방법 논문

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

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DOI:

10.3791/67846

⸱

2025년 1월 24일

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

초록

지방 조직은 주로 부피에 따라 성숙한 지질이 풍부한 지방 세포로 구성됩니다. 이러한 유사분열 후 세포는 에너지 저장 및 동원, 체온 조절 및 내분비 인자 분비에 중요한 역할을 합니다. 칼로리 불균형으로 인한 백색 지방 조직의 확장은 기존 지방 세포의 확대와 지방 세포 전구 세포로부터 추가적인 지방 세포의 생성을 초래합니다. 지방 세포에 영향을 미치는 것을 포함하여 비만으로 인한 백색 지방 조직의 변화는 제2형 당뇨병 및 13가지 유형의 암과 같은 수많은 동반 질환과 관련이 있습니다. 지방세포가 질병에 어떻게 기여하는지 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 성숙한 지방세포를 쉽게 분리하고 배양할 수 없다는 것입니다. 이 논문은 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스의 피하 및 내장 지방 저장소에서 쥐, 야윈 및 비만 지방 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 분리된 1차 지방세포를 최대 2주 동안 멤브레인 지방세포 응집체 시스템에서 배양할 수 있는 방법을 자세히 설명하며, 이는 공동 배양 실험, 지방 분해 분석 또는 지방 세포 분비 인자를 포함하는 컨디셔닝 배지 수집을 통해 기능 분석을 용이하게 합니다. 또한, 이 프로토콜은 기저막 매트릭스 돔에서 지방 조직 외식을 배양하고 1차 분리된 지방 세포를 이미징하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은 이 접근 방식이 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 지방 조직에 상주하는 지방 세포 전구 세포를 분리하기 위한 기존 프로토콜과 통합될 수 있다는 것입니다. 이러한 프로토콜은 함께 연구자들에게 야윈 쥐와 비만인 수컷 및 암컷 마우스의 지방 세포, 지방 세포, 지방 세포, 전체 지방 조직을 기능적으로 연구할 수 있는 도구를 제공합니다.

서론

미국의 성인 비만 유병률은 2030년까지 50%에 이를 것으로 예상되며,1 비만의 세포 및 생리학적 영향을 더 잘 이해하는 것이 필수적입니다. 비만은 칼로리 불균형으로 인해 지방으로서의 에너지 저장량이 증가하여 백색 지방 조직이 확장되는 것이 특징입니다. 지방 조직 확장은 새로운 지방 세포의 생성(증식) 또는 기존 지방 세포의 크기 증가(비대)를 통해 발생할 수 있습니다. 두 과정 모두 지방 조직의 확장을 초래하지만, 비대성 확장은 대사 건강이 감소하고 대사 장애의 발병률이 높아지는 것과 일치합니다 2,3. 지방 조직의 복잡성에 대한 더 나은 이해는 대사 장애 및 제2형 당뇨병 및 암을 포함한 기타 비만 관련 동반 질환을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.

지방 조직은 에너지 저장 및 체온 조절에 대한 역할로 오랫동안 높이 평가되어 왔습니다. 그러나 최근에는 지방 조직이 대사 산물, 지질 및 펩타이드의 분비를 담당하는 중요한 대사 신호 전달 조직으로 부상했습니다 4,5. 아디포카인(adipokine)이라고 하는 이러한 지방 조직 유래 분자는 국소 및 전신적으로 신호를 보내고 에너지 항상성, 면역 기능, 혈관 역학 등을 조절할 수 있습니다 5,6,7. 성숙한 지방세포는 지방조직 세포의 약 50%를 구성하며 지방조직 부피의 대부분을 차지한다8. 중요한 것은 연구에 따르면 지방세포(adipocytes)가 많은 하위 집단으로 구성되어 있다는 사실이 밝혀졌다는 것입니다 9,10. 이와 같이, 지방세포 전구세포는 성 및 지방 조직 저장소와 같은 요인에 따라 성숙한 지방세포의 뚜렷한 집단을 생성합니다. 이러한 성숙한 지방세포는 식단과 비만의 변화에 의해 추가로 조절될 수 있으며, 전사적으로 구별되고 다른 부분비 시그니처를 발현하는 지방세포의 하위 집단을 생성할 수 있습니다 9,11,12,13,14,15,16 . 그 복잡성과 생리학적 중요성에도 불구하고, 성숙한 지방 세포를 분리하고 배양하는 능력은 이러한 세포를 연구하는 데 뚜렷한 장벽으로 남아 있습니다.

