Method Article

Identification and Classification of Position-specific GABA A Receptor Subunit Missense Variants for Their Role In Hippocampal Pyramidal Neurons(해마 피라미드 뉴런에서의 역할에 대한 위치별 GABAA 수용체 소단위 미스센스 변이체의 식별 및 분류)

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 DNA에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르는 다중 스케일 프레임워크를 소개합니다. 이 연구는 GABAA 수용체 소단위체에서 예측된 병원성 돌연변이를 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 제시하며, 병원성으로 예측되는 간질 유발 돌연변이와 근위 돌연변이가 CA1 피라미드 뉴런 모델에 유사한 효과를 일으킬 수 있다는 가설을 세웁니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간질 관련 유전자에서 기능적으로 알려지지 않은 변이의 영향을 이해하는 것은 질병 병태생리학을 밝히고 맞춤형 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. DNA 염기서열에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르는 다중 스케일 프레임워크를 통해 병원성 돌연변이를 예측하고 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 설명하며, GABAA 수용체 소단위체의 간질 유발 돌연변이와 인근에서 예측된 돌연변이가 CA1 피라미드 뉴런 모델에 유사한 효과를 생성할 수 있다는 가설을 세웁니다. 이 연구는 예측된 병원성 돌연변이와 근위 간질성 돌연변이 사이의 특징적인 관계를 탐구함으로써 간질성 돌연변이가 해마 피라미드 뉴런 시뮬레이션에 미치는 영향을 기반으로 예측된 돌연변이의 영향을 추정하는 것을 목표로 합니다.

이 방법론은 GABAA 수용체 γ2 서브유닛 유전자 데이터 수집으로 시작하여 사용자 지정 스크립트를 사용하여 R에서 수행된 데이터 정리 및 형식 지정으로 이어집니다. 다음으로, 앙상블 예측기를 적용하여 γ2 subunit의 병원성 미센스 변형을 식별하고 우선 순위를 지정합니다. 간질 유발 돌연변이가 공유하는 소단위 구조 영역에 대한 특정 병원성 변이(예측)를 매핑하는 것이 설명되며, 그 영향에 대한 분자 모델링 및 진화적 보존에 대한 고려가 함께 제공됩니다. 그런 다음 변이체별 메타 분석 및 매개변수 정규화를 수행한 후 상관 관계 분석을 수행하여 예측된 돌연변이와 근위 간질 유발 돌연변이 사이의 중요한 관계를 식별합니다. Python 기반 신경 시뮬레이터를 사용하여 야생형 및 간질 유발 돌연변이의 영향을 반영하는 다중 구획 전도도 기반 뉴런 모델에 대해 설명합니다. 간질성 GABAA 수용체 아형에 의해 생성된 신경 반응의 시뮬레이션은 예측된 병원성 변이가 신경 반응에 미치는 영향을 대략적으로 추정하기 위해 고려됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 간질 연구에 중요한 GABAA 수용체 변이체가 신경 행동에 미치는 영향을 추정하기 위한 다중 스케일 프레임워크를 탐구하는 최초의 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간질과 관련된 GABAA 수용체의 잠재적인 병원성 변이체로 인한 세포 표현형의 예측을 향상시키기 위한 기초 역할을 할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

거의 모든 인간 질병의 경우, 유전적 변이는 개인의 감수성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 염기서열 변동이 질병 위험과 어떻게 관련되어 있는지 이해하는 것은 질병 발생과 관련된 주요 과정을 밝히고 예방 및 치료를 위한 새로운 접근 방식을 식별하는 데 유용한 방법을 제공합니다1. 이는 소아 1차 진료에서 가장 흔한 만성 질환 중 하나인 신경 발달 장애에도 적용된다2. 자폐 스펙트럼 장애, 지적 장애, 간질과 같은 질환은 유전적 변이가 발달 중 개인의 감수성에 얼마나 큰 영향을 미치는지를 보여준다3.

발달 중인 뇌는 흥분과 억제 사이의 중요한 균형에서 유전적으로 프로그래밍된 신경 발달 불일치로 인해 성인 뇌보다 간질 발작에 더 취약합니다4. 성인 뇌의 주요 억제성 신경전달물질인 GABA(감마 아미노낙산)는 배아 및 출생 후 초기 발달 과정에서 흥분성을 일으키기 때문에 어린 뇌의 발작을 예방하는 데 필요한 안정성에 좋지 않습니다. K-Cl 공동수송체5의 충분한 발현 부족으로 인해 발생하는 이러한 일시적인 상태는 기능 장애가 있는 GABAA 수용체가 존재할 때 발작 활동의 위험을 증가시키는 데 기여할 수 있습니다. GABAA 수용체는 Cl-ion 6의 세포 내 농도에 따라 GABA의 흥분성 및 억제 작용을 매개합니다. 따라서 뇌가 성숙해짐에 따라 GABAA 수용체를 암호화하는 유전자와 다른 이온 채널의 돌연변이는 흥분성을 왜곡시키고, 신경 세포 대사, 세포 신호 전달 및 시냅스 형성7에 관여하는 유전자의 돌연변이는 아동기 결석 간질8과 같은 질환을 유발할 수있다.

