이 보고서는 인큐베이터 챔버 내의 공기 전도 열 스트레스 요인에 대한 응답으로 DAM2(Drosophila Activity Monitor)를 사용하여 성체 Drosophila melanogaster 녹다운 시간을 측정하는 방법을 설명합니다. DAM2는 적외선 빔을 가로지르는 개별 파리의 움직임을 기록하여 활동을 측정합니다. 데이터 분석은 저자가 만든 새로운 실행 파일에 의해 촉진됩니다.
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방법 논문
Drosophila Activity Monitor 시스템을 사용한 열 내성 분석: 데이터 분석을 위한 실행 가능한 응용 프로그램 가이드
이 논문에서
요약
초록
Drosophila melanogaster의 열 내성에 대한 연구는 수십 년 동안 연구자들에게 특히 흥미로웠으며, 열 내성을 평가하는 일반적인 접근 방식은 상승된 온도에 노출된 후 녹다운 시간(TKD)을 모니터링하는 것입니다. 일반적으로 파리는 개별 바이알에 보관되어 가열된 수조 안에 넣습니다. 그런 다음 TKD는 연구원에 의해 수동으로 모니터링됩니다. 매우 잘 확립되어 있지만, 이러한 수동 분석을 구현할 때 근육 경련을 포함한 모든 움직임의 중단에 대한 가시적인 정의와 주관성의 문제가 남아 있습니다. 당사는 TriKinetics 초파리 활성 모니터(DAM2)를 사용하여 내열성 분석을 자동화하기 위한 고처리량 방법을 개발했습니다. DAM2 시스템과 함께 우리는 프로그램을 작성하고 생성된 활동 데이터에서 마지막 이동 시간을 자동으로 읽을 수 있는 사용하기 쉬운 실행 파일을 만들었습니다. 그런 다음 이 스크립트는 각 파리에 대한 TKD(Time to Heat Paralysis)를 .csv 파일에 씁니다. 데이터에 따르면 이 자동화된 DAM2 방법은 일관되고 신뢰할 수 있습니다. 한편, 활동 횟수 데이터에서 생성된 활동 프로필이 중요합니다. 이러한 활성 프로파일은 컴파일될 수 있으며 열 내성의 상대적으로 연구되지 않은 행동 구성 요소를 포함하도록 열 내성 분석을 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 DAM2 시스템과 HoTDAM을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다! D. melanogaster의 내열성을 추정하는 소프트웨어.
서론
외온은 일반적으로 운동 활동을 증가시켜 열 스트레스에 반응합니다. 이 현상은 1944년 Cowles와 Bogert에 의해 기술된 특징적인 행동 반응과 함께 수십 년 동안 연구자들에게 명백했습니다1. 그들은 열 스트레스를 받는 유기체가 어떻게 먼저 증가된 운동 움직임을 보이는지 설명했습니다. 열 스트레스가 증가함에 따라 짧은 활동의 폭발과 비활동 기간이 산재합니다. 유기체가 더 이상 조정된 움직임을 보일 수 없는 온도가 임계 최대 열(CTmax)입니다. 근육질의 스팸이 뒤따르고, 결국 유기체는 붕괴한다 1,2. 이 붕괴는 정의하기 어렵고 "더위의 혹독함, 혼수 상태 또는 죽음"2과 유사한 것을 나타냅니다. 여기서 우리는 생리적 붕괴라는 용어를 사용하여 이론적으로 열 스트레스의 모호한 끝점을 지칭합니다.
초파리(Drosophila melanogaster) 및 기타 작은 곤충은 열 스트레스를 연구하는 데 유용한 모델이었습니다. 내열성을 구성하는 복잡한 형질 집합의 적어도 일부를 추정하기 위해 많은 연구자들은 생리적 붕괴가 발생하는 시간과 온도를 각각 TKD(Time to Knockdown) 및 CTmax를 나타내는 시간과 온도를 수동으로 관찰했습니다. 매우 잘 확립되어 있지만 이러한 수동 분석 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 생리적 허탈에 대한 조작적 정의는 확립하기 어려울 수 있으며, 특히 관찰자가 경험이 적은 경우 모든 경우에 적절하게 적용하기 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 유기체는 어느 시점에서 근육 경련에서 붕괴로 전환됩니까? 쓰러지기 전의 근육 경련과 발작 패턴은 예측할 수 없으며, 정확한 관찰을 복잡하게 만들 수 있으며, 2,3 정확성과 정밀도를 위협할 수 있다. 한편, 관찰의 어려움으로 인해 한 번에 분석할 수 있는 유기체의 수가 제한되어 확장성이 제한됩니다.