성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용되는 현재 사용 가능한 방법은 지방세포 전구세포(APC)와의 분화, 형광 활성화 세포 분류 및 원심분리 기반 기술을 사용하지만 모두 고유한 단점이 있습니다. APC를 성숙한 지방세포로 시험관 내 또는 체외에서 분화하는 것은 성숙한 지방세포를 발달시키는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 이러한 인위적으로 분화된 세포는 하나의 큰 지질 방울을 포함하는 생체 내 성숙한 지방 세포의 단위치 표현형이 아닌 많은 작은 지질 방울을 포함하는 다위치입니다17. 또한, 연구에 따르면 in vitro 분화된 세포는 in vivo에서 발견되는 분리된 성숙한 지방 세포와 전사적으로 구별됩니다 17. 중요한 것은 체외 분화가 제지방세포와 비만 지방세포의 차이를 포착할 수 없다는 것입니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 일반적으로 조직에서 특정 세포 집단을 분리하는 데 사용됩니다. 그러나 성숙한 지방세포는 크기가 크고 막이 연약하기 때문에 FACS 조건에서 쉽게 파열될 수 있으므로 성숙한 지방세포를 분리하는 데 비효율적인 방법입니다. 다른 기존 프로토콜은 다량의 유리 지질이 축적되는 결과를 낳으며, 이는 시간이 지남에 따라 배양에서 성숙한 지방 세포에 독성을 초래할 수 있습니다.

여기에서는 백색 지방 조직에서 쥐 성숙 지방 세포를 분리하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 원래 Harms et al.17에 의해 확립된 성숙한 지방 세포 응집체 배양을 위한 프로토콜에서 채택되었습니다. 그러나 여기에 설명된 원심분리 기반 접근법은 일반적인 실험실 장비를 사용하며 소량(~0.5g)의 지방 조직에서 지방 세포를 효율적으로 분리할 수 있습니다. 이것은 쉽게 적응할 수 있는 시스템이며, 수컷과 암컷 마우스에서 성숙한 쥐 지방세포를 분리하기 위한 수정, 내장 및 피하 지방 저장소, 다양한 식단 조건이 포함됩니다.

프로토콜

설명된 모든 동물 실험은 유타 대학의 동물 사용 및 관리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 체중이 20-45g인 8-16주 령의 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에서 성숙한 지방 세포를 분리하는 데 최적화되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 용액 준비

  1. 콜라겐분해효소 완충액을 준비합니다. 콜라겐분해효소 분말 100mg, 1M HEPES 완충액 1mL, 100x P188 500μL, 1M CaCl2 50μL, BSA 0.05g 및 Medium 199 48.45mL를 추가합니다. 멸균 여과 용액, 분취 및 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 세포 배양 배지를 만듭니다. DMEM 500mL, FBS 50mL, 페니실린-스트렙토마이신 5mL, L-글루타민 보충제 5mL를 함께 섭취합니다.

2. 생쥐에서 백색 지방이 많은 조직 저장소의 수집

  1. 각 창고와 조건에 따라 200μL의 HBSS가 포함된 1 x 10cm 플레이트를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
  2. 동물의 집에서 동물을 회수하고 기관의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다. 이곳에서는 동물들이 깊은 마취 상태에서 자궁경부 탈구로 안락사되었습니다.
  3. 적절한 경우 각 마우스의 무게를 측정하고 기록합니다.
  4. 마우스를 70% 에탄올을 분사하여 외부를 코팅하여 살균합니다.
  5. 마우스에서 적절한 지방 패드를 수확하십시오18,19.
    알림: 조직을 접시에 넣기 전에 피하 저장소에서 림프절을 제거하도록 주의하십시오.
  6. 각 지방의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다.
  7. 준비된 10cm 접시에 얼음 위에 뚱뚱한 패드를 놓습니다.

3. 백색 지방 조직 이식의 준비

참고: 이 단계는 선택 사항입니다.

  1. 해부를 시작하기 최소 12시간 전에 기저막 매트릭스(Matrigel)를 4°C의 얼음으로 해동하고 4°C에서 멸균 200μL 피펫 팁 한 상자를 냉각합니다.
  2. 냉각된 피펫 팁을 사용하여 80μL의 기저 멤브레인 매트릭스를 24웰 배양 플레이트의 각 웰 중앙에 피펫팅하여 돔을 만듭니다(그림 1A). 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 30분 동안 놓아 매트릭스를 부분적으로 응고시킵니다.
  3. 조직 준비: 멸균 해부 가위를 사용하여 각 샘플에서 조직 0.1g의 무게를 측정하고 얼음 위의 PBS에 놓습니다.
  4. 멸균 겸자를 사용하여 미리 계량된 조직을 부분적으로 응고된 매트릭스 돔에 삽입합니다. 내장된 조직 위에 30μL의 기저막 매트릭스를 추가합니다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣어 조직을 기저막 매트릭스에 고정합니다.
    참고: 기저막 매트릭스에 조직을 삽입하는 것은 조직이 떠다니지 않고 배양에 남아 있도록 하는 데 중요합니다. 이를 통해 조직의 건강과 품질을 보존할 수 있습니다(그림 1B).
  5. 각 웰에 1mL의 성장 배지(10% FBS가 포함된 DMEM)를 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.