신경 발달 장애 치료의 정밀도를 높이기 위해 유전자 분석을 활용하는 임상 개입이 점점 더 많아지고 있습니다2. 소아 간질에서 유전자 검사는 정밀 의학 접근법9의 잠재적 표적을 제시하며, 치료 결정을 안내하는 데 있어 유전적 변이의 중요성을 강조합니다. 또한, 새로운 돌연변이가 있는 간질 환자의 ~25%가 정밀 의학의 잠재적 표적을 식별하는 유전자 진단을 받았으며, 이는 치료 결정을 안내하는 데 있어 유전적 변이의 중요한 가치를 강조합니다10. 이는 표적 유전자 패널(targeted gene panels), 전체 엑솜 염기서열분석(whole-exome sequencing), 전체 게놈 염기서열분석(whole-genome sequencing)과 같은 차세대 염기서열분석 기술의 발전에 힘입어 유전자 발견을 극적으로 가속화했습니다11. 그러나 새로운 유전자 발견의 수가 증가함에 따라 질병 발병에서 변이체의 분자 역할에 관한 상충되는 증거 또는 불충분한 정보를 반영하는 분류인 VUS(Unknown Significance)가 발견될 때 문제가 발생합니다. VUS로 분류된 변이체는 ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics) 및 AMP(Association for Molecular Pathology)에서 제안한 5단계 변이 분류 체계 내의 한 범주에 해당합니다12.

기능적으로 알려지지 않은 유전적 변이의 문제를 해결하려면 임상 실습과 연구라는 두 가지 주요 차원에 걸친 노력이 필요합니다. 임상적으로 VUS를 둘러싼 불확실성은 환자 관리 및 의사 결정을 복잡하게 만들 수 있습니다13. 과학적 연구의 관점에서, 중요성이 불확실한 변이의 수가 증가함에 따라 병원성 변이를 식별하고 질병 병태생리학 및 표현형 효과에서 이들의 역할을 결정하는 것이 중요하다1. 한 가지 이상적인 시나리오는 기능적으로 특성화되지 않은 모든 변이체의 분자, 신경 및 네트워크 수준 효과를 정확하게 예측하여 실험실 기반 조사에 필요한 자원, 시간 및 노력을 최소화하는 것입니다. 이러한 측면은 유전성 간질의 정확한 진단을 가능하게 하고, 맞춤형 치료를 지원하며, 잠재적인 약리학적 표적의 발견을 촉진하기 위해 유전적 변이를 정확하게 분류하는 것의 중요성을 강조합니다. 현재의 예측 도구 14,15,16,17은 비교적 정확하지만 일반적으로 이분법 분류(병원성 대 양성)만 제공하고 분자 병태생리학, 표현형 결과 및 기본 메커니즘에 대한 질병별 통찰력이 부족합니다. 본 논문은 선별된 GABAA 수용체 서브유닛 인코딩 유전자의 알려지지 않은 미스센스 변이체에 초점을 맞추고, 분자적, 진화적, 구조적 측면과 같은 변이의 맥락적 요인과 간질 관련 돌연변이의 체외 생물물리학적 데이터에서 파생된 신경 병리학 시뮬레이션을 통합하여 연구 지침을 강화하는 것을 목표로 하는 프레임워크를 제시합니다. 우리의 방법론은 간질 18,19,20의 병태생리학에 관여하는 핵심 소단위인 GABA A 수용체의 γ2 소단위체의 알려지지 않은 병원성 변이체의 식별을 다룹니다. 그 다음에는 구조적 및 전기생리학적 데이터를 특징으로 하는 간질 관련 돌연변이와 이러한 예측된 변이의 위치별 일치에 대한 탐색이 이어집니다. 그런 다음 이러한 데이터를 사용하여 빠른 시냅스 억제를 담당하는 γ2, α1 및 β3 소단위(γ2-GABAA 수용체)로 구성된 GABAA 수용체 아형을 발현하는 해마 피라미드 뉴런 모델에 대한 변형 효과를 추정하는 데 사용됩니다6. GABAA 수용체는 큰 소단위 풀(α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π 및 ρ1-ρ3)에서 조립되며 소단위 구성에 따라 GABAA 수용체는 조절, 생물물리학적 특성, 특정 기능과 결합된 지역, 세포 및 세포 내 발현 패턴이 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다 6,21,22,23, 24,25. 따라서 본 연구는 γ2-GABAA 수용체 또는 γ2 함유 GABAA 수용체에만 초점을 맞춥니다.

