방법 논문

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜

DOI:

10.3791/67820

⸱

2025년 3월 14일

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, UT Southwestern Medical Center, 3Department of Neurology, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center, 5McDermott Center for Human Growth and Development, UT Southwestern Medical Center

이 논문에서

요약

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우리는 쥐에서 직접 미주신경 주사를 위한 프로토콜을 제시하여 주사 후 합병증 없이 신경으로 직접 약물을 전달할 수 있도록 합니다. 이 방법은 자율신경계 조작과 관련된 전임상 신경학적 연구에 적용됩니다. 필요한 수정을 통해 쥐 및 다른 종의 다른 신경에 대한 직접 신경 주입에 사용할 수 있습니다.

초록

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중추신경계로의 약물 전달을 촉진하기 위한 전략과 방법론은 상대적으로 풍부합니다. 그러나 말초신경계에 약물이 직접 전달되는 경우는 그리 흔하지 않으며, 연구자를 돕기 위해 이용할 수 있는 자세한 방법 간행물도 적습니다. 여기에서는 미주신경을 모델 신경으로 사용하여 말초신경계의 약물 전달을 위한 직접 신경 주입 방법을 설명합니다. 이 방법은 좌측 미주신경을 표적으로 하여 자율신경계 장애를 치료하는 데 사용할 수 있지만, 이 일반적인 주입 방법은 경미한 변형으로 다른 신경을 주입하는 것으로 외삽할 수 있습니다. 이 방법은 해부 현미경으로 마취된 성인 쥐의 미세 수술과 관련된 절차와 관련된 모든 중요한 단계를 설명합니다. 추적 염료의 사용은 실시간으로 주입 충실도를 쉽게 모니터링할 수 있도록 설명됩니다. 성공 및 실패한 주입에 대한 그림이 제공됩니다. 적절하게 수행된다면, 직접적인 미주신경 주사는 분만 후 합병증 없이 쥐가 잘 견딜 수 있는 안전한 방식으로 수행될 수 있습니다. 예를 들어, 외과 의사가 이 방법에 대해 교육을 받은 후 6마리의 쥐 중 6마리가 아무런 합병증 없이 성공적으로 주사되었습니다. 전임상 쥐 연구를 위한 이 직접 신경 주입 방법은 말초 신경에 제제(유전자 치료를 포함하되 이에 국한되지 않음)를 전달할 수 있습니다.

서론

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올바른 약물 투여 방법의 적용은 성공적인 치료 결과를 달성하는 데 중요한 요소 중 하나입니다. 중추신경계(CNS)에 치료제를 전달하는 방법은 풍부함에도 불구하고 직접 신경 주사에 의한 말초신경계(PNS) 전달에 대한 방법은 몇 가지에 불과하다고 보고되었습니다. 쥐의 배측근신경절(dorsal root ganglia, DRG)에 주사하는 것과 같은 직접 신경 주사는 통증 메커니즘, 약물 독성, 유전자 전달 1,2,3 및 일반방법 개발1,4에 대한 이해를 돕기 위해 전임상 연구에서 시도되었습니다. 직접 신경 주사에 대한 추가 보고에는 척추 신경 주사4, 좌골 신경 주사1, 쥐5 및 생쥐6의 미주신경 주사가 포함된다. 최근에는 토끼의 시신경두에 치료제를 더 잘 분배하기 위해 하수상 주사 방법이 제안되고....

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프로토콜

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다음 프로토콜은 기관 윤리 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인에 따라 수행됩니다.

1. 주거 준비

참고: 이 프로토콜은 최소 2개월 된 성인 쥐를 위한 것입니다. 더 작은 동물 (쥐 및 어린 쥐 포함)은 가능하지만 권장되지 않으며 훨씬 더 어려울 것입니다.