4. 콜라겐분해효소 처리

  1. 필요한 콜라겐 분해 효소 용액의 양을 계산합니다. 표 1을 참조하십시오.
  2. DNase로 콜라겐분해효소 용액을 준비합니다. 콜라겐 분해 효소 용액 1mL당 DNase 0.00017g을 추가합니다. 섞는 소용돌이.
  3. 면도날을 사용하여 조직이 균질하게 보일 때까지 분리된 지방 조직을 다집니다(그림 2A). 다진 조직을 멸균된 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    알림: 과도하게 다지지 마십시오. 다지기는 조직이 균질하고 페이스트 모양으로 나타날 때 완료됩니다. 다진 조직이 부족하면 두툼하고 이질적인 것처럼 보이며, 다진 조직이 과도하게 다지면 유리 지질이 방출됩니다(그림 2B).
  4. 준비된 콜라겐분해효소와 DNase 용액을 4.1단계에서 계산된 부피를 사용하여 다진 지방 조직에 추가합니다. 7-10초 동안 최대 속도로 소용돌이가 완전히 결합됩니다. 50mL 원뿔형 튜브를 220rpm, 37°C로 설정된 셰이커에 수평으로 놓습니다.
  5. 10분 동안 진탕을 배양한 다음 5초 동안 와류를 배양하고 샘플을 확인합니다. 완전히 소화된 샘플은 눈에 보이는 덩어리나 조직 조각 없이 균일하게 나타납니다. 샘플이 완전히 분해되지 않은 경우 셰이커에서 2분마다 확인하여 분해를 계속합니다(그림 2C).
    참고: 과도하게 소화하지 마십시오. 콜라겐분해효소 용액에 과도한 시간을 투여하면 지방세포가 분해되고 지질이 방출될 수 있습니다.
  6. 혈청학 피펫을 사용하여 분해된 조직을 체를 통해 새로운 50mL 원뿔형에 통과시킵니다. 체를 통해 조직 + 콜라겐 분해 효소 용액의 부피와 동일한 FBS의 부피를 원뿔형으로 첨가하여 콜라겐 분해 효소를 중화합니다.
    알림: 여과 후 체에 소량의 조직이 남아 있습니다.

5. 티슈 세척

참고: 멸균 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 완료하십시오.

  1. 각 조건에 대해 10mL의 따뜻한 배양 배지가 있는 1 x 15mL 튜브를 준비합니다.
  2. 표 1에 지정된 온도에서 300 x g에서 4.6 단계의 튜브를 3분 동안 회전시킵니다.
    참고: 원심분리를 위한 온도는 지방 조직이 분리된 마우스의 성별에 따라 수정되어야 합니다. 이러한 온도는 표 1에 나와 있습니다.
  3. 회전 후 조직이 4개의 층으로 분리되는지 확인합니다(그림 3A).
    참고: 최상층은 유리 지질, 두 번째 층은 성숙한 지방 세포층, 세 번째 층은 콜라겐분해효소 및 FBS이며, 네 번째 층은 바닥20,21로 펠릿화되는 기질 혈관 분율(SVF)입니다.
  4. 200μL 피펫으로 유리 지질의 최상층을 조심스럽게 폐기합니다.
  5. 상층을 제거한 후 하단이 절단된 p1000 피펫을 사용하여 성숙한 지방세포를 10mL의 성장 배지가 있는 준비된 15mL 튜브로 이동합니다(그림 3B).
    1. 선택 사항: 1차 지방세포 전구세포(APC)를 분리하려면 300 x g 에서 10분 동안 튜브를 다시 회전시킵니다. 그런 다음 Liu et al.22, Cho et al.23 또는 이와 유사한 것에 의한 adipocyte 전구 세포 분리를 진행합니다.
  6. 흰색 층이 배지 전체에 분산될 때까지 성숙한 지방 세포가 있는 15mL 튜브를 3-5회 부드럽게 뒤집습니다.
  7. 튜브를 표 10에 표시된 온도에서 10분 동안 똑바로 세워 두어 지방 세포와 배지 층을 분리할 수 있도록 합니다.
  8. 10분 휴식 후 실온에서 1분 동안 100 x g 으로 튜브를 회전시켜 층 분리를 더욱 촉진합니다. 스핀 후 샘플은 그림 3A와 같이 4개의 층으로 다시 분리됩니다.
  9. 피펫으로 유리 지질의 최상층을 제거하고 폐기합니다.
  10. 5mL 주사기에 부착된 21G 바늘을 사용하여 바늘 바닥에서 성숙한 지방 세포층이 제거될 때까지 바늘을 튜브 가장자리 아래로 밀어 넣습니다(그림 3C). 바늘의 상단과 주사기의 하단이 성숙한 지방 세포층을 방해하지 않는지 확인하십시오.
  11. 주사기를 천천히 위로 당겨 배양 배지와 세포 파편을 제거합니다.
    알림: 매체가 제거되면 바늘 끝에 성숙한 지방 세포층이 없는지 확인하십시오.
  12. 각 튜브에 10mL의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.
  13. 5.6-5.11단계를 반복합니다. 배양 배지를 더 추가하지 마십시오.
  14. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 피펫 팁을 튜브 가장자리 아래로 밀어 성숙한 지방 세포층 아래에서 나머지 배지를 제거합니다.