GABAA 수용체 소단위는 긴 N-말단 세포외 도메인(ECD), 4개의 막관통 도메인(TM1 - TM4), TM1 및 TM2를 연결하는 세포 내 링커, TM2 및 TM3를 연결하는 세포 외 링커, TM3와 TM4 사이의 큰 세포 내 루프(TM3-TM4 루프) 및 짧은 세포 외 C 말단 6,26, 27. GABAA 수용체는 GABA 결합이 β 및 α 소단위체를 잠그는 복잡한 "잠금 및 당기기" 메커니즘을 통해 기능하여 소단위의 세포외 도메인(ECD)을 당겨 시계 반대 방향으로 회전시키는 것으로 제안됩니다27. 이러한 움직임은 막관통 도메인(TMD)을 구부려 이온 채널(27)을 개방합니다. 따라서, 채널 활성은 GABAA 수용체 내의 구조적 카세트와 함께 조정되는 것으로 보입니다. 간질 돌연변이는 이러한 구조적 카세트의 왜곡을 통해 채널 활동의 기능 장애를 유발하는 것으로 밝혀졌습니다28. 결과적으로, 본 연구는 GABAA 수용체 소단위체의 특정 구조 카세트에서 기능적으로 확인된 간질성 돌연변이에 근접하여 예측된 병원성 변이가 이러한 간질성 돌연변이의 사례에서 관찰된 바와 같이 채널 기능에서 유사한 전기생리학적 또는 생물물리학적 왜곡 패턴을 나타낼 수 있다는 아이디어에 기반을 두고 있습니다. GABAA 수용체 서브유닛28에 간질성 구조 카세트가 존재한다는 것은 간접적으로 이 개념을 뒷받침하지만, 본 연구는 간질성 돌연변이의 생물물리학적 매개변수를 예측된 병원성 돌연변이의 매개변수와 상관시키는 것의 복잡성과 도전을 보여줍니다. 이러한 복잡한 관계를 밝히기 위해 당사의 프레임워크는 DNA에서 단백질 기능 및 간질 연구에 중요한 신경 행동에 이르는 다중 스케일 접근 방식을 강조하기 때문에 중요합니다. 이 접근 방식은 컴퓨터 유전학을 분자 모델링 및 신경 시뮬레이션과 통합하는 동시에 채널 구조, 활성 및 신경 흥분성에 대한 돌연변이의 영향을 포착할 수 있는 대규모 데이터 세트에서 훈련된 기계 학습과 같은 보완 방법의 중요성을 강조합니다. 또한, 해마 피라미드 뉴런 모델에서 간질성 γ2-GABAA 수용체 활성을 시뮬레이션하면 GABAA 수용체 채널병증과 관련된 체외 세포 표현형을 복제하고 네트워크 기능 장애의 중심에서 변경된 단일 뉴런 반응을 입증할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 병원성 변이체의 인실리코(In silico ) 예측