  1. 미주신경 수술 전 48시간 동안 촉촉한 차우 또는 기타 부드러운 음식(수의학 회복 젤)을 제공하십시오. 시술 후 동물이 먹는 데 어려움을 겪을 수 있으므로 수술 전에 동물에게 이러한 품목을 소개하여 이러한 식품의 맛에 익숙해지고 먹는 동기를 유발하도록 돕습니다.
  2. 쥐를 수술 최소 1주일 전과 수술 후 1주일 동안 케이지에 개별적으로 가둬둡니다. 이를 통해 혼자 있는 스트레스에 적응할 수 있고 새끼 고양이의 수술 후 상처가 긁히는 것을 방지할 수 있습니다.

2. 수술 용품 및 공간 준비

  1. 필요한 모든 항목의 목록을 미리 만들고 모든 항목이 수술에 사용할 수 있는지 다시 확인하십시오....

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결과

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본 연구에서는 6마리의 성체 쥐(수컷 3마리, 암컷 3마리)를 사용하였다. 6마리 중 1마리의 쥐를 여러 번 주입하여 주입 부위 주위에 염료의 확산을 보여주는 주입 실패 상태를 보여주었습니다( 그림 5A). 다른 모든 쥐는 그림 4B 및 그림 5B에서 볼 수 있듯이 부드러운 주입 및 신경 염색을 보여주었습니다.

그림 1은 튜브가 있는 주사 바늘의 설정이 올바르지 않을 때 바늘과 튜브 사이에 염료가 누출되는 상황을 보여줍니다. 이 실험에 사용된 1% 염료는 너무 두껍지 않지만 밀봉 누출로 인해 주입 바늘을 통한 염료 통과에 실패했습니다. 이러한 종류의 문.......

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토론

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좌측 미주신경에 직접 주입하는 방법은 쥐에서 수술 후 합병증 없이 안전하게 수행할 수 있습니다. 미주신경으로의 약물 전달은 자율신경계(ANS)를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 연습과 중간에서 높은 수준의 수술 기술이 필요한 특정 중요한 단계가 포함됩니다.

이 수술 절차는 쥐에서 균형 잡힌 전신 마취를 필요로 합니다. 외과 의사는 특히 늙은 쥐의 경우 더 나은 회복을 위해 마취제 노출을 제한하기 위해 더 짧은 기간 내에 수술을 끝내는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 또한 주사 및 수술 후 회복을 성공적으로 하기 위해 일정 수준의 무균 수술 기술을 갖춘 훈련된 외과의를 가정합니다. 미주신경의 해부학적 위치는 중요한 위치에 깊숙이 자리 잡고 있습니다13. 좌측 미주신경은 좌측 총경동맥과 나란히 흐르는데, 이는 분리 및 주사 시 동맥과 신경 모두에 손상을 입힐 위험.......

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공개 사항

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저자 NR 및 XC는 이해 상충이 없습니다. RMB와 SJG는 미주신경 주사를 통해 ANS로 유전자를 전달하는 것과 관련된 지적 재산권을 발명한 기업입니다(미국 특허 #11,753,655). SJG와 RMB는 Taysha Gene Therapies로부터 로열티 수입을 받았고, SJG는 Taysha Gene Therapies로부터 컨설팅 수입을 받았습니다.