6. 포장

  1. 표 1에 표시된 온도에서 1분 동안 100 x g의 원심분리 셀. 피펫을 사용하여 유리 지질(세포 상단의 투명한 기름층)을 제거합니다. 겔 로딩 팁을 사용하여 지방 세포 아래의 배양 배지를 제거합니다. 지방세포층의 파괴를 최소화하도록 주의하십시오(그림 4).
  2. 모든 배양 배지와 유리 지질이 제거될 때까지 6.1단계를 반복합니다(일반적으로 3-5회). cell pack은 세포 위에 눈에 보이는 유리 지질 또는 세포 아래에 있는 배지가 없는 흰색이어야 합니다(그림 4).

7. 도금 및 기능 분석

  1. 세포 배양을 위한 성숙한 지방세포 도금
    1. 조직 배양 처리된 24웰 플레이트에서 세포 배양 삽입물을 제거하고 멤브레인 면이 위로 향하게 하여 후드 표면에 놓습니다.
    2. 플레이트의 교대 웰에 1mL의 따뜻한 배양 배지를 채웁니다.
    3. 절단된 p200 피펫 팁을 사용하여 6.2단계에서 충전된 성숙한 지방 세포 30μL를 트랜스웰 삽입물 상단에 놓습니다(그림 5A, B).
    4. 트랜스웰 인서트를 조심스럽게 집어 뒤집어 24웰 플레이트에 미리 채워진 웰에 넣습니다(그림 5A). 플레이트를 37% CO5로 설정된 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다.
      참고: 적절하게 포장된 지방세포는 위에서 볼 때 눈에 띄는 투명한 유리 지질 방울이 없는 불투명한 층을 형성해야 합니다(그림 5C).
    5. 최대 14일 동안 2-7일마다 성숙한 지방세포의 배지를 교체하십시오.
      1. 웰에서 매체를 제거하려면 트랜스웰을 제자리에 잡고 p200 피펫을 사용하여 트랜스웰 인서트 측면의 작은 구멍을 통해 매체를 조심스럽게 제거합니다(그림 5D).
      2. 매체가 제거되면 트랜스웰을 제자리에 고정한 상태에서 1mL의 배지를 웰의 측벽에 매우 천천히 추가합니다.
        참고: 미디어를 매우 천천히 추가 및 제거하도록 주의하십시오. 지방세포는 배지가 빠르게 변경되면 멤브레인에서 쉽게 분리될 수 있습니다.
  2. 지방 분해 분석
    1. 3.4단계에서 설명한 대로 판지방조직 외식술을 하거나 7.1단계에서 설명한 대로 성숙한 지방세포를 이식합니다.
      참고: 세포 또는 조직은 지방 분해 분석을 수행하기 전에 최소 24시간 동안 페놀 레드가 없는 배지에서 배양해야 합니다.
    2. 용액 준비: 5g의 BSA를 100mL의 DMEM에 용해시켜 DMEM(페놀 레드 없음)에 5% BSA 용액을 준비합니다. BSA가 완전히 용해될 때까지 부드럽게 뒤집어 결합하십시오.
      1. 제어 및 자극 매체를 위한 작업 솔루션을 준비합니다. 제어 매체의 경우, 5% BSA DMEM 매체를 차량과 결합하십시오. 자극 매체의 경우, 5% BSA DMEM 배지를 5 μM의 CL-316,243과 결합하십시오. 사용하기 전에 제어 및 자극 매체를 37°C로 가열하십시오.
    3. 웰에서 매체를 제거하고 1mL의 따뜻한 DPBS로 세척합니다. control-control 또는 stimulation media의 well당 500μL를 well에 채웁니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양하십시오.
    4. 지방 분해 분석을 시작한 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간에 각 웰에서 100μL의 배지를 마이크로 원심분리 튜브로 수집하고 100μL의 적절한 제어 또는 자극 배지로 교체합니다.
      참고: 이 시점에서 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
    5. 시판되는 무료 글리세롤 키트( 재료 표 참조) 또는 이와 유사한 것을 사용하여 글리세롤 비색 분석을 실행합니다.
      1. 키트의 지시에 따라 시약을 준비합니다.
      2. 샘플을 해동하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
      3. 글리세롤 표준물질 용액을 사용하여 7점, 2배 연속 희석으로 표준 곡선을 준비합니다.
      4. 25μL의 시료 또는 표준물질을 투명한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
      5. 100μL의 유리 글리세롤 분석 시약을 시료 또는 표준물질을 포함하는 각 웰에 추가합니다.
      6. 실온에서 15분 동안 배양한 다음 540nm에서 흡광도를 읽습니다(그림 6A-D).
  3. 이미징
    1. 이미징 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 준비하려면 각 이미징 스페이서에서 뒷면 종이 층을 제거하고 슬라이드에 놓습니다. 두 개의 이미징 스페이서를 각 슬라이드에 나란히 배치할 수 있습니다.
    2. 절단된 200μL 피펫 팁을 사용하여 6.2단계에서 충전된 지방 세포 30μL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    3. 염색 혼합물을 준비합니다. PBS에서 5 μg/mL에서 원형질막 염색 용액 샘플당 200 μL를 준비하고 4.5 μg/mL에서 Hoechst를 준비합니다. 샘플에 스테인 믹스를 넣고 부드럽게 흔듭니다.
    4. 실온에서 30분 동안 샘플을 염색합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
    5. 염색이 완료된 후 샘플을 세척합니다. 각 샘플에 500μL PBS를 추가하고 부드럽게 흔들어 결합합니다. 5분 동안 그대로 두십시오. 100 x g 에서 1분 동안 회전한 다음 젤 로딩 피펫 팁으로 세포 아래의 배지를 제거합니다.
    6. 슬라이드를 준비합니다. 이미징 스페이서의 윗면에 있는 투명 플라스틱 필름을 제거하여 끈적한 층을 노출시킵니다.
    7. 염색된 지방세포의 튜브에 PBS 500μL를 넣고 부드럽게 섞습니다.
    8. 성숙한 지방세포가 표면으로 올라올 시간을 허용하지 않도록 빠르게 절단된 p200 피펫 팁을 사용하여 이미징 슬라이드의 스페이서 내에 35μL의 지방세포를 배치합니다.
    9. 스페이서에 커버 슬립을 놓습니다.
    10. 즉시 이미징을 진행합니다(그림 6C). 이미징이 지연되면 멤브레인 마커의 출혈이 발생할 수 있습니다.