  1. 변형 데이터 수집
    1. ClinVar 데이터베이스29를 사용하여 웹 사이트를 통해 관심 유전자의 코딩 영역에서 VUS(variants of uncertain significance)를 검색합니다 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. 검색창에 유전자 기호(예: GABRG2)를 입력하고 결과를 필터링하여 단일 뉴클레오티드, 유의성이 불확실한 미센스 변이와 같은 원하는 유형의 변이체만 포함합니다. 데이터를 data.xlxs (보충 파일 4: 보충 표 S1)로 다운로드하여 저장합니다. 다운로드한 데이터의 날짜를 기록합니다.
      참고: 본 프로토콜에서는 GABAA 수용체의 인간 γ2 소단위체, 특히 호모 사피엔스 감마-아미노낙산형 A 수용체 소단위 감마2(GABRG2), 전사체 변이체 1, mRNA(NCBI 참조 서열: NM_198904.4), γ2L이라고도 함)를 분석합니다. 다른 계산 방법에 따라 다른 식별자가 필요할 수 있기 때문에 다른 데이터베이스(UniProt, ENSEMBL, PDB)에서 관심 유전자의 참조 전사체와 기타 해당 식별자를 기록하는 것이 중요합니다(보충 파일 4: 보충 표 S2). 데이터베이스 또는 계산 도구가 시퀀스 식별자의 버전 번호를 인식하지 못하는 경우 버전 번호가 있는 ID(NM_198904.4)와 버전 번호가 없는 ID(NM_198904)를 모두 시도합니다.
    2. 참고 단백질 기본 정보
      1. NCBI 데이터베이스 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 의 검색 옵션에서 Nucleotide를 선택하고 관심 유전자의 NCBI Ref. seq. ID(NM_198904.4)를 입력합니다. 그런 다음 오른쪽 열을 아래로 스크롤하여 관련 정보 범주 아래의 단백질을 클릭하여 전사체 NM_198904.4에 의해 인코딩된 단백질(NP_944494.1)을 찾습니다. 단백질 NP_944494.1에 대해 제공된 정보를 사용하여 특정 영역의 서열 위치를 표 형태로 기록합니다(보충 파일 4: 보충 표 S3).
        참고: 단백질 도메인, 인산화 부위, 리간드 결합 부위 및 분자 상호 작용 계면과 같은 기능적 및 구조적으로 중요한 영역, 모티프 또는 잔기의 서열 위치에 대한 예비 알려진 정보를 결정하는 것이 중요합니다. 이는 데이터베이스(NCBI, ENSEMBL, UniProt 등)와 문헌 검색을 결합하여 달성할 수 있습니다.
  2. 변형 데이터 구성
    1. 선택한 예측 변수에 대한 입력 요구 사항을 충족하도록 데이터를 구성합니다. 검색된 데이터의 형식이 dbNSFP 서버 http://database.liulab.science/dbNSFP 의 요구사항과 일치하도록 구성되었는지 확인하십시오. 이렇게 하려면 data.xlsx 파일(1.1.1단계의 보충 파일 4: 보충 표 S1 )에서 불필요한 열을 제거하고 다음 열만 지정된 순서로 유지합니다.
      "GRCh38Chromosome", "GRCh38Location", "Name", "Protein change"입니다.
    2. 새 파일 이름 "data1.xlsx"(보충 표 S4)으로 파일을 저장합니다. 코드를 실행하여 R에서 data1.xlsx 파일의 형식을 지정합니다(Supplementary File 1: Data_GABAA. R)을 사용하여 형식이 지정된 데이터를 R 프로젝트와 관련된 작업 디렉토리에 data1_output.xlsx (보충 파일 4: 보충 표 S5)으로 저장합니다.
      참고: 계산 방법에 따라 데이터 유형과 형식이 달라야 합니다. 특정 형식 요구 사항에 따라 데이터를 수집하고 구성하는 것은 수십 개의 변형에 대해서도 오류가 발생하기 쉽고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 변형 풀이 몇 개의 변형으로만 구성되지 않는 한 이 단계가 중요합니다. 그런 다음 수동 데이터 구성이 가능할 수 있습니다.
  3. 병원성 예측
    1. data1_output.xlsx 파일의 내용을 http://database.liulab.science/dbNSFP 를 통해 액세스되는 dbNSFP 서버30,31의 아카데믹 버전으로 전송합니다. 이렇게 하려면 파일을 복사/붙여넣기하거나 .txt 형식으로 직접 업로드하십시오.
    2. 제출하기 전에 서버에서 HG38(게놈 빌드), ClinPred32 및 BayesDEL33 옵션을 미리 선택하고 확인해야 합니다. 몇 분 내에 서버가 결과를 생성합니다.
      참고: 본 프로토콜에서는 높은 정확도(34)와 실용성을 위해 두 개의 앙상블 예측변수, 즉 BayesDEL33 및 ClinPred32가 선택되었습니다. 그러나, dbNSFP 데이터베이스(30,31)에서 사용 가능한 AlphaMissense와 같은 다른 예측 변수도 선택할 수 있습니다. 인실리코(in silico) 도구의 선택은 강력한 예측을 위한 충분한 여러 라인의 계산 증거의 생성을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다12. 여러 예측 알고리즘의 분석을 통합하는 앙상블 예측 변수는 이러한 목적을 달성할 수 있습니다.
    3. 출력 파일(.txt 형식)을 다운로드하여 data2.xlsx 파일로 저장합니다(보충 파일 4: 보충 표 S6).
    4. data2.xlsx(Supplementary File 4: Supplementary Table S6)에서 메뉴에서 필터 옵션을 클릭하고 D를 필터링하여 두 열의 합의 변형을 결정하여 필터를 설정합니다. 이것은 가장 병원성 변이의 목록을 제공합니다. 저장하십시오(보충 표 S6 [ 보충 파일 4]의 합의 탭 참조).
  4. 변형 선택
    1. 합의된 병원성 예측 중에서, 문헌에서 얻은 간질성 돌연변이에 근접한 변이체를 결정합니다. 후자가 뉴런 모델링에 적합한 구조적 및 생물물리학적 매개변수를 가지고 있는지 확인합니다.