활동의 증가는 열에 대한 일관된 반응이고 TKD 및 CTmax는 궁극적으로 활동이 중단되는 지점이기 때문에 TriKinetics의 초파리 활성 모니터(DAM2)를 사용하여 열 내성 분석을 자동화하고자 했습니다. 우리는 최근 DAM2 시스템4를 사용하여 사용하기 쉬운 소프트웨어와 함께 자동화된 분석 방법을 발표했습니다. 이 분석은 여러 요인에 걸쳐 TKD 측면의 내열성 측정을 고전적인 수동 관찰 기반 TKD 분석과 비교하여 검증되었습니다. 우리는 또한 유도 가능한 내열성 표현형을 추가로 특성화하기 위해 TKD 분석의 운동 활성 구성 요소를 탐구했습니다. 우리는 이 분석법과 함께 제공되는 소프트웨어를 HoTDAM! (Drosophila Activity Monitoring System을 사용한 Heat Tolerance assay). 여기에서는 DAM2 시스템과 HoTDAM을 사용한 자동 내열성 분석 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다! 소프트웨어. 이 분석은 사용하기 쉽고 한 번에 많은 유기체를 측정할 수 있도록 쉽게 확장할 수 있습니다.
이 원고에서는 열감각 돌연변이 파리(일시적 수용체 전위 안키린 1; TRPA1) 그리고 그들의 유전적 통제(백색1118; W1118). 이러한 유기체는 분석을 위해 열 스트레스 동안 볼 수 있는 특징적인 증가된 활성의 중요성을 강조하기 위해 선택되었습니다. 즉, TRPA1 유기체는 이러한 탈출 행동을 보이지 않으며, 이는 보존된 행동 반응과 TKD와 같은 열 내성 추정치 사이의 본질적인 연관성을 보여줍니다. 우리는 암컷과 수컷 모두에 대해 분석을 수행했으며 열 경화 전처리를 구현했습니다. 여기에 제시된 대표적인 결과는 이전에 발표된 기존 검증 분석에 사용된 데이터보다 완전히 새로운 분석에서 얻은 데이터입니다.
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프로토콜
1. 플라이 사육
- 조사에 적합한 플라이 스톡/라인을 선택합니다.
참고: 분석을 설명하기 위해 일시적 수용체 전위 TRPA1 녹아웃 스톡과 유전자 대조군인 w1118 스톡을 사용했습니다. - 플라이 스톡을 적절하게 일관된 조건에서 유지하십시오. 이 프로토콜을 따르기 위해 표준 식품(옥수수 가루, 당밀 및 토룰라 효모)을 12:12 주간 주기로 25°C에서 보관합니다.
- 가벼운 마취로 남성과 여성을 분리하십시오.
참고: 실험에 따라 처녀 또는 짝짓기 파리가 사용될 수 있습니다.- 성인 수컷과 암컷(두 종에 대해 별도로)이 5일 동안 짝짓기와 산란을 할 수 있도록 합니다. 병에서 성인을 치우십시오.
- 며칠 후 성인이 닫히기 시작하면 병을 다시 비우십시오. 2일 후, 가벼운 에테르 마취를 사용하여 수컷과 암컷을 분리하고 바이알당 25마리의 파리 밀도로 따로 성숙시킵니다.
2. 전처리
- 실험 그룹(유전적, 환경적, 약리학적 또는 기타)을 정의할 전처리 또는 독립 변수를 적용합니다.
- 이 프로토콜을 따르기 위해 성인을 성별로 분리하고 5일 후 성인의 절반을 37°C의 수조에 1시간 동안 담가 전처리합니다. 인큐베이터의 컨트롤을 25°C로 유지하십시오. 전처리 후 내열성 분석 전에 24시간 동안 파리가 회복되도록 합니다.
3. DAM2 시스템 설정
- 파리를 DAM2 모니터 튜브에 넣고 튜브 양쪽 끝을 면으로 덮습니다. 파리의 내열성을 즉시 평가해야 하는 경우, 마취 노출과 관련된 잠재적인 교란 효과를 피하기 위해 유기체를 모니터 튜브에 로드하는 동안 마취를 사용하지 마십시오. 대신, 보유 바이알에서 모니터 튜브로 개별 파리를 흡인합니다.
- 분석 튜브를 활동 모니터에 넣고 다른 그룹이 로드되는 슬롯 번호를 기록해 둡니다.
