여기에서는 비닐 레코드에서 만든 PDMS 몰드를 사용하여 채널형 한천 패드를 제작하는 프로토콜을 제시합니다. 이 채널을 통해 사용자는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 방향을 미세하게 조정하여 이미징 대비를 개선하고 구조를 쉽게 비교할 수 있습니다. 이러한 기능은 신경 재생 연구에서 특히 유용합니다.
방법 논문
신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정
이 논문에서
요약
초록
Caenorhabditis elegans 는 생물학적 과정을 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 투명도와 작은 크기로 인해 조직, 세포 및 세포 내 구조를 이미징하는 데 이상적입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 이미징을 위한 기존의 편평한 한천 패드는 동물의 방향에 대한 통제를 제한하여 주로 측면 관점으로 시야를 제한합니다. 이러한 제한은 등쪽-복부 구조의 시각화를 복잡하게 만들고 특히 색소 침착이 증가하고 직경이 큰 나이가 많은 동물에서 이미지 선명도를 감소시킵니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 동물의 방향을 정밀하게 제어할 수 있는 채널 아가로스 패드를 개발했습니다. 이러한 채널을 통해 연구원들은 지정된 위치에서 예쁜꼬마선충을 회전시키고 고정할 수 있으며, 이를 통해 여러 구조의 동시 이미징을 용이하게 하고 표적 세포를 현미경 대물렌즈에 더 가깝게 만들어 이미지 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 이는 기존의 편평한 한천 패드로는 포착하기 어려운 방향으로 성장할 수 있는 수술 후 재생된 신경 섬유를 이미징하는 데 특히 유용합니다. 이 방법은 채널형 한천 패드를 제작하는 데 플랫 패드와 동일한 시간과 재료가 필요하기 때문에 대부분의 실험실에서 실용적인 옵션이 되기 때문에 접근이 용이합니다.
서론
선충 Caenorhabditis elegans (C. elegans)는 포유류와 유전적으로 잘 보존된 유전학으로 인해 발달 및 행동과 같은 생물학적 과정을 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다1. 연구원들은 실험 조건을 표준화하고 실험 변수에 대한 결과를 보다 정확하게 귀속시킬 수 있도록 엄격하게 통제된 환경에서 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 예쁜꼬마선충을 배양합니다. 이 동물은 투명하여 조직, 세포 및 세포 내 구조를 선명하게 이미징할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충은 몸집이 작고, 성체 동물의 길이가 ~1mm, 지름이 80μm이며, 이를 통해 이미징1을 위해 단일 슬라이드 마운트에 여러 동물을 배치할 수 있습니다. 또한 크기가 작기 때문에 단일 이미지로 전체 유기체를 캡처하는 동시에 개별 세포를 분석할 수 있으며, 이는 뉴런 섬유의 재생을 시각화하는 데 매우 중요합니다. 현미경 검사에 대한 이러한 장점과 시너지 효과로 C . elegans 의 빠른 발달, 고정 관념의 해부학 및 손쉬운 유전학은 대규모 연구를 가능하게합니다1.
예쁜꼬마선충의 세포를 촬영하는 일반적인 절차는 수십 년 전에 확립되었으며 거의 변하지 않았습니다. 연구자들은 슬라이드에 평평한 한천 패드를 사용하여 세포를 시각화하기 위해 동물을 장착하고 고정시킵니다2. 패드 상단의 커버슬립은 동물을 제자리에 고정하고 현미경 렌즈를 보호합니다. 중요한 것은 커버슬립이 굴절률이 높아 포착된 빛의 개구수를 증가시키고 이미징 해상도를 향상시킨다는 것입니다. 또한 커버슬립은 광 투과율의 왜곡을 줄입니다. 따라서 커버슬립은 표적 세포와 구조의 시각화를 향상시킵니다.
그러나 커버슬립과 함께 사용할 때 평평한 한천 패드는 종종 동물의 방향을 제한합니다. 예쁜꼬마선충은 등쪽-배쪽(DV) 방향을 따라 구부러져 평평한 한천 패드에서 측면 방향을 채택합니다. 그러나 DV 방향으로 고정, 곧게 펴기 및 사전 회전 후에도 커버슬립 배치는 거의 모든 동물을 측면 보기로 되돌립니다(그림 1). 우리는 커버슬립이 튀어나온 예쁜꼬마선충 외음부를 옆으로 밀기 때문에 이러한 방향 전환이 발생한다고 생각합니다. 외음부가 없는 어린 동물은 더 무작위 방향입니다. 방향에 대한 이러한 제한된 제어는 적어도 두 가지 이유에서 문제가 됩니다. 첫째, 단일 시야(예: 양측)에 두 개의 구조를 배치하는 것을 허용하지 않을 수 있으며, 이는 비교를 복잡하게 만듭니다. 둘째, 방향 설정은 이미징 품질을 최적화하는 데 중요한데, 관심 있는 구조는 일반적으로 대물렌즈에 가까울 때 가장 잘 이미지화되기 때문입니다. 이는 대물렌즈가 샘플 내의 제한된 깊이(즉, working distance)를 이미지화하고 더 깊은 위치에서 오는 빛이 더 많은 산란과 흡수를 경험하기 때문입니다.
