), 36-41 (1976).
  15. Ellaway, J. I. J., et al. Identifying protein conformational states in the protein data bank: Toward unlocking the potential of integrative dynamics studies. Struct Dyn. 11 (3), 034701(2024).
  16. Berjanskii, M. V., Wishart, D. S. A simple method to predict protein flexibility using secondary chemical shifts. J Am Chem Soc. 127 (43), 14970-14971 (2005).
  17. Puthenveetil, R., Vinogradova, O. Solution NMR: A powerful tool for structural and functional studies of membrane proteins in reconstituted environments. J Biol Chem. 294 (44), 15914-15931 (2019).
  18. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule fret measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  19. Weidtkamp-Peters, S., et al. Multiparameter fluorescence image spectroscopy to study molecular interactions. Photochem Photobiol Sci. 8 (4), 470-480 (2009).
  20. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. M. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  21. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for fret-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  22. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. aM. Combining graphical and analytical methods with molecular simulations to analyze time-resolved fret measurements of labeled macromolecules accurately. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  23. Hamilton, G. L., Sanabria, H. Multiparameter Fluorescence Spectroscopy of Single Molecules. Spectroscopy and Dynamics of Single Molecules. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  24. Kolimi, N., et al. Out-of-equilibrium biophysical chemistry: The case for multidimensional, integrated single-molecule approaches. J Phys Chem B. 125 (37), 10404-10418 (2021).
  25. Felekyan, S., Sanabria, H., Kalinin, S., Kuhnemuth, R., Seidel, C. A. Analyzing forster resonance energy transfer with fluctuation algorithms. Methods Enzymol. 519, 39-85 (2013).
  26. Medina, E. D. R. L., Sanabria, H. Unraveling protein's structural dynamics: From configurational dynamics to ensemble switching guides functional mesoscale assemblies. Curr Opin Struct Biol. 66, 129-138 (2021).
  27. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (37), E5389-E5398 (2016).
  28. Gomes, G. W., et al. Conformational ensembles of an intrinsically disordered protein consistent with NMR, SAXS, and single-molecule fret. J Am Chem Soc. 142 (37), 15697-15710 (2020).
  29. Perrin, F. Polarisation de la lumière de fluorescence. Vie moyenne des molécules dans l'etat excité. J phys radium. 7 (12), 390-401 (1926).
  30. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. I. Theory and experimental method. Biochem J. 51 (2), 145-155 (1952).
  31. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. II. Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochem J. 51 (2), 155-167 (1952).
  32. Jameson, D. M., Ross, J. A. Fluorescence polarization/anisotropy in diagnostics and imaging. Chem Rev. 110 (5), 2685-2708 (2010).
  33. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Gunther, R., Seidel, C. A. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  34. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. aM. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  35. Schaffer, J., et al. Identification of single molecules in aqueous solution by time-resolved fluorescence anisotropy. Journal of Physical Chemistry A. 103 (3), 331-336 (1999).
  36. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  37. Gradinaru, C. C., Marushchak, D. O., Samim, M., Krull, U. J. Fluorescence anisotropy: From single molecules to live cells. Analyst. 135 (3), 452-459 (2010).
  38. Mazal, H., Haran, G. Single-molecule fret methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  39. Tsytlonok, M., et al. Specific conformational dynamics and expansion underpin a multi-step mechanism for specific binding of p27 with cdk2/cyclin a. J Mol Biol. 432 (9), 2998-3017 (2020).
  40. Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by cdk2/cyclin a-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nat Commun. 10 (1), 1676(2019).
  41. Cruz, P., et al. Domain tethering impacts dimerization and DNA-mediated allostery in the human transcription factor foxp1. J Chem Phys. 158 (19), (2023).
  42. Kolimi, N., et al. DNA controls the dimerization of the human foxp1 forkhead domain. Cell Rep Phys Sci. 5 (3), 101854(2024).
  43. Yanez Orozco, I. S., et al. Identifying weak interdomain interactions that stabilize the supertertiary structure of the n-terminal tandem PDZ domains of PSD-95. Nat Commun. 9 (1), 3724(2018).
  44. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  45. Rigler, R., Elson, E. S. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Theory and Applications. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2012).
  46. Aragon, S. R., Pecora, R. Fluorescence correlation spectroscopy as a probe of molecular-dynamics. J Chem Phys. 64 (4), 1791-1803 (1976).