참고: 모니터 내의 위치가 혼동 변수로 간주될 수 있는 경우 실험에 따라 무작위화될 수 있습니다. - DAM2 데이터 수집 소프트웨어
참고: DAM2 시스템 및 소프트웨어는 회사 웹 사이트에서 사용할 수 있는 DAMSystem3 소프트웨어 데이터 시트에 자세히 설명되어 있습니다( 재료 표 참조). 특정 문제 해결 및 일반 기능에 대해서는 DAM2 지침을 참조하십시오. 여기에서는 내열성 분석의 맥락에서 시스템을 사용하기 위한 지침을 제공합니다.- DAM2 시스템은 각 튜브 내의 개별 비행이 적외선 빔을 끊는 횟수를 모니터링합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어는 정의된 시간 간격마다 이 카운트를 인덱싱하고 재설정합니다. Preferences(선호)에서 분석에 사용할 판독 간격을 선택합니다. 해상도와 판독 오류 사이의 적절한 균형을 달성하기 위해 15초의 판독 간격을 찾았습니다.
참고: 읽기 간격은 사용 중인 모니터의 수보다 초 단위로 짧지 않은 것이 좋습니다. 판독 간격이 짧을수록 분석에 더 나은 시간적 분해능을 제공하지만 잠재적으로 판독 오류 사례가 증가할 수도 있습니다. 소프트웨어가 판독값을 인덱싱하려고 시도하는 동안 뒤처질 수 있습니다. 또한 더 새롭고 더 빠른 컴퓨터는 읽기 오류를 방지하는 데 큰 도움이 됩니다. - 판독 오류를 고려하는 동안 DAM2 데이터 수집 소프트웨어를 실행하는 데 사용되는 컴퓨터가 분석을 중단하지 않도록 절전 모드 또는 최대 절전 모드로 설정되어 있는지 확인하십시오. 또한 데이터를 수집하는 동안 자동 업데이트 (기관에서 제어하는 네트워크 업데이트 포함)가 꺼짐 으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 모든 모니터가 연결되어 있고 소프트웨어와 통신하고 있는지 확인하십시오. 현재 데이터 탭에서 각 모니터의 상태가 녹색인지 확인합니다.
참고: 다른 색상 코드가 참조하는 문제에 대한 자세한 내용은 DAMSystem3 소프트웨어 데이터시트를 참조하십시오. - 데이터 수집 소프트웨어는 시스템 파일 내의 Data 폴더에 있는 텍스트 파일에 활동 횟수를 자동으로 기록합니다. 데이터 분석을 더 쉽게 하려면 분석을 위해 데이터 수집 소프트웨어를 시작하기 전에 이 데이터 폴더 내의 모든 텍스트 파일을 삭제하십시오.
참고: 텍스트 파일은 자동으로 채워지므로 프로그램을 방해하지 않고 오래된 데이터를 지우기 위해 이 폴더에서 텍스트 파일을 제거할 수 있습니다.
- DAM2 시스템은 각 튜브 내의 개별 비행이 적외선 빔을 끊는 횟수를 모니터링합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어는 정의된 시간 간격마다 이 카운트를 인덱싱하고 재설정합니다. Preferences(선호)에서 분석에 사용할 판독 간격을 선택합니다. 해상도와 판독 오류 사이의 적절한 균형을 달성하기 위해 15초의 판독 간격을 찾았습니다.
4. 내열성 분석
- 모니터를 분석 인큐베이터에 로드합니다.
- 수집 소프트웨어를 시작하고 열 스트레스를 적용하기 전에 정의된 시간(예: 40개의 인덱스 또는 판독 간격이 15초로 설정된 경우 10분) 동안 소프트웨어가 인덱싱하도록 합니다.
알림: 이렇게 하면 튜브에 약간의 적응이 가능하고 설정하는 동안 모니터의 움직임에서 회복할 수 있습니다. 특히 분석 중 활성을 분석하는 경우 이 적응 시간은 열 스트레스 유도 전에 기준선 활성을 설정합니다. 수행되는 분석의 특정 특성에 따라 이 적응 단계를 건너뛸 수 있으며, 모니터를 이미 응력 온도에 있는 인큐베이터에 직접 배치할 수 있습니다. - 정적(TKD) 분석을 수행하는 경우 인큐베이터를 ramp적응 기간 후에 가능한 한 빨리 설정된 유해 온도로 이동합니다. 응답 변수는 TKD를 추정하기 위해 마지막으로 기록된 이동 시간(즉, 0이 아닌 마지막 인덱스)으로 운영됩니다.
- 동적 분석을 수행하는 경우 적응 기간 후에 온도가 증가하는 속도를 결정하십시오. 여기서 측정된 응답 변수는 기술적으로 다시 시간입니다. 마지막 움직임이 기록되는 시간은 램핑 속도에 따라 온도(CTmax)와 일치합니다.