결과

그림 2에서 볼 수 있듯이 적절한 다지기(그림 2B)와 소화(그림 2C)는 온전한 성숙 지방세포를 분리하는 데 중요합니다. 다지기가 부족하고 소화가 부족하면 결합 조직과의 부적절한 분리로 인해 성숙한 지방 세포의 수율이 낮아질 수 있습니다. 육안적으로, 이것은 다진 후 남아 있는 끈적끈적한 조직과 콜라겐분해효소 용액에 눈에 보이는 덩어리로 관찰할 수 있습니다. 또한 과도하게 다지고 과도하게 소화되면 성숙한 지방 세포가 터져 수율이 낮아집니다. 시각적으로 이것은 백색 불투명 층의 손실과 크고 투명한 유리 지질 층의 축적을 초래합니다. 부적절한 수준의 다지기나 소화는 지방 세포를 제대로 분리하지 못하게 합니다.

지방 조직의 적절한 준비와 소화는 그림 3에서 볼 수 있듯이 조직을 4개의 별개의 층으로 분리하는 결과를 낳습니다. 유리 지질의 방출을 초래하는 지방 세포의 일부 파열은 불가피합니다. 그러나 적절한 다지기와 소화는 지방 세포 파열을 최소화합니다. 남아 있는 유리 지질층과 배지는 지방 세포를 패킹하는 동안 제거됩니다(그림 4). 지방세포의 적절한 패킹은 성숙한 지방세포의 효율적인 분리에 필수적입니다. 남아 있는 유리 지질 또는 배지는 분리 불량을 초래하고 도금, 지방 분해 및 세포 이미징과 같은 다운스트림 기능 분석에 부정적인 영향을 미칩니다.

이 프로토콜은 성숙한 지방 세포의 깨끗한 준비를 생성합니다. 세포 이미징 및 지방 분해 분석을 수행하여 세포 기능을 평가하고 성숙한 지방 세포가 분리 후 및 최대 2주 동안 배양 후에도 기능을 유지한다는 것을 입증할 수 있습니다. 지방 분해 분석법은 성숙한 지방 세포가 β-3 아드레날린 수용체의 자극 시 유리 글리세롤의 방출을 통해 세포 신호에 반응하는 능력을 유지한다는 것을 나타냅니다(그림 6A, B). 이 능력은 배양에서 2주 후에도 유지되며 24시간 동안 배양된 지방 조직 외식의 지방 분해 활성과 매우 유사합니다(그림 6C, D). 품질이 좋지 않은 지방세포는 약독화된 지방분해를 보여줍니다. 분리된 지방세포의 세포 이미징은 하나의 큰 지질 방울을 포함하는 둥글고 손상되지 않은 단안구 성숙한 지방세포를 보여줍니다. 품질이 좋지 않은 지방세포 분리는 주로 지방 세포 파열을 나타내는 큰 세포 외 기름 방울을 보여줍니다.

