Method Article

초음파 국소화 현미경을 사용한 쥐 뇌 미세혈관 구조의 2차원 초해상도 시각화

DOI:

10.3791/67813

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Fudan University, 2Academy for Engineering and Technology, Fudan University, 3School of Information Science and Technology, Fudan University, 4State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 쥐의 뇌 미세혈관 구조를 이미지화하기 위해 12.5μm 공간 해상도를 달성하는 초음파 국소화 현미경(ULM)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 혈류의 방향과 속도를 자세히 시각화할 수 있어 대뇌 순환 및 혈관 질환에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

Abstract

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대뇌 미세혈관 구조는 뇌 기능을 유지하는 데 필수적인 복잡한 혈관 네트워크를 형성합니다. 뇌졸중, 알츠하이머병, 신경교종, 혈관성 치매와 같은 질병은 미세혈관계에 심각한 장애를 일으킬 수 있습니다. 불행히도 현재의 의료 영상 방식은 이 규모에서 간접 관찰만 제공합니다. 광학 현미경에서 영감을 받은 초음파 국소화 현미경(ULM)은 침투 깊이와 공간 해상도 사이의 고전적인 균형을 극복합니다. 서브 파장 정밀도로 주입된 개별 마이크로버블(MB)을 현지화하고 추적함으로써 마이크로미터 규모에서 혈관 및 속도 맵을 생성할 수 있습니다. 여기에서는 상업용 초음파 플랫폼을 사용하여 쥐의 생체 내에서 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 위한 강력한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 12.5μm의 공간 해상도를 달성하여 미세혈관 구조를 재구성하고 혈류 방향 및 속도에 대한 자세한 정보를 제공하여 대뇌 미세순환에 대한 이해를 크게 향상시킵니다. 이 프로토콜은 쥐 질병 모델로 확장될 수 있으며, 신경 혈관 질환의 조기 진단 및 치료를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

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모세혈관, 세동맥, 정맥으로 구성된 대뇌 미세혈관 구조는 영양분 전달, 산소 교환 및 노폐물 제거를 촉진하여 뇌 기능을 유지하는 데 필수적입니다 1,2. 이 네트워크의 붕괴는 뇌졸중3, 알츠하이머병4, 신경교종5, 혈관성 치매6와 같은 신경 장애와 관련이 있으며, 이는 뇌 생리학적 장애로 이어집니다. 미세혈관 변화는 임상 증상이 나타나기 전에 나타나는 경우가 많기 때문에 진단 및 치료 개입의 중요한 표적이 된다 7,8. 구조적 및 기능적 수준 모두에서 혈관 변화에 대한 포괄적인 이해는 연구 및 치료 전략을 발전시키는 데 중요합니다.

그러나 대뇌 미세혈관 구조를 영상화하는 것은 크기가 작고 뇌 내 부분적으로 깊은 위치로 인해 특히 어렵습니다. 자기공명영상(MRI)9 ....

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Protocol

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본 연구에서 수행된 모든 동물실험은 푸단대학교 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인번호: 2022JS-004). 이 프로토콜은 동물에 대한 인도적인 대우를 보장하기 위해 푸단 대학교의 동물 관리 지침을 엄격히 준수합니다. 실험을 시작하기 전에 쥐에게 환경 순응을 위한 1주일의 기간을 허용해야 하며, 이 기간 동안 충분한 사료와 물을 제공해야 합니다. 광주기는 정상적인 생리적 상태를 유지하기 위해 생체 리듬에 따라 신중하게 조절됩니다. 실험이 끝나면 흡입된 이소플루란을 과다 투여하여 안락사를 수행합니다.

알림: 실험 설정은 그림 1A-H에 나와 있습니다.

1. ULM 이미징을 위한 동물 준비

  1. 마취
    1. 3.5% 이소플루란과 100% 산소의 혼합물을 3L/min의 유속으로 투여하여 쥐에 마취를 유도합니다. 약 4분 후, 챔버에서 동물을 꺼내 37°C로 예열된 이미징 플랫폼에 엎드려 놓습니다. 쥐의 뒷다리의 단단한 발가락 꼬집음에 대한 금단 반사가 없음으로써 마취의 깊이를 확인하십시오.

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Results

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그림 1은 쥐의 생체 내 뇌 미세혈관 ULM 이미징을 위한 세부 설정을 보여주며, 각 요소는 실험적 변동성을 최소화하고 신뢰할 수 있는 초고해상도 이미징 결과를 위해 정확한 데이터 수집을 보장하도록 신중하게 설계되었습니다.