      참고: 이 단계는 탐색적이며 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 측면에서 관심 단백질을 조사하는 것과도 관련이 있습니다. 본 연구에서, 이러한 데이터는 간질 관련 돌연변이에 대한 조사와 더불어 Brünger et al.35 및 Guo et al.36에서 얻은 것입니다. 게다가, 옵션으로, AlphaMissense37 점수는 dbNSFP 데이터베이스30,31 반복 단계 1.3 (보충 파일 4 : 보충 표 S7)에서 액세스되었습니다. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 2.1.1 및 2.1.2 및 결과("구조적 및 생물물리학적 매개변수에 대한 클러스터링 변형" 참조)에 나와 있습니다.
    2. 기본 시각화를 위해 Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) 및 HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) 서버를 사용하여 선택한 GABRG2 유전자 돌연변이(P302L40 및 K328M(또는 39-잔기 신호 펩타이드를 제외한 경우 K289M41))의 맥락에서 이전 단계의 변이체를 검사합니다.
      참고: 복잡성이 엄청나기 때문에 변형 효과의 구조적 평가는 여러 수준의 분석에서 수행되어야 합니다. Protter38 과 같은 도구를 사용하면 단백질의 토폴로지 특징과 관련하여 변이체를 명확하게 시각화할 수 있으며 HOPE39 와 같은 사용자 친화적인 서버는 분자 모델링을 통해 변이체 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 관심 단백질에 대한 포괄적인 문헌 검토는 간질과 관련된 돌연변이에 대한 정보를 식별하고 통합하는 데 중요합니다.
    3. 진화적 보존 및 구조적 통찰력 분석
      1. 단백질의 편집, 시각화 및 분석을 위한 오픈 소스 프로그램인 Jalview 42,43,44를 엽니다.
      2. 정렬을 위해 시퀀스를 가져옵니다. 상단 메뉴에서 File(파일 )을 클릭합니다 | 시퀀스 가져오기; 대화 상자에서 데이터베이스 (예: UniProt)를 선택합니다. ID 검색 탭을 클릭하십시오. 대화 상자에 설명된 대로 인간 및 기타 척추동물 종의 관심 유전자(GABRG2)의 UniProt 식별 ID를 입력합니다: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. 확인을 클릭합니다.
        참고: GABRG2 에 의해 암호화된 단백질의 UniProt 등록 번호는 다음과 같습니다: 호모 사피엔스의 경우 P18507 (P18507-2), Mus musculus의 경우 P22723, Pan troglodytes의 경우 A0A2I3TKX0, Sus scrofa의 경우 F1RR72, Canis familiaris의 경우 A0A8I3MDZ2, Danio rerio의 경우 A0A8M1P4D6.
      3. 관심 유전자에 따라 일부 염기서열에는 주석이 표시되지 않을 수 있습니다. 따라서 BLAST 검색을 수행하여 더 나은 컨텍스트 이해를 위해 관련 정보와 잠재적 동질체를 식별합니다. 이 경우 파일 메뉴의 Add Sequences/From 텍스트 상자 옵션을 통해 단백질 염기서열의 FASTA 형식을 업로드하여 원하는 염기서열의 다중 염기서열 정렬을 생성합니다.
      4. 정렬이 로드되면 여러 시퀀스 비교를 위해 표시된 시퀀스를 관찰합니다. 각 행은 시퀀스를 나타내고 각 열은 정렬의 위치를 나타냅니다. 최상의 정렬 방법을 결정하려면 다른 접근 방식을 사용하십시오. 예를 들어, 시퀀스 메뉴에서 웹 서비스를 클릭하고 사전 설정으로 T-Coffee 실행 옵션을 선택하면 최적의 정렬이 가능합니다.
      5. P18507 Homo sapiens 서열(본 연구의 참조 서열)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 참조 서열로 설정합니다. 상단 메뉴에서 Format을 선택하고 Wrap을 클릭하여 화면에서 전체 정렬을 시각화합니다. 동일한 Format 메뉴에서 위의 눈금을 클릭하여 특정 잔류 번호의 시각화를 향상시킵니다. 시각화를 더욱 향상시키려면 Color(색상)로 이동하여 다른 옵션(예: Clustal Color, Chemical Property)을 선택하여 색 구성표를 조정하십시오. 필요한 경우 글꼴 크기를 수정합니다.
      6. 메뉴 표시줄에서 Calculate 를 클릭하고 Autocalculate consensus 를 선택하여 보존된 영역을 강조 표시합니다.
      7. 인실리코(in-silico) 예측 단계에서 식별된 관심 변이체의 위치에 초점을 맞추고 특정 변이체 위치를 조사합니다. 특정 잔여물을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Add Annotation을 선택하여 주석을 추가합니다. 적절한 색상 코드가 있는 레이블(예: 변형 ID)을 작성하고 저장합니다.
        참고: 본 분석에서는 P302L(보라색) 및 A303T(빨간색)를 선택하여 구조 데이터와 함께 다중 시퀀스 정렬로 시각화했습니다(다음 섹션 참조).
    4. 선택된 보존된 잔류물을 보여주는 전체 단백질의 3차원 재구성
      1. 이전 단계에서 얻은 파일에서 참조 시퀀스(GABRG2 human)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 3D 구조 데이터를 선택합니다.
      2. 드롭다운 메뉴에서 적절한 구조 데이터(7QNE, 체인 C)26 을 식별하고 Jmol로 새 구조 보기 열기를 선택합니다.
        참고: 이렇게 하면 다중 염기서열 정렬에서 선택한 잔류물을 3D 화학 구조에 대한 오픈 소스 Java 기반 뷰어인 Jmol에 의해 구조 데이터에 통합할 수 있습니다.