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그림 1: 지방 조직 이식의 포매 . (A) 조직을 포매팅하기 전에 부분적으로 응고된 기저막 매트릭스 돔의 이미지. (B) 부적절하거나 적절한 조직 포매의 대표 이미지. 부적절한 포매는 조직이 돔 위에 부분적으로 또는 완전히 떠 있는 것처럼 보이기 때문에 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 지방 조직의 적절한 다진 및 소화 스키마. (A) 조직 다진 및 소화 단계의 개략도 4.2-4.6. (B) 부족 조직, 최적 조직 및 과도하게 다진 조직의 대표 이미지. 덜 다진 조직에는 원래 모양을 유지하는 큰 덩어리가 있습니다. 과도하게 다진 조직은 조직을 둘러싼 유리 지질이 눈에 띄게 증가하여 투명하고 기름진 것처럼 보입니다. (C) 과소 소화된 조직, 최적 조직 및 과소화된 조직의 대표 이미지. 소화가 덜 된 조직에는 용액에 남아 있는 전체 조직 덩어리가 포함되어 있습니다. 과도하게 소화된 조직은 용액에서 빠르게 분리되는 큰 유리 지질층을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 소화된 지방 조직의 층 분리. (A) 5.3단계에 따라 존재하는 레이어의 개략적이고 대표적인 이미지. (B) 절단된 피펫 팁을 사용하여 50mL 원추형 튜브에서 성숙한 지방 세포층을 제거합니다. (C) 성숙한 지방세포층 아래에서 배양 배지를 제거하기 위한 바늘과 주사기의 적절한 기술과 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 성숙한 지방세포의 순차적 패킹. 성숙한 지방세포를 포장하는 순차적 이미지. 유리 지질, 지방 세포 및 배지의 층이 표시되어 있습니다. 각 스핀 후에 유리 지질과 배지가 제거됩니다. 이것은 스핀 후 배지 또는 유리 지질이 지방 세포에서 분리되지 않을 때까지 반복됩니다. 최종 이미지는 잘 채워진 성숙한 지방 세포를 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 성숙한 지방세포의 도금 및 배양. (A) 성숙한 지방세포의 도금도. 절단된 p200 피펫 팁을 사용하여 패킹된 지방 세포를 세포 배양 삽입체의 멤브레인에 놓습니다. 그런 다음 인서트를 미리 채워진 배양 배지 웰로 반전시킵니다. (B) 트랜스웰 인서트에 지방세포를 증착하는 절단 피펫 팁을 묘사한 도금 성숙 지방세포의 대표적인 이미지. (C) 웰 위에서 본 바와 같이 트랜스웰로 도금된 적절하게 충전된 지방세포와 제대로 충전되지 않은 지방세포의 개략도 및 대표 이미지. 적절하게 채워진 지방세포는 하얗고 불투명하게 보이는 반면, 제대로 채워지지 않은 지방세포는 투명한 지질 방울을 형성합니다. (D) 배양 배지를 변경하는 데 사용되는 기술의 개략도. p200 피펫 팁은 트랜스웰 인서트의 측벽에 있는 구멍을 통해 매체를 조심스럽게 제거하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 성숙한 지방세포의 이미징 및 지방분해 분석. (A,B) 피하(A) 및 내장(B) 성숙한 지방 세포에서 글리세롤 방출. 지방세포는 정상적인 차우 식단을 먹인 16주 된 C57BL/6 수컷 마우스에서 분리되었습니다. 30 μL의 지방 세포를 단계 7.1에 기재된 바와 같이 도말하고, 1일 또는 10일 동안 배양하였다. 지방세포는 1시간, 2시간, 4시간 동안 5μM의 CL-316,243으로 처리하고, 상등액을 채취하여 유리 글리세롤을 분석하였다. (씨,디) 피하(C) 및 내장(D) 지방 조직 이식에서 글리세롤 방출. 지방 조직은 정상적인 차우 식단을 먹인 18주 된 C57BL/6 암컷 쥐에서 분리되었습니다. 0.1g의 지방 조직 외식을 3.1-3.4 단계에 기재된 바와 같이 도금하고 24시간 동안 배양하였다. 지방세포는 1시간, 2시간, 4시간 동안 5μM의 CL-316,243으로 처리하고, 상등액을 채취하여 유리 글리세롤을 분석하였다. N = A-D에 대한 3번의 기술적 반복실험. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차입니다. (E) 분리된 피하 및 내장 성숙 지방 세포의 대표 이미지. 지방세포는 정상적인 차우 식단을 먹인 16주 된 C57BL/6J 수컷 마우스에서 분리되었습니다. 지방세포는 원형질막 염색(빨간색) 및 Hoechst 핵 염색(파란색)으로 염색했습니다. 눈금 막대 : 50 μm; 배율: 60배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