  47. Mockel, C., et al. Integrated NMR, fluorescence, and molecular dynamics benchmark study of protein mechanics and hydrodynamics. J Phys Chem B. 123 (7), 1453-1480 (2019).
  48. Shu, W., Yang, H., Zhang, L., Lu, M. M., Morrisey, E. E. Characterization of a new subfamily of winged-helix/forkhead (Fox) genes that are expressed in the lung and act as transcriptional repressors. J Biol Chem. 276 (29), 27488-27497 (2001).
  49. Co, M., Anderson, A. G., Konopka, G. Foxp transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (5), e375(2020).
  50. Takahashi, H., Takahashi, K., Liu, F. -C. FOXP Genes, Neural Development, Speech and Language Disorders. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine. , Springer. New York, NY. (2009).
  51. Wang, B., Lin, D., Li, C., Tucker, P. Multiple domains define the expression and regulatory properties of foxp1 forkhead transcriptional repressors. J Biol Chem. 278 (27), 24259-24268 (2003).
  52. Leake, M. C., Quinn, S. D. A guide to small fluorescent probes for single-molecule biophysics. Chem Phys Rev. 4 (1), 011302(2023).
  53. Zhang, H., Wu, Q., Berezin, M. Y. Fluorescence anisotropy (polarization): From drug screening to precision medicine. Expert Opin Drug Discov. 10 (11), 1145-1161 (2015).
  54. Ma, J., et al. High precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination. J Vis Exp. (123), e55623(2017).
  55. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. J Phys Chem B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  56. Mcgeer, P. L., Mcgeer, E. G. Enzymes associated with the metabolism of catecholamines, acetylcholine and gaba in human controls and patients with parkinson's disease and huntington's chorea. J Neurochem. 26 (1), 65-76 (1976).
  57. Terterov, I., Nettels, D., Makarov, D. E., Hofmann, H. Time-resolved burst variance analysis. Biophys Rep (N Y). 3 (3), 100116(2023).
  58. Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule fret experiments with burst variance analysis. Biophys J. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  59. Haugland, R. P. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Molecular Probes. , (2005).
  60. Medina, E., et al. Intrinsically disordered regions of the DNA-binding domain of human foxp1 facilitate domain swapping. J Mol Biol. 432 (19), 5411-5429 (2020).
  61. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York, NY. (2007).
  62. Koshioka, M., Sasaki, K., Masuhara, H. Time-dependent fluorescence depolarization analysis in three-dimensional microspectroscopy. Appl Spectrosc. 49 (2), 224-228 (1995).
  63. Kudryavtsev, V., et al. Combining mfd and pie for accurate single-pair forster resonance energy transfer measurements. Chemphyschem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  64. Van Zanten, T. S., Greeshma, P. S., Mayor, S. Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy for implementing homo-fluorescence resonance energy transfer measurements in living cells. Mol Biol Cell. 34 (6), tp1(2023).
  65. Laine, R. F., Jacquemet, G., Krull, A. Imaging in focus: An introduction to denoising bioimages in the era of deep learning. Int J Biochem Cell Biol. 140, 106077(2021).
  66. Strohl, F., Wong, H. H. W., Holt, C. E., Kaminski, C. F. Total internal reflection fluorescence anisotropy imaging microscopy: Setup, calibration, and data processing for protein polymerization measurements in living cells. Methods Appl Fluoresc. 6 (1), 014004(2017).
  67. Loman, A., Gregor, I., Stutz, C., Mund, M., Enderlein, J. Measuring rotational diffusion of macromolecules by fluorescence correlation spectroscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (5), 627-636 (2010).
  68. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem Phys Lett. 353 (5-6), 439-445 (2002).
  69. Peulen, T. -O., et al. Tttrlib: Modular software for integrating fluorescence spectroscopy, imaging, and molecular modeling. arXiv. , (2024).
  70. Le Fevre, A. K., et al. Foxp1 mutations cause intellectual disability and a recognizable phenotype. Am J Med Genet A. 161A (12), 3166-3175 (2013).
  71. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in foxp1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87 (5), 671-678 (2010).
  72. Wahl, M., Orthaus-Müller, S. Time tagged time-resolved fluorescence data collection in life sciences. , https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2014).
  73. Lemke, E. A. Site-specific labeling of proteins for single-molecule fret measurements using genetically encoded ketone functionalities. Methods Mol Biol. 751, 3-15 (2011).

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