예쁜꼬마선충의 경우, 방향에 대한 제한된 통제는 일반적으로 나이가 많은 동물에서 더 심각합니다. L1에서 L4 나이의 동물은 지름이 더 작아서 벌레의 더 높은 부분을 이미지화할 수 있습니다. 이 유충은 또한 색소 침착이 적어 가시광선의 흡수가 감소하고 광자의 산란이 감소하여 이미지 선명도와 해상도가 향상됩니다. 반대로, 다 자란 동물은 직경이 더 크고 색소 침착이 더 많은데, 이는 커버슬립이 초기 방향에 영향을 미치기 때문에 더 깊은 z-평면에서 이미징하는 데 어려움을 겪습니다.
2008년, 우리는 동물의 방향을 유지함으로써 이러한 문제를 극복하기 위해 채널이 있는 한천 패드를 사용하는 전략을 도입했습니다 3,4. 아래에서 설명한 바와 같이, 사용자는 해부학적 랜드마크를 기록하여 채널에서 고정된 동물을 원하는 방향으로 회전시킵니다. 채널은 높은 한천 표면 사이의 움푹 들어간 곳에 동물을 고정하여 커버슬립 배치 중에 동물에 가해지는 힘을 최소화하고 동물의 회전을 제거합니다. 채널 패드와 일반적인 플랫 패드의 제작은 거의 동일한 절차를 따르고 동일한 시간이 필요하기 때문에 당사의 기술은 접근성이 높습니다. 많은 실험실에서 해부학적 특징을 연구하고, 발달을 관찰하고, 행동에 대한 뉴런의 기여를 분석하기 위해 예쁜꼬마선충을 고정시키는 우리의 기술을 사용합니다 5,6,7,8. 다음 섹션에서는 뜨거운 칼을 사용하여 4등분된 비닐 레코드부터 시작하여 채널 한천을 만드는 전체 과정을 설명합니다. 먼저, 채널 한천을 주조하는 데 사용되는 폴리디메틸실록산(PDMS) 주형의 제작에 대해 설명합니다. 그런 다음 채널링 된 한천을 단계별로 제작하는 방법을 보여줍니다. 전체 절차는 전문 지식 없이 3시간이 소요될 것으로 예상됩니다. PDMS 제작 절차에 따라 금형으로 만든 패드는 일반적인 한천 패드와 동일한 시간(몇 분)이 소요됩니다.
프로토콜
1. 제조를 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 준비
- 베이스에 대한 속경화제를 1:10 비율로 일회용 계량 접시에 붓습니다. 액체가 완전히 통합되고 거품으로 가득 찰 때까지 경화되지 않은 액체를 45초 동안 혼합합니다.
- 트레이를 진공 데시케이터에 비스듬히 놓습니다. 기포가 표면화될 수 있도록 -0.09에서 -0.1kPa 사이의 압력을 3배 순환합니다.
- 수동으로 제거할 수 있는 눈에 보이는 기포가 거의 남지 않을 때까지 -0.09에서 -0.1kPa의 압력 범위에서 약 한 시간 동안 진공 청소기를 켜두십시오.
2. 비닐 레코드의 PDMS 금형 제작
- 비닐 레코드와 유리판을 탈이온수(DI)로 헹굽니다. 최상의 금형을 얻으려면 먼지가 없는지 확인하십시오. 비닐 레코드는 사용할 때까지 자연 건조시키십시오.
- 핫 플레이트 위에 알루미늄 호일 시트를 놓아 과도한 PDMS를 잡습니다.
- 비닐 레코드의 양쪽 끝에 유리 슬라이드를 놓고 금형 두께를 유리 슬라이드의 너비로 설정합니다. 이렇게 하면 유리판을 경화되지 않은 PDMS에 누를 때 균일한 높이가 보장됩니다.
- 경화되지 않은 PDMS 액체를 비닐 레코드의 한쪽 면에 붓습니다.