감사의 글

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쥐 수술 공간을 마련해 주신 UT Southwestern Animal Resource Center Facility에 감사드립니다. 이 연구를 위한 자금은 NIH/NINDS R01 NS087175, Hannah's Hope Fund 및 Taysha Gene Therapies를 통해 SJG에 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL BD  탈착식 투베르쿨린 주사기 25g x 5/8". 바늘벡톤, 디킨슨 및 회사SKU:309626주입 시 미주 신경을 당기고 고정하기 위해 구부러진 바늘로 연결하는 데 사용됩니다.
0.5% 부피바카인 염산염 주사HospiraNDC 0409-1162-19국소 조직을 마취하는 데 사용되는 국소 마취제.
100mL 0.9% 염화나트륨 관개 USP스테리카레 솔루션항목 #6240생리 식염수, 쥐와 조직을 재수화하는 데 사용됩니다.
20 무딘, 견인기 팁, 7.5mmKent Scientific CorporationSurgi 5018수술 시 조직을 분리하고 고정하는 데 사용됩니다.
3 mL BD-Luer-Lok 주사기, 멸균, 일회용 Becton, Dickinson and CompanySKU # 309657쥐에게 식염수를 주입하고 식염수를 폴리에틸렌 튜브에 채우는 데 사용됩니다.
AK-Fluor10%AkornNDC 17478-253-10신경 내에서 볼 수 있는 플루오레세인 염료. 사출 충실도를 추적하는 데 사용됩니다.
동물 체중계 KentScientific CorporationSCL 4000쥐의 체중을 측정하는 데 사용됩니다.
Ansell ENCORE Perry 스타일 42 PF 수술용 장갑AnsellASTM D3577멸균 장갑은 외과 의사가 수술할 때 사용합니다.
인공 눈물 연고 3.5gPivetalNDC 46066-753-55눈의 과도한 건조를 방지하기 위해 eyses에 사용됩니다.
베이비-믹스터 지혈제 Fine Science Tools13013-14비상시 출혈을 멈추는 데 사용됩니다. 바늘에서 25G x 5/8"을 구부리는 데에도 사용됩니다.
BD Intramedic PE 튜빙Becton, Dickinson and Company14-170-12AHamilton 바늘 및 NanoFil 바늘과 연결하기 위해 주입 설정 시스템에 사용됩니다. 또한 주입 혼합물을 담습니다.
BD Precison 글라이드 바늘, 25 G x 5/8"Becton, Dickinson and CompanyREF#305122쥐에게 식염수를 주입하고 구부러진 바늘을 만드는 데 사용됩니다.
BD Precison 글라이드 바늘, 27G x ½ "Becton, Dickinson and CompanyREF#301629BD Indermic 튜브에 멸균 식염수를 채우는 데 사용됩니다.
벤치마크 Accuris " 다음페트" 가변 용량 피펫 마이크로 스타터 세트에는 4개의 피펫이 포함되어 있습니다: 10/20/200/1000 & L, 플러스 스탠MilliporeSigmaBMSP7700S1멸균 용액을 피펫하는 데 사용됩니다.
베타딘, 포비딘 요오드 10% Honestmed67618015017수술 부위를 소독하는 데 사용됩니다.
카프로펜 주사 용액 50 mg/mLCovtrus에서 공급(6451506845)SKU 591149우리의 경우 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 동물 자원 센터에서 제공하는 5mg/kg의 용량률로 희석된 카프로펜을 사용했습니다.
곡선 바늘(맞춤 제작)Becton, Dickinson and CompanyREF#305122BD PrecisionGlide 25G x 5/8" 바늘은 지혈제의 도움으로 90도로 구부러집니다. 바늘 끝이 뭉툭하게 만들어집니다. 사용하기 전에 멸균해야 합니다. 미주 신경을 걸고 분리 및 주입 시 고정하는 데 사용됩니다.
부 현미경Motic SMZ-171-BLED(Binocular with Lights)주 신경 분리시의 비계 해부학적 영역을 확대하고 주입 누출을 확인하는 데 사용합니다.
드레이프 시트 DynarexReorder#8122멸균 후 드레이프로 사용됩니다.
Dukal 코튼 팁 어플리케이터, 비멸균Dukal품목 9003조직의 분리를 둔화시키는 데 사용되며 사용하기 전에 멸균해야 합니다.
Dumont #7 - Fine ForcepsFine Science Tools11274-20미주 신경을 총경동맥에서 분리하는 데 사용됩니다. 곡선이 되어 있기 때문에 사용하기 쉽습니다.