2. 파라미터 선택 및 생물물리학적 모델링

  1. Variant-specific meta-analysis 및 parameter normalization
    1. 최신 문헌을 조사하여 전기생리학적 데이터 채널 컨덕턴스(gGABAA), 비활성화 시간(τ비활성화), 상승 시간(τ상승) 및 최대 전류 진폭(Imax)을 사용하여 식별된 서브유닛 변형을 수집합니다. 각 사례에 대한 subunit compositions, cell type 및 wild-type 측정값을 제공합니다. 그에 따라 변이체와 그 대조군에 레이블을 지정합니다(예: 생물물리학적 특성이 식별된 변이체 및 각 변이체에 대한 야생형 측정에 대해 알려진 대조군으로 알려짐).
    2. 식별된 생물물리학적 특성을 가진 변이체에 대한 AlphaMissense 병원성 점수를 얻습니다.
      참고: 자세한 내용은 프로토콜 섹션 1.3을 참조하십시오.
    3. 각 변이체에 대한 소단위 및 아미노산 위치, 원래 아미노산과 변경된 아미노산, 병원성 점수 및 문헌에서 얻은 생물물리학적 매개변수가 포함된 데이터 프레임을 만듭니다. 실험적 불일치를 방지하려면 식별된 변이체에 대한 생물물리학적 매개변수를 야생형 측정에서 x-fold 변화로 정규화합니다.
  2. 구조적 및 기능적 특성에 의한 비교 변형 분석
    1. 데이터 프레임에서 예측된 변형을 구성합니다. 그에 따라 라벨을 부착합니다(예: 생물물리학적 특성에 대한 문헌이 없는 변이체에 대해 예측됨).
    2. 변이체를 아미노산 서열과 3차 구조에서의 위치에 따라 분류합니다. 데이터 프레임에 구조적 분류 매개변수(예: 알파 나선, 코일, 베타 시트, 세포 외, 세포 내 또는 막관통 도메인의 국소화, 기공 내벽, 작용제 결합, 단백질-단백질 상호 작용)를 추가하고 아미노산 위치와 관련하여 각 변이체에 대한 정보를 제공합니다.
    3. 변형체를 막 중심과 공극 축까지의 거리에 따라 분류합니다. 데이터 프레임에서 pore axis에 대한 거리와 membrane center 매개변수까지의 거리를 추가합니다.
    4. 알려진 변이에 대한 구조적 및 생물물리학적 매개변수 간의 상관관계를 분석합니다. 가능한 경우, 얻어진 상관 관계에 대해 예측된 변형을 평가합니다.
  3. Synapse 및 뉴런 모델 구성
    1. 스파이크 신경망을 모델링하고 시뮬레이션하기 위해 Python으로 개발된 오픈 소스 신경 시뮬레이터인 Brian245를 사용하여 다중 구획 전도도 기반 해마 피라미드 뉴런에서 GABAergic 시냅스의 다중 구획 생물물리학 모델을 구축합니다.
    2. 이온 채널 게이팅 동역학, 수동 및 능동 매개변수, 시냅스후 전도도를 정의하여 컨덕턴스 기반 모델을 설계합니다. 모델에 사용된 방정식을 설명하는 Supplementary File 2에 제공된 대로 컨덕턴스 기반 모델을 정의합니다.
      1. 멤브레인 커패시턴스(Cm)를 1μF/cm2 로 설정하고 세포 내 저항(RA)을 200 Ω.cm로 설정합니다.
      2. gL= 0.0003 S/cm2, gK= 0.036 S/cm2, EL = -76.5 mV, ENa = 50 mV, EK = -90 mV인 해마 피라미드 뉴런39에 대해 수정된 Hodgkin-Huxley 유형 전도도를 사용합니다.
      3. gNa에 대한 NaV 채널의 밀도 분포를 soma의 경우 0.05 S/cm2, 축삭 초기 세그먼트(AIS) 및 Ranvier(NR)의 노드에 대해 0.5 S/cm2, 수상돌기의 경우 0.005 S/cm2로 조정합니다. 수초분절에서 gK 및 gNa를 0으로 설정합니다.
      4. 보충 파일 2에 설명된 대로 NaV 및 KV에 대한 이온 채널 게이팅 역학을 구축합니다.
      5. 시냅스 전류(Isyn)를 구획에 있는 모든 글루타메이터 시냅스와 GABAergic 시냅스의 합으로 소개합니다. 글루타메이터 전류(Iglu)에 빠른 AMPA 수용체 매개 전류(IAMPA)와 느린 NMDA 수용체 매개 전류(INMDA)를 모두 포함합니다. GABAergic 전류(IGABA)에 빠른 GABAA 수용체 매개 전류만 포함합니다. 일정한 양의 글루타메이트가 모든 시냅스전 스파이크에 대해 시냅스로 방출된다고 가정합니다. 따라서 수용체의 활성화는 스파이크 시간에 따라 달라지며(sAMPA 및 sNMDA) 총 수용체 전도도(gAMPA 및 gNMDA)는 모든 이벤트에서 방출되는 글루타메이트의 양을 반영합니다.
      6. 보충 파일 2에 설명된 대로 시냅스 모델을 사용합니다.