- 액체 표면에서 반사된 빛을 사용하여 기포를 관찰하고 피펫 팁으로 제거합니다. 유리판을 기울이고 접시를 천천히 아래로 내려 공기가 빠져나가도록 하여 거품이 유입되는 것을 방지합니다.
- 80°C에서 35분 동안 PDMS를 경화합니다.
- 핫 플레이트에서 비닐 레코드를 제거하고 식히십시오. 찢어지지 않도록 비닐 레코드에서 PDMS를 조심스럽게 떼어냅니다.
- 새 유리 슬라이드를 가이드로 사용하여 날카로운 면도기로 PDMS를 절단하여 채널형 한천 주형을 만듭니다.
3. NaN3을 가진 수로가 있는 한천 패드 제작
참고: 편평한 한천 패드의 절차와 재료는 이전에 확립되었습니다9. 이 절차는 매우 유사합니다.
- 플라스크에 한천 0.6g과 NGM 액체9 스톡 30mL를 추가합니다. 교반 막대를 넣고 120°C의 핫 플레이트에서 가열합니다.
- 겔이 용융된 후 120μL의 NaN3 스톡(1M 스톡 농도)을 추가합니다.
- PDMS 금형을 물로 세척하고 자연 건조시킵니다. 두 세트의 슬라이드 쌍 사이에 PDMS 금형을 배치합니다.
- 피펫 한천을 위아래로 움직여 피펫 팁을 따뜻하게 합니다. 녹은 한천 300μL를 PDMS 금형에 피펫팅하고, 슬라이드 배치로 채널을 따라 한천을 수동으로 퍼뜨립니다.
- 현미경 슬라이드를 한천에 직접 놓고 측면의 슬라이드에 놓습니다. 한천이 식은 후 슬라이드를 제거하십시오.
4. C. elegans 장착
- 슬라이드가 식으면 전단하지 않고 슬라이드를 금형에서 똑바로 들어 올립니다.
- 동물이 NaN3에 의해 고정되지 않은 후 채널로 이동합니다.
- 동물을 원하는 방향으로 회전합니다.
- 패드에 커버슬립을 놓습니다. 패드를 기울이고 한쪽에서 다른 쪽으로 가볍게 눌러 공기를 옆으로 밀어내고 기포가 생기지 않도록 합니다.
결과
PDMS 금형 제작
금형 제작 중 진공 압력을 순환하면 경화되지 않은 PDMS에서 기포에 구멍이 뚫리고 제거되어 기포가 없는 금형을 만들 수 있습니다. 그림 3D 에서 볼 수 있듯이 기포가 표면으로 올라와 구멍을 뚫습니다. 기포가 없는 금형은 깨끗한 채널을 생성할 수 있습니다.
PDMS 금형의 응고화
비닐 레코드에 유리창을 놓을 때 에어 갭을 만들지 마십시오. 이러한 갭으로 인해 두께가 고르지 않거나 표면 결함이 발생할 수 있습니다. 거품이 있는 경우 시각적으로 감지할 수 있습니다. 유리판을 한쪽에서 다른 쪽으로 누르면 공기가 변위되어 기포 형성이 최소화되고 그림 4A에 표시된 균일한 금형 두께가 보장됩니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)의 미세한 방향을 위해 채널형 한천 패드 사용
채널링된 한천 패드는 예쁜꼬마선충의 정확한 방향을 허용합니다. 백금 와이어 픽으로 동물을 가볍게 굴려 동물의 방향을 설정하는 동시에 외음부 또는 S자형 창자와 같은 랜드마크를 사용하여 방향을 확인합니다(그림 5A, C). 그림 5B,D에 표시된 도립 현미경으로 동물을 옮기기 전에 형광 해부 현미경으로 방향을 확인합니다.