성다이어트창고민싱 난이도콜라겐 분해 효소 : 조직 비율권장 소화 시간(분)스핀 온도.세탁 온도.
여성일반 차우피하의힘들다2:112RT (RT)37 기음
내장보통1:18RT (RT)37 기음
고지방 다이어트피하의쉬운1:18RT (RT)37 기음
내장쉬운1:18RT (RT)37 기음
남성일반 차우피하의힘들다2:1144 기음RT (RT)
내장보통1:1104 기음RT (RT)
고지방 다이어트피하의쉬운1:1104 기음RT (RT)
내장쉬운1:1104 기음RT (RT)

표 1: 성별, 디포 및 다이어트에 따른 수정. 각 조직의 다진 난이도는 다른 저장소와 관련하여 "쉬움", "중간" 또는 "어려움"으로 설명됩니다. 실제 다진 시간은 연구자와 조직에 따라 다릅니다. 콜라겐 분해 효소 : 조직 중량 (g)에 대해 4.1 단계에서 제조 된 콜라겐 분해 효소 + DNase 용액의 부피 (mL)로 나열된 조직 비율. 소화 시간은 대략적인 추정치이지만 실제 소화 시간은 다진 것과 조직에 따라 다릅니다. 연구자는 프로토콜에 설명된 대로 소화를 평가해야 합니다. 스핀 온도와 세척 온도는 수컷 마우스와 암컷 마우스마다 다릅니다. RT는 실내 온도를 나타냅니다.

토론

1차 지방세포는 쉽게 파열되기 때문에 분리 및 배양이 어려운 것으로 악명이 높으며, 크기가 커서 유세포 분석과 같은 일반적인 1차 세포 분리 도구를 사용할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 깨끗하고 기능적인 성숙한 지방 세포를 생성합니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 다른 세포 파편과 유리 지질층에서 성숙한 지방 세포를 분리할 수 있어 효과적인 이미징, 배양 및 지방 분해 분석이 가능하다는 것입니다. 이 프로토콜은 기질 혈관 분획 및 APC의 분리를 위해 발표된 프로토콜22,23과 쉽게 결합할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 지방 조직에서 전체 조직 외식의 준비 및 배양 절차를 자세히 설명하며, 이는 지방 분해 분석 및 전체 지방 조직에서 분비된 인자 수집과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

중요한 측면에는 적절한 다지기, 소화 및 유리 지질층 제거가 포함됩니다. 적절한 다지기를 위해서는 공정 전반에 걸쳐 조직의 시각적 모양을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 최적의 조직 다진 고기를 달성하는 데 필요한 시간과 노력은 지방 조직 저장소, 식이 중재(예: 고지방 식단) 및 연구자에 따라 다릅니다. 필요한 경우 가위와 같은 다지기를 위한 다른 도구를 통합할 수 있지만 여기서는 이에 대해 설명하지 않았습니다. 주목할 점은, 과도한 다지기는 지방 세포를 파열시킬 수 있으므로 피해야 하며, 이는 즉각적인 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 유리 지질층이 나머지 지방 세포에 미치는 해로운 영향으로 인해 총 수율과 지방 세포의 품질을 저하시킵니다. 적절한 다진 고기와 유사한 적절한 소화는 지방 조직 저장소, 식이 중재, 생쥐의 나이 등에 따라 달라집니다. 콜라겐분해효소에 DNase를 추가하면 소화 과정에서 세포 파편으로 인해 발생할 수 있는 지방세포의 응집을 방지하는 데 도움이 됩니다. 따라서 조직의 소화 시간은 매우 다양합니다. 제공된 소화 시간 추정치는 표 1 에서 찾을 수 있는 가이드 역할을 합니다.그러나 조직이 적절하게 소화되었는지 확인하는 가장 좋은 방법은 프로세스 전반에 걸쳐 프로토콜에 설명된 대로 조직을 육안으로 검사하는 것입니다. 성별에 따라 제안된 표 1에 자세히 설명된 다양한 원심분리 및 세척 온도는 유리 지질층과 다른 세포 파편 및 SVF 모두에서 성숙한 지방 세포를 적절하게 분리하는 데 필수적입니다. 다른 온도를 사용하면 응집 및 지방 세포 파열로 인해 성숙한 지방 세포가 손실될 수 있습니다.

모든 단계에서 유리 지질층을 제거하는 것이 매우 중요하며, 그렇게 하지 않으면 도금, 이미징 및 지방 분해 분석에 대한 다운스트림 합병증이 발생합니다. 또한, 시술 전반에 걸쳐 유리 지질층이 지속적으로 존재하면 지독성으로 인해 추가적인 지방 세포 사멸을 초래하여 전반적인 수율과 품질에 큰 영향을 미칩니다. 일반적으로 성숙한 지방세포 분리의 효율성을 극대화하는 것이 바람직하지만, 일부 성숙한 지방세포를 희생하더라도 유리 지질층을 제거하면 프로토콜이 끝날 때 성숙한 지방세포 수율이 전반적으로 증가합니다.