Ethicon PDS II 염색되지 않은 모노필라멘트 봉합사 - 봉합사, 4/0 18 PDS II CLR MONO PSEthiconVA - Z682G상처 봉합에 사용됩니다.
Ethilon 나일론 봉합사 블랙 모노필라멘트Ethicon1856G비흡수성 봉합사를 사용하는 경우 상처를 봉합하는 데 사용됩니다. 노즈콘 내부에 코를 고정하기 위해 쥐 이빨을 걸 때도 사용됩니다.
미세 겸자 - 거울 마감정밀 과학 도구11412-11총경동맥에서 미주 신경이 분리될 때 사용됩니다. 이것은 직선입니다.
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-09조직 절단에 사용됩니다.
해밀턴 세척액해밀턴HT18311사용 후 해밀턴을 청소하는 데 사용됩니다.
해밀턴 바늘, 27G, 소형 허브 RN 바늘, 2", PT3, 6/PK해밀턴7762-01BD Intramedic&trade 연결하는 데 사용됩니다. PE 튜브.
해밀턴 주사기, 710RN 해밀턴7638-01미주 신경 주사시 약물을 보관하는 데 사용됩니다.
인슐린 주사기EXEL INT, 컴포트 포인트REF 26027카프로펜 및 국소 마취제를 주사하는 데 사용됩니다.
리도카인 2% 주사CovetrusReorder#002468부피바카인과 혼합하여 절개 부위에 주사하는 데 사용됩니다. 
Luxol Fast Blue MBSNAcros Organics212170250신경 내에서 보이는 염료, 주사 혼합물이 보이도록 약물과 혼합하는 데 사용됩니다.
유리 구슬이 있는 마이크로 비드 살균기정밀 과학 도구항목 번호 18090-46쥐 수술 사이에 수술 도구를 살균하는 데 사용됩니다.
나노필 바늘-NF35BV-2 World Precision InstrumentNC9708956미주 신경 내부에 약물-염료 혼합물을 주입하는 데 사용됩니다.
봉합사 절단기가 있는 Olsen-Hegar 바늘 홀더정밀 과학 도구12002-12상처 봉합에 사용됩니다.
Parafilm M 실험실 포장 필름, 4인치 x 125피트, 상자당 1롤, 12카운정직 PM#996-염료 혼합물을 BDTM 피내 튜브에 적재하는 것이 정확하도록 분취된 5uL의 약물-염료 혼합물을 고정하는 데 사용됩니다.   
PDI 알코올 준비 패드HonestmedNDC 10819-3914-2수술 부위를 소독하는 데 사용됩니다.
프리미엄 케어 멸균 유형 VII 거즈 스펀지, 8 겹, 2" x 2"Dukal항목 C5119수술 시 쥐의 목 아래 cushon으로 사용됩니다. 
프레스' n 씰 클링 필름기쁜시 쥐를 드레이프처럼 덮는 데 사용됩니다. 
쥐 견인기 세트Kent Scientific CorporationSurgi 5002경동맥에서 미주 신경을 쉽게 분리할 수 있도록 절개를 열어 두는 데 사용됩니다.
라이트템프 주니어Kent Scientific Corporation20.3cm W x 25.4cm L(8인치 W x 10인치 L), 쥐를 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다.
에스& T 집게 - SuperGrip 팁정밀 과학 도구00632-11봉합 시 손상 없이 조직을 고정하는 데 사용됩니다.
에스& T 봉합사 결속 겸자정밀 과학 도구00272-13봉합사를 조이는 데 사용됩니다.
메스 칼날 #15Fine Science Tools10015-00목 복부 피부를 절개하는 데 사용됩니다.
메스 손잡이-#7Fine Science Tools10007-12메스 칼날을 고정하는 데 사용됩니다.
사기 펌프  KD 사이언티픽78-81-8052GL  직렬 #D107034 (모델 # LEGATO-180)은 프로그램에서 소량의 혼합물을 펌핑 할 수있는 프로그래밍 가능한 펌프입니다.
TipOne 필터 팁 리필 스타터 시스템미국 과학품목 #1120-3510약물과 염료 혼합물을 피펫팅하는 데 사용됩니다.
이소플루란용 기화기, 깔때기로 채워진Kent Scientific CorporationVetflow 1231쥐를 마취하는 데 사용됩니다.
Vetbond 조직 접착제3M Science Applied to LifeID B00016067합이 완벽하지 않은 경우 절단 상처 부위의 조직을 밀봉하는 데 사용됩니다.
Wahl BravMini+ 전문 무선 이발기 키트Kent Scientific CorporationCL7300-Kit쥐의 털을 자르는 데 사용됩니다.
드 해미 좌트 약물 수술 주 봉

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
  2. O'donnell, M., Fontaine, A., Caldwell, J., Weir, R.

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