        참고: 방정식에 대한 자세한 설명은 모델에 사용된 방정식을 설명하는 보충 파일 2 를 참조하십시오.
    3. 이전 문헌46,47에서 실험적으로 측정된 소마 및 신경돌기에 대한 직경과 각 신경돌기 구획의 길이 및 분기 패턴을 얻습니다. 세포를 여러 구획으로 나누어 실제 뉴런 형태를 다중 구획 모델로 축소하여 주요 분기 구조를 정확하게 보존하고 양측 대칭을 유지합니다.
    4. 형태학적 (세그먼트 길이 및 직경, 즉, d_soma: 30 μm, l_AH: 5 μm, d_AH_i: 1.5 μm, d_AH_f: 1.3 μm, l_AIS: 40 μm, d_axon: 1 μm, l_myseg: 100 μm, l_NR: 2 μm, l_AxTer: 4 μm, d_AxTer: 2 μm, l_approx: 100 μm, l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i : 4 μm; d_approx_f : 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis : 2 μm; l_apLM : 70 μm; d_apLM : 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal : 1.4 μm; l_nAcDbasal_stem : 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1.5 μm) 및 피라미드 뉴런 모델46,47의 각 구획에 대한 생물물리학적 매개변수(섹션 2.3.2에 주어진 대로)는 Python 스크립트(보충 파일 3: GABAAvar.py)에도 자세히 설명되어 있습니다.
    5. 2.1.1단계에서 얻은 야생형 제어 측정값을 평가하여 GABAergic 시냅스 모델에 대한 생물물리학적 매개변수를 결정합니다.
  4. 뉴런 모델의 토폴로지를 설계하고 이전에 얻은 형태학적 및 분기 정보를 기반으로 구획의 공간 배열 및 상호 연결을 지정하는 것을 포함하는 형태학적 및 생물물리학적 매개변수를 할당합니다. 보충 파일 3: GABAAvar.py 에 설명된 대로 적절한 형태학적(예: 세그먼트 길이 및 직경) 및 생물물리학적 매개변수(섹션 2.3.2)를 모델의 각 구획에 할당합니다.
  5. 시냅스 구축 및 전류 주입
    1. "GABAAvar.py"(보충 파일 3)에 지정된 대로 SpikeGeneratorGroup(Brian2 라이브러리의 클래스)을 사용하여 시냅스 전 활동을 만듭니다. Synapses 클래스를 사용하여 스파이크 생성기를 모델 뉴런의 타겟 컴파트먼트에 연결하여 시냅스 연결을 모델링합니다.
    2. 지속적인 정전류(Iinj)를 0.85nA로 설정하고 soma에 배치하여 보충 파일 3: GABAAvar.py 에 설명된 대로 주어진 시간에 기준선 이온 전류 부하에 의해 구동되는 하위 임계값 활동을 모방합니다.
  6. 기록 모니터를 구축하려면 StateMonitor 를 사용하여 타겟 컴파트먼트의 전압 트레이스를 기록합니다.
  7. 네트워크를 구축하고 실행합니다.
    1. Network를 사용하여 모델 뉴런, 연결, 모니터로 네트워크를 구축합니다.
    2. 시뮬레이션의 시간 단계를 defaultclock.dt (예: 0.01ms)로 설정합니다.
    3. network.run(T*ms)을 사용하여 네트워크에서 시뮬레이션을 실행하며, 여기서 T는 이 예제에서 1,000ms로 설정됩니다.
  8. GABAA 수용체 미감지 돌연변이의 영향 테스트
    1. 2.1.1단계에서 수집된 생물물리학적 매개변수를 통해 채널 동역학에 대한 각 미센스 돌연변이의 영향을 정의합니다.
    2. 이러한 파라미터를 변경하여 자극을 실행하고 "GABAAvar.py"(보충 파일 3)에 지정된 대로 "matplotlib.pyplot"을 사용하여 결과를 플로팅합니다.
  9. 발사 패턴과 속도의 변화를 분석하기 위해 매개변수 조합을 테스트합니다. 비교를 위해 결과를 플롯합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 간질 병태생리학의 핵심 구성 요소인 GABAA 수용체의 γ2 소단위체에서 병원성 변이를 예측하고 특성화하기 위해 멀티스케일 접근 방식을 사용합니다. 이 접근 방식은 예측 모델, 분자 모델링, 진화 보존, 구조 검사, 상관 관계 분석 및 신경 시뮬레이션을 사용하여 변이의 분류를 향상시키며, 이는 간질 연구 및 임상 사용에 상당한 관련성을 갖습니다. 방법론의 전체 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