그림 2A 는 쥐의 뇌에서 미세혈관 구조의 ULM으로 재구성한 구조를 보여주며, Bregma 지점에서 -1mm에 위치하며, 이미징 깊이는 12mm에 가깝습니다. 이미징 평면을 가로지르는 유효 슬라이스 두께는 0.1mm에서 0.3mm 사이입니다. 더 얕은 미세혈관과 더 깊은 미세혈관이 모두 명확하게 보이며 깊이가 증가해도 이미지 품질이 저하되지 않습니다(그림 2B). 관심 영역(ROI)에서 점선을 따라 강도 분포의 전체 너비(FWHM)를 계산하여 다양한 직경의 용기를 감지할 수 있으며 가.......

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Discussion

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이 프로토콜은 ULM을 성공적으로 활용하여 생체 내 쥐의 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 수행했습니다. 다른 이미징 방식과 비교했을 때, ULM은 공간 해상도와 침투 깊이를 동시에 수용합니다. 노출된 쥐의 뇌는 두개골을 통해서가 아니라 영상화되어 뼈의 존재로 인한 감쇠와 왜곡을 피했습니다. 중심 주파수가 15.625MHz인 트랜스듀서 아래에서 최대 12.5μm의 공간 분해능으로 약 12mm 깊이의 혈관 구조를 캡처했습니다. 혈류의 방향은 작은 동맥과 정맥의 특정 영역의 분화를 촉진했습니다. 또한 이 기술은 광범위한 유속 측정(1-80mm/s)을 지원합니다.

쥐에 대한 개두술은 이 프로토콜에서 매우 중요합니다. 수술 중에는 과도한 출혈을 최소화하는 것이 중요합니다. 한편으로, 과도한 출혈은 혈액 순환에 영향을 미칠 수 있으며, 전형적인 징후는 피질 영역에서 혈관 재건이 이루어지지 않는 것입니다. 다른 한편으로, 그.......

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Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 보조금 2023YFC2410903에 따른 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램, 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 12274092, 12034005), 상하이 탐험가 프로그램(보조금 21TS1400200), 상하이 국제 과학 기술 협력 프로그램(보조금 24490710400) 및 푸단대학교 AI 과학 재단(보조금 FudanX24AI016)의 일부 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
알코올DICHANGhttps://www.dehsm.com/goods-17187.html75%
빔포밍 프로그램몬트리올 대학교 의생명공학연구소Matlab 초음파 도구 상자 3.4 버전
체온 유지 장치RWD 생명과학 Co., Ltd.69026
뇌 정위 기기RWD 생명 과학 주식회사71000-R호흡 마스크에 적응 가능
개골 미세 주사 수술 기구 키트RWD 생명 과학 Co., Ltd.SP0005-R
디지털 현미경RWD 생명과학 Co., Ltd.DOM-1001
약물 전달 카테터RWD 생명 과학 주식회사https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
에리스로마이신 연고Renhe PharmaH360200181% x 15g
가스 마취기RWD 생명 과학 주식회사R500IE포함 호흡 마스크
휴대용 전기 이발기GUAZHOUMUMJD-DTJ02
휴대용 미니 두개골 드릴RWD 생명 과학 Co., Ltd.78001
유치 바늘친절하게 EnterpriseDevelopment Group Co., LTD양압 모델 26 그램
요오드 용액HYNAUThttps://www.hainuocn.com/index/detail/524.html4.5– 5.5g/L
IQ 복조 프로그램몬트리올 대학교 의생명공학 연구소Matlab 초음파 도구 상자 3.4 버전
이소플루란RWD 생명과학 Co., Ltd.R510-22-10
MATLAB 소프트웨어MathWorks버전 R2021a
미세 주입 펌프RWD 생명 과학 주식회사R462
염화나트륨 주사SHENG'AO 동물 제약 유한 회사2700714600.90%
SonoVueBraccohttps://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
구형 드릴 비트RWD 생명 과학 Co., Ltd.HM1027/HM1010
포지셔닝 소프트웨어 지원RWD Life Science Co., Ltd.V2.0.0.30400
주사기친절한 EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.RWLB1 mL
추적 프로그램Jean-Yves Tinevez2016 버전
초음파 젤Junkang Medical Equipment Co., Ltd.모델 DS-1
초음파 프로브VERASONICS, INC.L22-14vX LF
Verasonics 초음파 시스템VERASONICS, INC.Vantage-256초음파 플랫폼
두

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweeney, M. D., Ayyadurai, S., Zlokovic, B. V. Pericytes of the neurovascular unit: Key functions and signaling pathways. Nat Neurosci. 19 (6), 771-783 (2016).
  2. Wardlaw, J. M., Smith, C., Dichgans, M. Mechanisms of sporadic cerebral small vessel disease: Insig....

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