채널링된 한천 패드를 사용한 뉴런 섬유의 재생 평가
채널형 한천 패드는 동물의 방향을 최적으로 지정함으로써 신경 재생의 이미징 품질을 향상시킵니다. 재생된 뉴런 섬유를 대물렌즈에 더 가깝게 배치하면 빛의 산란과 흡수가 줄어들어 이미지 선명도가 향상됩니다. 그림 5E, F 는 재생 부위를 대물렌즈에 더 가깝게 배치하면 이미징 품질이 향상되어 신경 세포 재생에 대한 보다 정확한 분석이 용이해진다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 편평하고 수로가 있는 패드에 있는 Caenorhabditis elegans . (A) DV 방향의 편평한 한천 패드에 있는 동물; 외음부는 커버슬립을 직면합니다. (B) 커버슬립 도입은 외음부를 옆으로 밀어 동물을 측면 방향으로 유도합니다. (C) DV 방향의 채널링 한천 패드에 있는 동물. (D) 동물이 커버슬립 도입 후 DV 방향으로 남아 있습니다. (E) DV 방향의 채널 한천 패드에 있는 롤러 돌연변이의 명시야 이미지. (F) 커버슬립이 있는 명시야 이미지, E 와 동일한 동물이 DV 방향으로 남아 있습니다. 약어: DV = 등쪽-복부; lat = 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PDMS 제조를 위한 재료 및 장비. (A) SYLCAP 284-F 실리콘 엘라스토머 키트. (B) 규모. (C) 플라스틱 주사기. (D) 진공 데시케이터. (E) 핫 플레이트. (F) 12인치 장기 재생 비닐 레코드, 필요에 따라 분해합니다. (G) 유리판. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경화되지 않은 PDMS의 혼합 및 진공 청소. (A) 트레이에 베이스와 경화제를 혼합합니다. (B) 트레이를 진공 챔버에 놓습니다. (C) 거품이 표면화될 수 있도록 진공을 세 번 순환합니다. (D) 1시간 후 대부분의 거품이 터졌습니다. PDMS를 통한 전송 개선에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기포가 없는 경화되지 않은 PDMS에 유리판 도입. (A) 거품이 없는 비닐 레코드에 유리판 도입. (B) 삽입된 디테일링 채널과 함께 기록에서 제거된 응고된 PDMS 곰팡이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 수로가 있는 한천에 장착된 예쁜꼬마선충의 명시야 및 형광 이미지. (A) 양측 DV 방향의 동물의 명시야 이미지. DV 방향에 대한 해부학적 랜드마크: 코에서 꼬리까지의 거리의 정중선 ~60%를 가로지르는 나선형 S자형 창자(화살표로 표시된 어두운 조직). (B) DV 방향의 뉴런, A와 동일한 동물의 형광 이미지. (C) 위도 방향의 동물의 명시야 이미지. 위도 방향에 대한 해부학적 랜드마크: 외음부가 쪽을 향하고 있습니다. (D) 위도 방향의 뉴런, C와 동일한 동물의 형광 이미지. (E) 동물의 더 깊은(멀리) 쪽에서 재생(화살표)이 있는 방향. (F) 목표에 더 가까운 얕은 쪽 동물에서 재생이 있는 방향; 재생이 더 선명해집니다(화살표). 눈금 막대 = 20μm. 약어: DV = 등쪽-복부; lat = 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
채널형 한천 패드의 주요 장점은 이미징을 위해 동물의 방향을 유지할 수 있다는 것입니다. 채널은 성인 동물에게 적합하여 커버슬립 도입 시 유지되는 제어된 회전을 허용합니다. 우리는 야생형, 롤러형 및 덤피 동물을 성공적으로 이미지화했습니다. 우리는 해부학적 랜드마크를 사용하여 동물의 방향을 적절하게 지정하며, 이를 통해 하나의 시야에서 여러 구조를 이미징하고 비교할 수 있으며 표적 세포를 표면에 더 가깝게 만들 수 있습니다. 특히, 이 회전은 등쪽 또는 배쪽(양측 보기)에서 시각화를 용이하게 하여 동물의 왼쪽과 오른쪽을 비교할 수 있습니다.
이전에는 이러한 양측 구조를 시각화하고 비교하려면 더 깊은 곳에서 감소된 전송을 설명하기 위해 3D z 스택과 신호의 잠재적 정규화가 필요했습니다. 따라서 채널화된 한천에 의해 가능해진 정의된 방향은 여러 웜에서 보다 일관된 이미징을 가능하게 하고 향상된 측정을 가능하게 합니다. 이는 원주2와 같이 이미지화하기 어려운 방향으로 성장할 수 있는 재생된 신경 섬유의 수술 후 평가에 특히 유용합니다.
또한, 채널링된 한천은 동물이 우울증에 놓이기 때문에 동물의 스트레스를 줄여 커버슬립 압력을 완화하고 정상적인 생리를 촉진합니다5. 이완 균주는 장착 중에 뒤틀릴 수 있지만 채널은 전체 동물의 선형 구성 및 회전을 촉진합니다. 다른 구현예에서, 패터닝은 또한 동물을 이미지화하거나 관찰하는 데 필요한 마취제의 양을 줄이기 위해 동물의 움직임을 제약할 수 있다8.