절차의 한계에는 샘플 수가 포함됩니다. 배지와 유리 지질층을 제거하는 데 소요되는 엄격함과 시간으로 인해 절차는 일반적으로 한 번에 6개의 샘플로 제한됩니다. 훨씬 더 많은 샘플을 처리하면 1차 지방 세포가 유리 지질에 너무 오랫동안 노출되어 전체 수율이 감소하게 됩니다. 그러나 추가 인력으로 인해 샘플 수가 증가할 수 있습니다. mincing에서 functional assay까지의 시간은 배지 및 유리 지질층 제거의 과도한 지연으로 인해 추가적인 성숙한 지방 세포 파열을 초래하기 때문에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 성숙한 지방세포의 하위 집단을 분리하는 능력에 있어 더욱 제한적입니다.

성숙한 지방세포를 연구하는 현재의 방법은 주로 APC의 분리와 이러한 세포의 후속 체외 분화에 의존합니다. 장기 칩 모델(organ-on-a-chip) 모델 및 트랜스 웰 공동 배양을 포함한 추가 방법이 개발되기 시작했습니다18,24. 그러나, 이러한 생체 외 분화된 지방세포(ex vivo differentiated adipocyte)는 지방 조직의 성숙한 지방세포(mature adipocyte)와 전사적으로나 형태학적으로 구별되는 것으로 나타났다17. 형태학적으로, 생체 외 분화된 지방 세포는 다위치인 반면, 생체 내 분리 지방 세포는 단위치입니다. 이 프로토콜은 적어도 5g의 지방 조직을 필요로 하는 다른 프로토콜에 비해 0.5g의 지방 조직으로부터 성숙한 지방 세포를 성공적으로 분리 및 배양하기 위해 이전 보고서(17,25)로부터 수정 및 최적화되었다25. 마지막으로, 이 연구는 구체적인 시간, 원심분리 온도 및 콜라겐분해효소 양 대신 프로토콜의 주요 단계가 성공적으로 완료되었음을 시각적으로 설명하는 것을 목표로 했지만 지침은 표 1에 포함되어 있습니다. 이러한 매개변수는 지방 조직 저장소, 성별 및 동물의 비만도와 같은 요인에 따라 조정해야 하며, 이 모든 것은 이 프로토콜에서 성숙한 지방 세포의 소화 및 깨끗한 분리의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.

전체적으로 이 절차는 풀링된 마우스의 수와 개별 지방 조직 샘플의 수에 따라 3-4시간이 소요됩니다. 성숙한 지방세포의 기능적 역할을 배양하고 평가할 수 있는 능력은 지방세포 생물학 자체(예: 대사, 영양소 활용 및 추적) 및 지방세포와 APC, 암세포 및 면역 체계 세포와 같은 다른 세포 유형과 상호 작용 연구를 위한 많은 다운스트림 응용 프로그램을 가능하게 할 것으로 예상됩니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

저자는 5 For The Fight와 Huntsman Cancer Institute(KIH), V Foundation for Cancer Research(KIH) 및 DK133455(KIH)의 보조금 지원에 감사를 표합니다. Biorender로 만든 프로토콜의 회로도. 또한, 저자들은 이미징에 도움을 준 유타 대학교의 Stephanie Giagnocavo와 Cell Imaging Core, 그리고 원고에 대한 피드백을 준 Mark Lee에게 감사의 뜻을 전합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100x Poloxamer 188 용액SigmaP5556-100mL
15 mL 원뿔Cellstar188261
21 G 바늘BD305165
5 mL 주사기BD309646
50 mL 원뿔형Cellstar227261
6.5 mm Transwell with 0.4 µ m 기공 폴리카보네이트 멤브레인 인서트Corning3413
소 혈청 알부민(BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask 플라즈마 멤브레인 염색Thermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 디소듐 염Tocris1499
콜라겐 분해 효소 분말시그마C6885
DMEMGibco11995-040
DMEM 페놀 없음 RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
소 태아 혈청 (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientific
젤 로딩 피펫 팁Fisher scientific02-707-181
GlutaMAX 보충제Gibco35050061
글리세롤 분석 키트AbcamAB133130
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R 원심분리기Thermo Scientific 
Hoechst 33342 솔루션Thermo Fisher Scientific62249
인큐베이팅 미니 셰이커VWR12620-942
미디엄 199Sigma-AldrichM4530
현미경 커버 안경VWR16004-302
PBSGibco10010023
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122
SecureSeal 이미징 스페이서Grace Biolabs654006
Seive (SteeL 미세 메쉬 칵테일 여과기)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
형 151884875004271

참고문헌

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