- DAM 시스템 디스플레이에서 실시간으로 활동 횟수를 모니터링하거나, 수집 소프트웨어의 데이터 폴더에서 DAMSystem3 프로그램 파일의 텍스트 파일을 직접 검사할 수 있습니다. 라이브 데이터 기록에 문제가 발생하지 않도록 텍스트 파일을 복사하고 데이터 폴더 내의 원본 파일과 반대로 복사본을 엽니다.
- 몇 분 동안 파리에서 움직임이 보이지 않으면 수집 소프트웨어를 중지하십시오.
참고: 당사의 분석을 통해 몇 분에서 몇 분 동안 활동이 없는 것은 고전적인 수동 TKD 분석에서 볼 수 있는 것과 유사한 열 스트레스로 인한 생리적 허탈을 나타내는 것임을 발견했습니다. 그러나 이것은 자발적인 탈출 행동에 달려 있습니다. 따라서 조사의 특정 처리가 이러한 행동 반응을 변경할 수 있는 경우 가능한 혼란스러운 변수를 고려합니다. 또한, 분석의 특정 매개 변수(예: 온도, 처리)에 따라 분석의 길이는 분명히 달라질 것입니다.
5. 데이터 구성 및 분석
참고: GitHub에서 실행 가능한 응용 프로그램을 다운로드하는 방법과 소프트웨어의 기본 기능에 대한 연습은 추가 비디오 S1 을 참조하십시오.
- 데이터를 수집하면 참조된 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 텍스트 파일에서 오류를 스캔하고 비닝 활동 데이터를 위한 특정 시작 및 중지 지점을 선택합니다. 10분 적응 간격이 구현된 경우 활동 기록에서 10분 동안 비닝을 시작합니다. 범주화에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
- HoTDAM을 엽니다! 분석 소프트웨어를 선택하고 File(파일) | Load monitor data(모니터 데이터 로드)를 클릭하여 스캔한 모니터 데이터 파일을 가져옵니다.
참고: 소프트웨어 및 실행 가능한 응용 프로그램은 GitHub(https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) 또는 회사 웹 사이트의 분석 소프트웨어 섹션에서 사용할 수 있습니다. 실행 가능한 응용 프로그램은 현재 Windows 운영 체제와만 호환됩니다. - 그룹 지정을 추가하여 어떤 치료 그룹이 DAM2 모니터 내의 어떤 세포에 해당하는지 나타냅니다.
참고: 소프트웨어 인터페이스의 레이아웃은 모니터의 레이아웃에 해당합니다. - Start Multi-Group Definition(다중 그룹 정의 시작)을 클릭하여 여러 셀에 적용할 그룹 지정을 추가할 수 있는 대화 상자를 표시합니다. 그룹 지정이 수락되면 그룹 지정을 적용할 셀을 클릭한 다음 Stop Multi-Group Designation(다중 그룹 지정 중지)을 클릭합니다.
참고: 이 소프트웨어는 DAMSystem3 데이터를 구성하고 통계 소프트웨어에서 분석할 .csv 파일로 내보냅니다. - .csv File(파일) | Knockdown 데이터 내보내기 | 모든 모니터 내보내기 또는 선택한 모니터 내보내기. 각 플라이에 대한 TKD는 그룹 지정에 따라 출력에 구성됩니다.
- 각 플라이에 대한 활동 데이터를 File (파일) | 활동 데이터 내보내기 | Export All Monitors(모든 모니터 내보내기) 또는 Export Selected Monitors(선택한 모니터 )를 .csv 파일로 내보내기(Export All Monitors) 및 카운트 데이터(Count Data)만 유지하여 데이터 파일을 더 쉽게 작업할 수 있도록 하는 동시에 각 플라이에 대해 지정된 그룹 레이블을 할당할 수 있습니다.
참고: DAMSystem3 데이터 파일의 처음 몇 열은 수집 중 모니터의 내부 데이터(예: 조명 모니터링 또는 오류 메시지)에 해당합니다. 개수 데이터는 11-42열에 있습니다(자세한 내용은 DamSystem3 데이터 시트 참조). 분석 소프트웨어를 사용하여 활동 데이터를 내보내면 타임스탬프 및 개수 데이터 열을 제외한 모든 열이 제거됩니다. - CTmax 실험을 수행하는 경우 TKD를 사용하여 온도 램프 속도를 사용하여 CTmax를 측정합니다.
참고: 분석 소프트웨어는 C#(소스 코드는 GitHub에서 사용 가능, https://github.com/MatthewR47/HoTDAM)으로 개체 지향 방식으로 작성되었으므로 특정 목적에 맞게 사용자 정의할 수 있도록 프로그램의 측면을 쉽게 수정할 수 있습니다.