마지막으로, 채널링 한천 기술도 접근성이 높습니다. 금형 제작 후 채널형 한천 패드를 만들려면 일반 편평한 한천 패드를 만드는 것과 거의 동일한 시간, 전문 지식 및 비용이 필요합니다. PDMS 금형을 만드는 데 필요한 모든 구성 요소는 많은 학술 실험실에서 공통적으로 사용하거나 온라인에서 구입할 수 있습니다. PDMS 금형의 내구성은 실험실을 위한 비용 효율적인 옵션이며 시간이 지남에 따라 광범위한 사용을 견딜 수 있습니다. PDMS 금형은 수년 동안 수백 번 사용할 수 있습니다. 우리는 적당히 열화되는 17 년 된 곰팡이를 계속 사용하고 있습니다. 곰팡이를 용기에 실온에서 보관하여 파편이 없도록 하는 것이 좋으며, 필요한 경우 탈이온수로 씻어낼 수 있습니다.
이러한 장점에도 불구하고 이 기술과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 패드에 동물을 놓는 데 사용되는 곡괭이의 힘은 채널을 변형시켜 잠재적으로 동물의 위치에 영향을 줄 수 있습니다. 모든 미세 조작과 마찬가지로 동물을 원하는 방향으로 배치하고 회전시키는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이로 인해 동물의 마취제 노출이 증가하고 잠재적으로 스트레스를 유발할 수 있습니다. 또한 채널은 커버슬립을 배치하는 동안 공기를 가두고 기포를 형성할 수 있으며, 이는 빛을 산란시켜 이미징의 선명도를 방해할 수 있습니다. 프로토콜의 거품을 최소화하는 방법에 대해 논의합니다. 우리의 경험에 따르면 채널링 한천의 단점 대부분은 약간의 훈련과 연습으로 대부분 피할 수 있습니다.
이러한 채널을 최적화하기 위한 향후 방향에는 예쁜꼬마선충의 다양한 연령 및 표현형에 대한 다양한 크기와 모양을 포함하여 특정 실험 요구에 맞춘 설계 개발이 포함됩니다. 나노 제조(nanofabrication)10 에 의한 맞춤형 채널 크기를 제작하는 것은 일반 채널5에 비해 동물에 대한 생리학적 영향을 줄일 수 있다. 결론적으로, 채널형 한천 패드의 구현은 나이든 동물의 모호한 구조를 고해상도 이미징으로 가능하게 합니다. 이 패드는 예쁜꼬마선충의 방향을 유지하여 향상된 이미징 품질과 상세한 시각화를 제공하는 동시에 채널의 지지 구조로 인해 동물에 가해지는 스트레스를 줄여줍니다.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
자금은 NIH R56NS128413에서 제공했습니다. 비닐 레코드 처리에 도움을 주신 Noah Joseph(Northeastern Bioengineering Department)에게 감사드립니다. 원고에 대한 통찰력 있는 의견을 주신 Chung Laboratory 구성원들에게 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 125 mL 에를렌마이어 플라스크 | Corning | 4980-125 | |
| 33 1/2 RPM 또는 12인치 롱 플레이 (LP) 비닐 레코드 | N/A | N/A | 개별 채널 깊이: 50 &마이크로; m, 너비 : 200 & 마이크로; m |
| 30 mL 플라스틱 주사기 | Fisher Scientific | 50-793-817 | |
| 90% 백금, 10% 이리듐 와이어 | Tritech Research | PT-9010 | 만드는 데 사용됩니다 |
| 아마존 | N/A | ||
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | AAL131910B | |
| 유리판 | 해당 없음 | N/A | 7인치 x 5인치 유리판 프레임에서 가져옴 |
| 유리 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 는 플래티넘 픽 핫 플레이트를 만드는 데 사용됩니다 |
| Thermofisher | SP88857104 | ||
| 마그네슘 황산염 | Fisher Scientific | AA3333736 | |
| 현미경 슬라이드 | Mckesson | 938360 | |
| 분자 생물학 등급 한천 | 벤치 마크 사이언티픽 | A1705 | |
| 인산칼륨 이염기성 | Fisher Scientific | P290-500 | |
| 인산칼륨 모노베이직 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 아지드 나트륨 | Fisher Scientific | AAJ2161022 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 사각 커버 유리 | Fisher Scientific | 12-541-016 | |
| SYLCAP 284-F (빠른 치료) 실리콘 엘라스토머 봉지재 키트, 투명, 광학적으로 투명, 10:1 믹스, 500 gm/ml (0.5 kg), Sylgard 184보다 빠르고 | MicroLubrol | N/A | |
| 진공 탈착기 | Fisher Scientific | 08-648-100 | |
| 무게 측정 접시 | 피셔 사이언티픽 | 01-549-750 |
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