인접한 두 γ2 subunit 돌연변이의 비교 평가

GABAA 수용체 소단위체의 간질성 돌연변이에 인접한 예측된 병원성 돌연변이가 채...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

컴퓨터 유전학, 분자 모델링 및 신경 시뮬레이션의 조합을 적용함으로써 이 논문에서 제시된 접근 방식은 GABAA 수용체 변이체의 분류를 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 간질 연구와 임상 응용 모두에 귀중한 통찰력을 제공합니다. 예측된 병원성 돌연변이의 식별 및 우선순위 지정을 위한 포괄적인 분석이 제시되고 단백질에 대한 변이 효과와 세포 표현형 사이의 격차를 잠재적으로 해소하는 프레임워크로 확장됩니다. 해마 피라미드 뉴런 시뮬레이션에 대한 간질성 GABAA 수용체 활성의 영향을 평가하면 GABAA 수용체 기능 장애와 관련된 체외 표현형을 복제하고 네트워크 기능 장애의 근원에서 단일 뉴런 반응 변화를 입증할 수 있습니다. 간질 유발 돌연변이에 의해 생성된 신경 반응의 이러한 시뮬레이션을 기반으로 구조적으로 근접하게 예측된 돌연변이의 기능적 효과에 대한 대략적인 추정이 조사되었습니다. 예측...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 이 저작물과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모델 뉴런 구축에 도움을 주신 Çağla Koca에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
브라이언2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 프랑스; 임페리얼 칼리지 런던, 영국2.8.0.4Stimberg 외, 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP 서버   Genos Bioinformatics LLC, 미국v3.0Liu 외, 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
희망   분자 및 생체분자 정보학 센터 CMBI, Radboud University, 네덜란드 1.1.1Venselaar 외, 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
잘뷰   영국 던디 대학교JV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter Notebook프로젝트 Jupyter, 미국https://jupyter.org/install 
피톤Python 소프트웨어 재단, 미국3.13https://www.python.org/downloads/
프로터   ETH 취리히, 스위스버전 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R 미국 통계 컴퓨팅을 위한 R 재단R 버전 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RS투디오Posit 소프트웨어, PBC, 미국RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" 출시https://posit.co/downloads/

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