6. 통계
참고: 실험 설정의 세부 사항에 따라 TKD 데이터를 분석하기 위해 다양한 테스트를 사용할 수 있습니다.
- 생존 분석(예: Cox 회귀 분석, Kaplan-Meier)을 사용하여 knockdown을 분석 내의 각 비행이 경험하게 될 이벤트로 개념화합니다.
참고: 자세한 검토는 생존 분석과 그 구현에 대해 논의하는 Bradburn과 Clark의 4개 논문 시리즈를 참조하십시오 5,6,7,8. - ANOVA를 사용하여 그룹 차이를 평가하고 양상을 비교할 수 있으며, 특히 특정 조건에 대한 자동 분석을 검증할 때 사용할 수 있습니다.
- Kaplan-Meier 생존 분석을 사용하여 TKD 데이터를 분석합니다. 분석이 별도로 수행되도록 파일을 스톡별로 분할합니다(예: TRPA1 및 w1118 스톡 라인의 경우). 시간 변수를 TKD(최소)로, 넉다운을 이벤트로, 전처리를 요인으로, 성별을 계층으로 선택합니다.
- log-rank, Breslow 및 Tarone-Ware 테스트를 수행하여 여러 방법을 보여주는 설명을 위해 각 계층(즉, 성별)에 대한 전처리를 비교합니다.
- 생존 플롯을 구성합니다.
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결과
TRPA1 및 w1118 스톡에 대한 분석은 별도로 수행되었습니다. 백분위수 TKD 시간 및 기타 설명은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
| 백분위수a | ||||||||
| 성 | 치료 | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | 평... | |||||||
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토론
여기에서 설명하는 내열성 분석 방법은 다재다능하고 확장 가능합니다. 우리는 이전에 HoTDAM을 비교한 검증 연구를 발표했습니다! 방법을 고전적인 관찰 기반 TKD 분석법으로 변환하고 자동화된 분석법이 여러 요인에 걸쳐 동일한 일반적인 경향을 보여주는 것을 발견했습니다4 (그림 3). 즉, 기존의 수동 TKD 분석과 동일한 방식으로 DAM2 자동 분석은 성별, 분석 온도, 경화 전처리 및 분석 전 경화 전처리 후 회복 시간에 따라 유기체를 구별할 수 있었습니다. TKD가 연구자의 관찰에 의존하지 않는다는 점에서 자동 분석이 더 객관적인 것으로 추정되지만, 당사의 데이터는 이것이 DAM2 분석이 효과 발견 측면에서 수동 분석보다 현저히 우수하다고 제안하지는 않습니다. 우리는 분석이 정밀도 측면에서 매우 유사하다는 것을 발견했으며, 오히려 자동화된 분석 내의 효과 크기가 약간 더 작다는 것을 발견했습니다(검증 연구의 자동화된 DAM2 및...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
설명된 프로젝트는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 IDeA(Institutional Development Award) 보조금(5P20GM103427 및 1U54GM115458)의 지원을 받았습니다. UNK 학부 연구 펠로우 프로그램 및 UNMC 의대생 여름 연구 프로그램.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 14 mL 폴리스티렌 시험관 | Falcon | 352057 | |
| 30 갤런 어항 | 월마트 | ||
| 8 oz 병 | Genesee | 32-129F | |
| 상수 기후 챔버 | Memmert | HPP750eco | |
| 옥수수 가루 | 연구소 과학 | FLY801010 | |
| DAM2 초파리 활동 모니터 | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 데이터 시트) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem 데이터 수집 소프트웨어 | TriKinetics | 무료 다운로드 | |
| Drosophila 한천 | Lab Scientific | FLY80201 | |
| 에탄올 | Fisher Scientific | BP82011 | |
| 에테르 | Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan 소프트웨어 | TriKinetics | 텍스트 오류 스캔, 데이터 비닝 및 출력용 | |
| FlyStuff Flugs 병용 | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs 바이알용 | Genesee | 49-102 | |
| FlyStuff 바이알 | Genesee | 32-113RL | |
| HoTDAM 소프트웨어 | Github 또는 Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| 침지 순환 히터 | PolyScience | MX-CA11B | |
| 당밀 | Lab Scientific | FLY80084 | |
| 프로피온산 | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Glass tubes 5 x 65 mm for DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| 작은 페인트 브러시 | 월마트 | ||
| SPSS 통계 | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| torula 효모 | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 돌연변이 주식 | 블루밍턴 주식 센터 | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | 블루밍턴 주식 센터 | 3605 |
참고문헌
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- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
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